يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تركيز جزيئات الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي باستخدام تلبد الحليب منزوع الدسم والترشيح الفائق

3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65058

⸱

مارس 17, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

في هذه المقالة

ملخص

يعد تركيز الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي مهمة صعبة ، يتم تنفيذها في المقام الأول لتحديد الفيروسات وقياسها. بينما تم تطوير واختبار العديد من طرق تركيز الفيروس ، فإننا نوضح هنا فعالية الترشيح الفائق وتلبد الحليب منزوع الدسم لفيروسات الحمض النووي الريبي بأنواع مختلفة من العينات.

الملخص

وقد برزت الوبائيات القائمة على المياه ومياه الصرف الصحي كطرق بديلة لرصد مسار الفاشيات في المجتمعات المحلية والتنبؤ به. يعد استرداد الكسور الميكروبية ، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا وحقيقيات النوى الدقيقة من عينات مياه الصرف الصحي والمياه البيئية ، إحدى الخطوات الصعبة في هذه الأساليب. في هذه الدراسة ، ركزنا على كفاءة استرداد طرق الترشيح الفائق المتسلسل وتلبد الحليب منزوع الدسم (SMF) باستخدام الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس اختبار ، والذي يستخدم أيضا كعنصر تحكم من قبل بعض الدراسات الأخرى. تم تطبيق الترشيح المسبق باستخدام مرشحات قرصية غشائية 0.45 ميكرومتر و 0.2 ميكرومتر للتخلص من الجسيمات الصلبة قبل الترشيح الفائق لمنع انسداد أجهزة الترشيح الفائق. تم طرد عينات الاختبار ، التي تمت معالجتها بطريقة الترشيح الفائق المتسلسل ، بسرعتين مختلفتين. أدت السرعة المتزايدة إلى انخفاض معدلات الاسترداد والإيجابية للحمض النووي الريبي المدرع. من ناحية أخرى ، أدى SMF إلى معدلات استرداد وإيجابية متسقة نسبيا للحمض النووي الريبي المدرع. أظهرت الاختبارات الإضافية التي أجريت على عينات المياه البيئية فائدة SMF لتركيز الأجزاء الميكروبية الأخرى. قد يكون لتقسيم الفيروسات إلى جزيئات صلبة تأثير على معدلات الاسترداد الإجمالية ، مع الأخذ في الاعتبار خطوة الترشيح المسبق المطبقة قبل الترشيح الفائق لعينات مياه الصرف الصحي. كان أداء SMF مع الترشيح المسبق أفضل عند تطبيقه على عينات المياه البيئية بسبب انخفاض تركيزات المواد الصلبة في العينات وبالتالي انخفاض معدلات التقسيم إلى المواد الصلبة. في الدراسة الحالية ، نشأت فكرة استخدام طريقة الترشيح الفائق المتسلسل من ضرورة تقليل الحجم النهائي للمركزات الفيروسية أثناء جائحة COVID-19 ، عندما كان المعروض من أجهزة الترشيح الفائق شائعة الاستخدام محدودا ، وكانت هناك حاجة لتطوير طرق تركيز فيروسية بديلة.

المقدمة

يعد تحديد التركيز الفعال للكائنات الحية الدقيقة في عينات المياه السطحية ومياه الصرف الصحي لتحليل المجتمع الميكروبي ودراسات علم الأوبئة ، إحدى الخطوات المهمة لرصد مسار الفاشيات في المجتمعات 1,2 والتنبؤ بها. كشفت جائحة COVID-19 عن أهمية تحسين طرق التركيز. ظهر COVID-19 في أواخر عام 2019 ، وحتى مارس 2023 ، لا يزال يشكل تهديدا لصحة الإنسان والحياة الاجتماعية والاقتصاد. أصبحت استراتيجيات الترصد والمكافحة الفعالة للتخفيف من آثار تفشي COVID-19 في المجتمعات موضوعا بحثيا مهما ، حيث ظهرت موجات ومتغيرات جديدة من COVID-19 بالإضافة إلى الانتقال السريع للفيروس وانتشاره ، وكذلك الحالات التي لا تظهر عليها أعراض والتي لم يتم الإبلاغ عنها وغير المشخصة3،4،5. كان استخدام علم الأوبئة القائم على مياه الصرف الصحي ل COVID-19 من قبل منظمات المجتمع المدني والوكالات الحكومية والمرافق العامة أو الخاصة مفيدا في توفير المعلومات السريعة المتعلقة بالتفشي والتخفيف من آثار تفشي COVID-196،7،8،9. ومع ذلك ، فإن تركيز SARS-CoV-2 ، وهو فيروس RNA مغلف ، في عينات مياه الصرف الصحي لا يزال يشكل تحديات10. على سبيل المثال ، يتمثل أحد هذه التحديات في تقسيم SARS-CoV-2 في المواد الصلبة لمياه الصرف الصحي ، مما قد يؤثر على الاسترداد عندما يتم التخلص من المواد الصلبة أثناء التركيز11. وإذا كان هذا هو الحال، ينبغي أن يكون تركيز القياس الكمي/التقييم على كل من المراحل الصلبة والمائية لعينات المياه البيئية، بدلا من المرحلة المائية فقط. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل اختيار طريقة التركيز بناء على الاختبارات والتحليلات النهائية. أصبح تركيز جزيئات الفيروس ومسببات الأمراض من العينات البيئية موضوعا بحثيا عاجلا مع التطورات في مجالات التسلسل والميكروبيوم.

تم تطبيق طرق تركيز الفيروسات المختلفة في مجال تركيز الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي. بعض الطرق الشائعة الاستخدام هي الترشيح ، تلبد الحليب منزوع الدسم (SMF) ، الامتزاز / الشطف ، وترسيب البولي إيثيلين جلايكول12-17. من بينها ، تم اعتبار SMF طريقة رخيصة وفعالة ، وتم اختبارها بنجاح ، وتطبيقها لاستعادة الفيروسات ، بما في ذلك SARS-CoV-2 ، من مياه الصرف الصحي والمياه السطحية12،15،16،18. يعد إجراء SMF نهجا جديدا نسبيا اكتسب اعترافا متزايدا بين العديد من الدراسات البيئية كمنهجية مناسبة لاستعادة مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة في وقت واحد مثل الفيروسات والبكتيريا والأوليات من جميع أنواع عينات المياه ، وهي الحمأة ومياه الصرف الصحي الخام ومياه الصرف الصحي وعينات النفايات السائلة19. عند مقارنتها بالمنهجيات الأخرى المعروفة لاستعادة الفيروسات من العينات البيئية مثل الترشيح الفائق وشطف الجلايسين القلوي ، أو النهج القائم على التجفيد ، أو الطرد المركزي الفائق وشطف الجلايسين القلوي ، تم الإبلاغ عن SMF باعتبارها الطريقة الأكثر فعالية مع ارتفاع معدلات التعافي والكشف الفيروسي18,20. في هذه الدراسة ، استخدمنا الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس اختبار لتقييم كفاءة استرداد طرق تركيز الفيروس ، بما في ذلك اختبارات تقييم استرداد SARS-CoV-221,22.

هنا ، اختبرنا عينات مياه الصرف الصحي والمياه البيئية لإثبات فائدة SMF وطريقة الترشيح الفائق المتسلسل لتركيز الكسور الميكروبية لتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) ، والميتاجينوميات القائمة على التسلسل ، وتسلسل الأمبليكون العميق. SMF هي طريقة أرخص نسبيا ومثالية لحجم أكبر من العينات مقارنة بطرق الترشيح الفائق. نشأت فكرة استخدام طريقة الترشيح الفائق المتسلسل من ضرورة تقليل الحجم النهائي للمركزات الفيروسية أثناء جائحة COVID-19 ، عندما كان المعروض من أجهزة الترشيح الفائق شائعة الاستخدام محدودا ، وكانت هناك حاجة لتطوير طرق تركيز فيروسية بديلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. مقارنة الترشيح الفائق التسلسلي وتلبد الحليب منزوع الدسم لتركيز الفيروسات في عينات مياه الصرف الصحي

  1. إعداد العينة
    1. اجمع 2 لتر من عينات مياه الصرف الصحي المركبة (المؤثرة) المتناسبة مع التدفق لمدة 24 ساعة. تم جمع عينات من محطات معالجة مياه الصرف الصحي الرئيسية الثلاث (WWTPs) في وينيبيغ ، كندا ، خلال صيف وخريف عام 2020 (الجدول 1).
    2. نقل العينات إلى المختبر في زجاجات واقية من الضوء في صندوق ثلج ومعالجتها في غضون 24 ساعة. جمع بيانات الخصائص الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية لمياه الصرف الصحي.
  2. فحوصات تركيز الفيروس
    ملاحظة: تم تطبيق طريقة الترشيح الفائق المتسلسل وطريقة التلبد العضوي ، وهي تلبد الحليب منزوع الدسم (SMF) ، لتقييم كفاءة الاسترداد الكلية لكل طريقة باستخدام الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس اختبار23. كما استخدم باحثون آخرون الحمض النووي الريبي المدرع كفيروس تحكم لتقييم استعادة طرق التركيز للفيروسات المغلفة ، مثل العائلة. Coronaviridae22,24,25,26.
    1. لإضافة الحمض النووي الريبي المدرع ، اضبط أحجام اختبار مياه الصرف الصحي لطرق الترشيح الفائق و SMF على 140 مل و 500 مل على التوالي. باستخدام الماصة ، قم برفع 5 × 104 نسخ من الحمض النووي الريبي المدرع إلى ست عينات من مياه الصرف الصحي العذبة تم جمعها في تاريخ واحد وست عينات من مياه الصرف الصحي العذبة في تاريخ آخر ، لكل طريقة ترشيح فائق ؛ علاوة على ذلك ، تم تخزين ستة عينات من مياه الصرف الصحي (عند 4 درجات مئوية) في تاريخ ثالث لاحق ومعالجتها بعد أيام من أجل SMF.
      ملاحظة: تألفت كل مجموعة من مجموعات العينات الست التي تم جمعها في تواريخ مختلفة من عينتين من كل من محطات معالجة محطات معالجة المياه الثلاثة. في دراستنا ، تم جمع المجموعة الأولى من عينات مياه الصرف الصحي العذبة في 8 يوليو 2020 ، والثانية في 30 سبتمبر 2020 ، وعينات مياه الصرف الصحي التي سيتم تخزينها ل SMF في 14 أكتوبر 2020.
    2. يقلب لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتلقيح وتجانس الحمض النووي الريبي المدرع في العينات باستخدام محرك مغناطيسي.
    3. قم بإزالة جميع الجسيمات أو الخلايا التي يزيد حجمها عن 0.2 ميكرومتر وقم بإجراء الترشيح الفائق.
      1. قم بتصفية عينات مياه الصرف الصحي المسننة (120 مل من كل عينة مسننة سعة 140 مل) من خلال القماش القطني والربط منخفض البروتين ، 0.45 ميكرومتر و 0.2 ميكرومتر ، مرشحات القرص الغشائي 47 مم ، على التوالي ، لإزالة الجسيمات الكبيرة والرواسب وحقيقيات النوى والبكتيريا27. قم بمعالجة العينات التي تمت تصفيتها باستخدام طرق الترشيح الفائق الموضحة أدناه.
        ملاحظة: تم استخدام عينات مياه الصرف الصحيالتي تم جمعها في 8 يوليو و 30 سبتمبر لطرق الترشيح الفائق مع 3000 ×جم و 7500 × جم على التوالي.
      2. للترشيح الفائق المتسلسل عند 3000 × جم (UF-3k x g) ، ركز ما مجموعه 120 مل من عينة الاختبار التي تم جمعها في التاريخ الأول عند 3000 × جم لمدة 30 دقيقة عن طريق تحميل 60 مل من العينة مرتين إلى حوالي 5 مل باستخدام جهاز طرد مركزي من العلامة التجارية A ، 30 كيلو دالتون. بعد ذلك ، ركز على حجم 5 مل عند 3,000 × جم لمدة 30 دقيقة باستخدام جهاز طرد مركزي من العلامة التجارية B ، 30-kDa ، إلى 500-1,200 μL.
      3. بالنسبة للترشيح الفائق المتسلسل عند 7,500 × جم (UF-7.5k x g) ، قم بتغيير سرعة الطرد المركزي لجهاز الطرد المركزي للعلامة التجارية B من 3,000 × g إلى 7,500 x g للحصول على أحجام نهائية أصغر ، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة ، والحفاظ على سرعة الطرد المركزي لجهاز الطرد المركزي للعلامة التجارية A كما هي.
        ملاحظة: تم إجراء الاختبارات مع العينات التي تم جمعها في 30سبتمبر.
    4. بالنسبة إلى SMF ، قم بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه.
    5. قم برفع عينات مياه الصرف الصحي (500 مل لكل منها) للتركيز مباشرة باستخدام بروتوكول SMF16,18 ، دون الترشيح المسبق باستخدام القماش القطني ومرشحات قرص غشاء الربط منخفض البروتين ، كما هو موضح أدناه.
    6. قم بإذابة 0.5 جم من مسحوق الحليب منزوع الدسم في 50 مل من مياه البحر الاصطناعية للحصول على محلول حليب منزوع الدسم بنسبة 1٪ (وزن / حجم) واضبط درجة حموضة المحلول بعناية على 3.5 باستخدام 1 N HCl.
      ملاحظة: التحمض يجعل الفيروسات تتجمع وتترسب خارج الماء بسبب التغير في نقطة تساوي الكهرباء16 ويحسن قابلية ذوبان مسحوق الحليب28.
    7. أضف 5 مل من محلول الحليب منزوع الدسم إلى 500 مل من عينات مياه الصرف الصحي الخام للحصول على تركيز نهائي من الحليب منزوع الدسم بنسبة 0.01٪ (وزن / حجم).
    8. حرك العينات لمدة 8 ساعات بسرعة متوسطة واترك الكتل المشكلة تستقر لمدة 8 ساعات أخرى في درجة حرارة الغرفة.
    9. قم بإزالة المواد الطافية بعناية باستخدام الماصات المصلية دون إزعاج الكتل المستقرة. نقل حجم نهائي قدره 50 مل يحتوي على الكتل إلى أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 8 درجات مئوية.
    10. تخلص من الكريات بعناية باستخدام ملعقة معقمة, وأعد تعليق الكريات المتبقية في الأنابيب في 250 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 0.2 M (درجة الحموضة 7.5) بعد إزالة المادة الطافية. انقل الكريات المكشطة والمعاد تعليقها إلى نفس أنابيب الطرد المركزي الصغيرة سعة 1.5 مل.
  3. إجراء استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من المركزات الفيروسية لعينات مياه الصرف الصحي ومقايسات كفاءة الاسترداد باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي بنسبة 25: 24: 1 من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل و β-ميركابتوإيثانول ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، لتحسين كفاءة الاستخراج. أخيرا ، قم بإزالة الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر من محلول الشفط.
  4. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)
    1. قم بقياس الحمض النووي الريبي المدرع باستخدام تخفيفات عشرة أضعاف (7.8 × 104 إلى 7.8 نسخ جينية) من الحمض النووي الاصطناعي أحادي الشريط أو بناء gBlock. انظر الجدول 2 للاطلاع على البادئات ومجموعات المسبار التي تكتشف وتحدد كمية الحمض النووي الريبي المدرع.
    2. صمم مجموعات التمهيدي والمسبار باستخدام أداة تصميم التمهيدي29 واستهدف منطقة 95 نقطة أساس (بناء gBlock) داخل جينوم الحمض النووي الريبي المدرع.
    3. احصل على منحنيات المعايرة لكل تشغيل RT-qPCR. قم بتضمين عناصر تحكم سلبية في كل تشغيل qPCR. قم بتشغيل المعايير والعينات وعناصر التحكم غير القوالب في ثلاث نسخ.
    4. قم بإعداد كل خليط RT-qPCR سعة 10 ميكرولتر بالترتيب التالي: 2.5 ميكرولتر من 4x مزيج رئيسي ، 400 نانومتر لكل برايمر ، مسبار 200 نانومتر ، و 2.5 ميكرولتر من القالب ، بالإضافة إلى ماء مقطر عالي النقاء خال من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي.
    5. قم بإجراء تفاعلات الدورة الحرارية عند 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تليها 45 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية على نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. إذا كان التصوير المقطعي المحوسب <40 ، فاعتبر عينة الحمض النووي الريبي المدرعة إيجابية.
    6. إجراء اختبارات qPCR و RT-qPCR باستخدام ألبومين مصل الأبقار مع عينات مياه الصرف الصحي الخام لتقييم إمكانية وجود مثبطات أو ملوثات مثل الأحماض الدبالية24. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين العينات مع الإنزيم وبدونه.
  5. احسب التركيزات من المنحنى القياسي. احسب النسبة المئوية لكفاءة الاسترداد بقسمة التركيز المستعاد على التركيز المسننة.
  6. تحويل أرقام نسخ الجينات باستخدام الدالة log10 للتحليل. تشغيل نموذج خطي عام باستخدام أداة التحليل الإحصائي على بيانات qPCR. قم بتطبيق اختبار Tukey للكشف عن الاختلافات بين الطرق والعلاجات. خذ قيمة p 0.05 لتكون الحد الأدنى من مستوى الأهمية للاختبار.

2. ترشيح وتركيز فيروسات الحمض النووي والحمض النووي الريبي لعلم الأوبئة المائي

  1. لجمع المياه السطحية البيئية ، اجمع 10 لتر من عينات المياه السطحية البيئية واستخدم 10 لتر من عينات المياه منزوعة الأيونات للتحكم في الخلفية. قم بتخزين جميع العينات في غرفة 4 درجات مئوية حتى تتم معالجتها في غضون 24 ساعة بعد جمع العينات.
  2. قم بإجراء تركيز الفيروسات من العينات البيئية باستخدام SMF باستخدام الخطوات الموضحة أدناه.
    1. قم بإجراء ترشيح الكبسولة والفراغ باستخدام كبسولات أخذ عينات المياه الجوفية عالية السعة ومرشحات قرص الغشاء بأحجام 0.45 ميكرومتر و 0.2 ميكرومتر و 0.1 ميكرومتر لتقليل الضوضاء أثناء التسلسل الميتاجينومي ، من الكسور الأكبر مثل حقيقيات النوى الدقيقة والبكتيريا إلى الأجزاء الأصغر مثل الفيروسات.
    2. قم بإعداد محلول حليب منزوع الدسم مسبق التلبد بنسبة 1٪ من الوزن بالحجم في 1.32 لتر من مياه البحر الاصطناعية مع 13.2 جم من مسحوق الحليب منزوع الدسم. اضبط الرقم الهيدروجيني لهذا التعليق على 3.5 باستخدام 1 N HCl.
  3. اضبط الرقم الهيدروجيني لعينات المياه السطحية البيئية إلى 3.5 باستخدام 1 N HCl.
  4. انقل 100 مل من محلول الحليب منزوع الدسم المحمض قبل التلبد إلى 10 لتر من عينات المياه البيئية المحمضة (درجة الحموضة 3.5) (تركيز الحليب منزوع الدسم النهائي 0.01٪ [وزن / حجم]).
  5. باستخدام محرك مغناطيسي وقضيب تحريك مغناطيسي ، قم بتحريك العينات لمدة 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة واترك الكتل تترسب عن طريق الجاذبية لمدة 8 ساعات إضافية. دون إزعاج الكتل ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام مضخة تفريغ.
  6. قم بقسمة وموازنة الكتل المتبقية وفقا للوزن في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل وقم بتدويرها عند 8000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  7. تخلص من المادة الطافية وقم بإذابة الحبيبات الناتجة (التي تحتوي نظريا على فيروسات ذات أهمية) في 200 ميكرولتر من 0.2 متر عازلة لفوسفات الصوديوم.
  8. عالج الحبيبات المذابة باستخدام DNase I و RNase A ، باتباع تعليمات الشركة الصانعة ، للتخلص من الحمض النووي الحر والحمض النووي الريبي الموجود الذي قد يترسب بشكل مشترك بسبب المجموعة المستخدمة لاستخراج الحمض النووي. قم بإلغاء تنشيط DNase I و RNase A باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  9. استخرج الأحماض النووية الكلية من الحبيبات الذائبة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  10. تحديد الكمية الإجمالية للحمض النووي والحمض النووي الريبي المستخرج من عينات النفايات السائلة باستخدام مقياس الفلور. تعتبر العينات ذات التركيزات >1 نانوغرام / ميكرولتر مثالية لتحديد كمية الحمض النووي وتسلسله.
  11. إجراء تحليل qPCR لاستهداف الفيروسات المعوية ذات الأهمية والتسلسل عالي الإنتاجية لتحديد بنية المجتمع الفيروسي.

3. الترسيب المباشر وتركيز الكسور الميكروبية لعلم الأوبئة المائي

  1. اجمع 2 لتر من عينات المياه من المجاري المائية المحمية والمتأثرة. إذا كانت العينة تحتوي على كمية كبيرة من الحطام ، فاستخدم القماش القطني لإزالتها.
    ملاحظة: يوصى بشدة بجمع نسخة بيولوجية مكررة لكل عينة.
  2. قم بإعداد محلول حليب منزوع الدسم بنسبة 1٪ (وزن / حجم) عن طريق إذابة 4.4 جم من مسحوق الحليب منزوع الدسم في 440 مل من مياه البحر الاصطناعية. اضبط الرقم الهيدروجيني لهذا التعليق على 3.5 مع 1 N HCl.
  3. اضبط الرقم الهيدروجيني لعينات المياه العذبة إلى 3.5 باستخدام 1 N HCl.
  4. أضف 20 مل من محلول الحليب منزوع الدسم إلى عينات المياه العذبة 2 لتر المعدلة مسبقا (تركيز الحليب منزوع الدسم النهائي 0.01٪ [وزن / حجم]). حرك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 ساعات.
  5. اسمح للكتل بالترسبات عن طريق الجاذبية لمدة 8 ساعات أخرى. قم بإزالة المواد الطافية بعناية باستخدام مضخة تمعجية. انقل الكتل المترسبة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتدويرها بسرعة 8000 × جم لمدة 30 دقيقة.
  6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات ب 200 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 0.2 متر. قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية أو تابع تحديد ~ 0.5 جم من الكتل لاستخراج الحمض النووي الميكروبي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي التي تختارها ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  7. تحديد تركيز الحمض النووي DNA ونقاوته باستخدام مقياس فلوري عالي الحساسية. يجب أن تكون العينات ذات التركيزات > 1 نانوغرام / ميكرولتر مثالية لقياس كمية الحمض النووي وتسلسله.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تقييم طرق تركيز الحمض النووي الريبي الفيروسي
كانت جميع العينات الست التي تمت معالجتها باستخدام UF-3k x g إيجابية وأسفرت عن استرداد بنسبة 13.38٪ ± 8.14٪ (الشكل 1). كانت عينة واحدة فقط إيجابية عندما تمت معالجة العينات باستخدام UF-7.5k x g. كانت جميع العينات التي تمت معالجتها باستخدام SMF إيجابية وأدت إلى استرداد 15.27٪ ± 2.65٪ (الشكل 1). كان متوسط معدلات استرداد UF-3K x g و SMF أعلى بشكل ملحوظ ومتسق (p < ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذه الدراسة في التخلص من الجسيمات الصلبة من خلال تطبيق خطوة الترشيح المسبق مع مرشحات غشائية 0.2 ميكرومتر و 0.45 ميكرومتر. بالنظر إلى تقسيم الفيروسات إلى جزيئات صلبة ، وخاصة الفيروسات المغلفة ، يمكن أن يسبب الترشيح المسبق خسارة كبيرة في الانتعاش الفيروسي30. في حين أن خطوة الترشيح المسبق لطرق الترشيح الفائق ضرورية دائما تقريبا لعينات البيئة ومياه الصرف الصحي لمنع انسداد أجهزة الترشيح الفائق ، فقد يكون الترشيح المسبق ل SMF مطلوبا اعتمادا على نوع التحليل النهائي. بالنسبة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل NSERC Alliance Covid-19 Grant (الجائزة رقم 431401363 ، 2020-2021 ، Drs. Yuan و Uyaguari-Díaz). تود MUD أن تشكر برنامج المنح البحثية الجامعية (الجائزة رقم 325201). يتم دعم كل من JF و JZA من خلال برنامج تدريب الخريجين لتحليلات الأمراض البصرية والآلية (VADA). حصل كل من KY و JF على زمالات من برنامج Mitacs Accelerate. يتم دعم MUD وأعضاء مختبره (KY ، JF ، JZA) من قبل NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ومنحة تشغيل الباحث الجديد في مانيتوبا (رقم 5385). شكر خاص لمدينة وينيبيغ ، مانيتوبا. تم إجراء هذا البحث في جامعة مانيتوبا. نود أن نعترف بأن حرم جامعة مانيتوبا يقع على الأراضي الأصلية لشعوب Anishinaabeg و Cree و Oji-Cree و Dakota و Dene وعلى موطن أمة Métis.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 M عازلة فوسفات الصوديوم مع درجة حموضة 7.5Alfa AesarJ62041APفيشر Scientific ، Fair Lawn ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية
0.2 & mu ؛ م 47 مم Supor-200 مرشحات القرص الغشائيVWR66234شركة بال ، آن أربور ، MI
0.45 & م 47 مم Supor-200 مرشحات القرص الغشائيVWR60043Pall Corporation ، Ann Arbor ، MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermo Fisher Scientific4444432Life Technologies ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية
Armored RNA Quant IPC-1 Processing ControlAsuragen49650Asuragen ، Austin ، TX ، الولايات المتحدة
الأمريكية العلامة التجارية A ، جهاز الطرد المركزي Jumbosep ، 30-kDaPall   ؛OD030C65شركة Pall Corporation ، Ann Arbor ، MI
Brand B ، جهاز الطرد المركزي Microsep Advance ، 30 كيلو دالتونPallMCP010C46Pall Corporation ، Ann Arbor ، أنابيب الطرد المركزي MI
(50 مل)   ؛Nalgene3119-0050PKThermo Fisher Scientific
DNAse IInvitrogen18047019Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2Invitrogen12027Thermo Fisher Scientific
GWV كبسولات أخذ عينات المياه الجوفية عالية السعة - 0.45 & micro ؛ mPall12179Pall Corporation ، Ann Arbor ، MI
حمض الهيدروكلوريك ، محلول قياسي 1NThermo Fisher ScientificAC124210025Fisher Scientific ، Fair Lawn ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid IsolationKit الأنظمة الحيوية التطبيقيةA42358Thermo Fisher Scientific
المياه الخالية من النوكليزPromegaP1197Promega Corporation ، فيتشبرج ، ويسكونسن ،
مضخة التمعجMasterflex ، أداة Cole-Parmer7553-20الأس الهيدروجيني العلمي Thermo
Fisher   ؛أداة دنفرRK-59503-25كول بارمر. تم إيقاف هذا المنتج
الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل 25:24: 1Invitrogen15593031فيشر Scientific ، Fair Lawn ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية
بادئات ومجموعات مسبارIDTIntegrated DNA Technologies، Inc. ، كورالفيل ، IA ، الولايات المتحدة الأمريكية
Qiagen All-prep DNA / RNA power microbiomekit Qiagen QiagenSciences، Inc. ، Germantown ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية
QuantStudio 5 Real-Time PCR نظامThermo Fisher ScientificA34322Life Technologies ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
Qubit 1X dsDNA عالية الحساسية (HS) مجموعة الفحصInvitrogenQ33231Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer ، مع WiFiInvitrogenQ33238Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA عالية الحساسية (HS) مجموعة الفحصInvitrogenQ32855Thermo Fisher Scientific
RNAse AInvitrogenEN0531Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome KitQiagen26000-50Qiagen Sciences، Inc. ، Germantown ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية
مسحوق الحليب الخالي من الدسمDifco (BD Life Sciences)DF0032173فيشر Scientific ، Fair Lawn ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة
الأمريكية عازلة فوسفات الصوديومAlfa AesarAlfa Aesar ، أوتاوا ، أونتاريو ، كندا
مياه البحر الاصطناعيةVWR RC8363-1شركة RICCA للكيماويات
الحمض النووي الاصطناعي أحادي الشريطة gBlockIDTIntegrated DNA Technologies، Inc. ، كورالفيل ، IA ، الولايات المتحدة الأمريكية
الترشيح الفراغي VacuCap 90 - 0.1 & micro ؛ م ، 90 مم ، بال4621Corporation المشعة بجاما ، آن أربور ، MI
VacuCap 90 أجهزة الترشيح الفراغي - 0.2 وميكرو ؛ م ، 90 مم ، مشعPall4622Pall Corporation ، آن أربور ، MI
& beta - mercaptoethanolGibco21985023فيشر Scientific ، فير لاون ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية
الأمريكية مقياس أجهزة شركة Pall جاما

المراجع

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245(2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643(2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165(2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181(2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121(2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199(2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215(2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125(2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957(2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296(2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20(2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).
  29. Geneious. , Available from: https://www.geneious.com (2021).
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296(2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RT qPCR
تركيز جزيئات الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي باستخدام تلبد الحليب منزوع الدسم والترشيح الفائق
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.