هناك حاجة إلى نموذج حيواني مناسب لفهم الآليات المرضية الكامنة وراء تضيق الصمام الأبهري (AVS) وتقييم فعالية التدخلات العلاجية. يصف البروتوكول الحالي إجراء جديدا لتطوير نموذج أرنب AVS عن طريق إصابة بالون مباشرة في الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج تضيق الصمام الأبهري للأرنب الناجم عن إصابة البالون المباشر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تظهر النماذج الحيوانية كأداة مهمة لفهم الآليات المرضية الكامنة وراء تضيق الصمام الأبهري (AVS) بسبب عدم الوصول إلى مصادر موثوقة للصمامات الأبهرية البشرية المريضة. من بين النماذج الحيوانية المختلفة ، تعد نماذج أرنب AVS واحدة من أكثر النماذج استخداما في الدراسات الحيوانية الكبيرة. ومع ذلك ، تتطلب نماذج أرنب AVS التقليدية فترة طويلة الأجل من المكملات الغذائية والتلاعب الجيني للحث على تضيق كبير في الصمام الأبهري ، مما يحد من استخدامها في الدراسات التجريبية. لمعالجة هذه القيود ، تم اقتراح نموذج أرنب AVS جديد ، حيث يحدث التضيق بسبب إصابة بالون مباشرة للصمام الأبهري. يصف البروتوكول الحالي تقنية ناجحة لتحفيز AVS في الأرانب البيضاء النيوزيلندية (NZW) ، مع إجراءات خطوة بخطوة للتحضير والإجراء الجراحي والرعاية بعد الجراحة. يقدم هذا النموذج البسيط والقابل للتكرار نهجا واعدا لدراسة بدء وتطور AVS ويوفر أداة قيمة للتحقيق في الآليات المرضية الأساسية للمرض.
المقدمة
من المعترف به بشكل متزايد أن استخدام النماذج الحيوانية المناسبة يمكن أن يساهم في فهم أفضل للآليات المرضية الكامنة وراء تضيق الصمام الأبهري (AVS) بسبب عدم الوصول إلى مصادر موثوقة للصمامات الأبهرية البشرية المريضة المرتبطة بتطور تضيق الأبهر (AS). من بين النماذج الحيوانية المختلفة لدراسة AVS ، تعد الأرانب واحدة من أكثر نماذج AVS للحيوانات الكبيرة شيوعا ، ويتم تحفيز نموذج أرنب AVS إما من خلال مكملات الكوليسترول / فيتامين D2 أو التلاعب الجيني1،2،3،4.
على الرغم من أن نماذج AVS للأرانب قد قدمت نظرة ثاقبة مهمة حول تطوير وتطور AVS ، إلا أنه لا يزال من الصعب تحفيز AVS باستمرار وبشكل قابل للتكرار ، كما رأينا في تجاربنا الأولية.
بالإضافة إلى النماذج الحيوانية التي يسببها النظام الغذائي والحساسة وراثيا ، تم إنشاء نموذج جديد من AVS من خلال الإصابة الميكانيكية المباشرة في الفئران 5,6. ينجح نموذج الإصابة الميكانيكية في تحفيز تضيق الأبهر ويمثل نموذجا بسيطا وقابلا للتكرار AVS في الفئران البرية. على حد علمنا ، لم تكن هناك دراسات سابقة تدرس آثار الإصابة الميكانيكية على الصمام الأبهري في نماذج الأرانب. وبالتالي ، توفر هذه الدراسة إجراء جديدا لتحفيز AVS في ذكور الأرانب البيضاء النيوزيلندية من خلال إصابة بالون مباشرة للصمام الأبهري ، والتي يمكن أن تحاكي بدقة حالة تضيق الأبهر الصمامي. يتضمن هذا البروتوكول أوصافا خطوة بخطوة للتحضير والإجراء الجراحي والرعاية بعد الجراحة ، والتي تكون مفيدة لتحفيز نماذج أرنب AVS القابلة للتكرار.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع إجراءات البحوث الحيوانية وتنفيذها وفقا لقانون رعاية المختبر ، ودليل رعاية واستخدام المختبر ، والمبادئ التوجيهية والسياسات الخاصة بالتجارب على الحيوانات المقدمة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في كلية الطب بالجامعة الكاثوليكية الكورية (رقم الموافقة: CUMC-2021-0176-05). استخدمت الدراسة الحالية ذكور الأرانب البيضاء النيوزيلندية (NZW) البالغة من العمر 3 أشهر والتي تزن 3.5-4.0 كجم ، والتي تم الحفاظ عليها في ظل الظروف القياسية في أقفاص فردية. تم تغذية الأرانب إما بنظام غذائي عادي أو نظام غذائي غني بالكوليسترول بنسبة 0.5٪ مكمل ب 50000 وحدة من فيتامين D2 (انظر جدول المواد). يوضح الشكل 1 طرق التصميم والتحليل التجريبية لتحريض نموذج أرنب AVS.
1. التحضير للعملية
- تأكد من تعقيم جميع الأدوات الطبية والجراحية (انظر جدول المواد) في بداية العملية.
- قم بإعداد مجموعة قسطرة بالون التوسيع باتباع الخطوات أدناه.
- قم بتوصيل جهاز الانكماش المملوء بمزيج من المحلول الملحي ووسيط التباين المتاح تجاريا (1: 1) بجزء قفل luer من قسطرة البالون (انظر جدول المواد).
- املأ البالون بمحلول النفخ ، وقم بإزالة أي هواء من قسطرة البالون.
ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، يتكون محلول التضخم من 30٪ يوديكسانول مع 0.9٪ محلول ملحي (انظر جدول المواد). - تحقق من تضخم البالون المناسب عن طريق تطهير تجويف البالون بمحلول التضخم.
2. الإجراء الجراحي لإصابة الصمام الأبهري
- تطبيق الحقن العضلي للتيلتامين وزولازيبام (15 ملغ/كغ) والزيلازين (5 ملغ/كغ) (انظر جدول المواد) لتخدير الحيوان.
ملاحظة: قبل إعطاء التخدير ، تمت معالجة الأرانب مسبقا بحقن غليكوبيرولات تحت الجلد (0.05 مجم / كجم) كعامل مضاد للكولين قبل التخدير. تم تحديد مستوى التخدير الكافي من خلال مجموعة من المعايير ، بما في ذلك عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم ومعدل التنفس الثابت. - أدخل قسطرة وريدية (IV) سعة 24 جم في الوريد الأذني الهامشي ، وقم بتوصيل مجموعة التسريب بمحلول ملحي هيبارين (100 وحدة / كجم من الهيبارين).
- قم بتوصيل الأرنب بجهاز مراقبة بيطري متعدد المعلمات (انظر جدول المواد) لمراقبة العلامات الحيوية باستمرار ، مثل إشارة تشبع الأكسجين (SpO2) ودرجة الحرارة وضغط الدم.
ملاحظة: لمراقبة SpO 2 ، قم بتوصيل مستشعر SpO2 بلسان الأرنب. لمراقبة درجة الحرارة ، أدخل المسبار في مستقيم الأرنب. لمراقبة ضغط الدم ، ضع الكفة على الطرف الأمامي. - ضع الأرنب في وضع ضعيف على طاولة عمليات مجهزة بتنظير فلوري C-arm (انظر جدول المواد) ، وقم بإزالة الشعر من منطقة الرقبة البطنية باستخدام مقصات شعر الحيوانات (الشكل 2 أ).
- تعقيم منطقة شق مع اليود ، وتغطية الأرنب مع المناشف الجراحية.
- ضع قلب الأرنب في وسط صورة الذراع C.
ملاحظة: يجب على جميع الباحثين ارتداء معدات واقية مع مقاييس الجرعات الحرارية المرفقة (TLDs) لتقليل التعرض للإشعاع أثناء إجراء الجراحة الموجهة بالذراع C.- قم بتشغيل C-arm ، وحدد الوضع بالمنظار الفلوري لتصوير القلب.
- اضبط موضع الأرنب للتأكد من أن القلب في مركز مجال التصوير.
- قم بعمل شق طولي يبلغ حوالي 3 سم في جلد الرقبة ، واستخدم المقص الجراحي لقطع اللفافة والأنسجة الدهنية.
- كشف الشريان السباتي المشترك الأيسر (LCCA) عن طريق فصل العضلات بعناية حتى يتم الكشف عن حوالي 3-3.5 سم من LCCA (الشكل 2B).
- اربط LCCA بخياطة حريرية 3-0 (انظر جدول المواد) في الجزء العلوي والنهائي من LCCA المكشوف لوقف تدفق الدم.
- أدخل قسطرة IV 22 G في LCCA ، وأدخل سلك توجيه (0.016 بوصة ، انظر جدول المواد) في البطين الأيسر (LV) من خلال القسطرة الوريدية ، مما يضمن وضع طرف القسطرة بشكل صحيح في مجال التصوير للذراع C.
ملاحظة: عند إدخال القسطرة الوريدية، قم بفك خياطة الرباط بعناية في طريقها إلى الصمام الأبهري للسماح بتقدم القسطرة. - اسحب القسطرة الوريدية ، واترك سلك التوجيه ، وضع غمد 4-F (انظر جدول المواد) فوق سلك التوجيه في LCCA لإدخال قسطرة البالون (الشكل 2C).
ملاحظة: بعد استبدال القسطرة الوريدية بالغمد ، يجب إزالة أي هواء محبوس من جهاز الغمد. - أدخل بعناية القسطرة البالونية مقاس 8 مم فوق سلك التوجيه في الصمام الأبهري تحت التوجيه الفلوري C-arm (الشكل 2D).
- ضع طرف القسطرة البالوني على بعد حوالي 1-2 سم من الصمام الأبهري ، وقم بنفخ البالون عن طريق تطهير محلول النفخ باستخدام منفاخ ضغط عند 6 ضغط جوي.
- ادفع البالون إلى قمة الجهد المنخفض ، واسحبه مرة أخرى إلى منفذ الجهد المنخفض. كرر هذا الإجراء خمس مرات ، ثم أفرغ البالون (الشكل 2E ، F).
- كرر الخطوات 2.8-2.9 ثلاث مرات لضمان إصابة الصمام المناسبة.
- اسحب القسطرة البالونية وسلك التوجيه. قم بإزالة الغمد ببطء من LCCA ، واربط LCCA على الفور بالخيط في الطريق إلى الصمام الأبهري.
- نظف منطقة الشق بمحلول ملحي لإزالة الجلطات الدموية ، وافحص الموقع المثقوب بحثا عن نزيف الشرايين.
- أغلق العضلات والجلد بخياطة 3-0 غير قابلة للامتصاص ، وقم بتعقيم جميع جوانب الجرح باليود.
3. رعاية ما بعد الجراحة
- قم بإزالة بقع ومشابك المراقبة ، واحتفظ بالأرنب في حاضنة العناية المركزة.
ملاحظة: بعد الجراحة ، تمت ملاحظة الأرانب عن كثب لمدة 1 يوم في حاضنة العناية المركزة ثم انتقلت إلى قفص منزلي. - يجب تطبيق الألم التالي للعمليات الجراحية باستخدام 5 ملغ/ كغ من الترامادول و3 ملغ/كغ من الكيتوبروفين وتطبيق المضادات الحيوية (4 ملغ/كغ من الجنتاميسين) مرتين يوميا لمدة 3 أيام عن طريق الحقن تحت الجلد (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يجب أن تلتزم إدارة الألم بعد الجراحة بالمبادئ التوجيهية البيطرية و IACUC (على سبيل المثال ، المواد الأفيونية أو مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية أو المخدر الموضعي أو المزيج). - قم بتغذية نظام غذائي غني بالكوليسترول بنسبة 0.5٪ مع 50000 وحدة من فيتامين D2 (HC + VitD2) لمدة 8 أسابيع.
4. تخطيط صدى القلب
- بعد 8 أسابيع من إصابة البالون ، قم بتخدير الأرنب باستخدام نفس الإجراء الموضح في الخطوة 2.1.
- تصور الصمامات الأبهرية باستخدام طرق عرض عبر الصدر ثنائية الأبعاد ، وسجل صور الوضع M في طرق عرض المحور القصير والمحور الطويل.
- ضع الأرنب في وضع ضعيف على طاولة الصدى.
- حلق منطقة الصدر باستخدام كليبرز وكريم إزالة الشعر.
- ضع جل محول الموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) على الصدر.
- اضبط الترجام للحصول على عرض المحور الطويل شبه القصي وعرض المحور القصير للصمام الأبهري.
- استخدم التصوير في الوضع M لتسجيل صور الصمام الأبهري في كل من طرق عرض المحور الطويل والمحور القصير ، وحفظ الصور لتحليلها لاحقا.
5. التحليل النسيجي
- بعد تخطيط صدى القلب ، القتل الرحيم للأرنب عن طريق إعطاء الحقن في الوريد من كلوريد البوتاسيوم (KCl ، 3 جم / 20 مل ، 1 مل).
- افتح التجويف الصدري ، واحصد القلب بالشريان الأورطيالصاعد 7 ، وضعه على الجليد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- اغمر القلب على الفور في محلول بارافورمالدهايد (PFA) بنسبة 4٪ ، وقم بتضمينه في كتلة البارافين (انظر جدول المواد).
- قم بقطع كتلة القلب المضمنة بالبارافين إلى أقسام بسمك 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم ، وقم بتلطيخ الأقسام باستخدام ثلاثي الألوان من ماسون (MT) ، و Alizarin Red ، و von Kossa (انظر جدول المواد) لتقييم ترسب الكولاجين وتكلس الصمام ، على التوالي 8,9.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نموذج AVS الأرنب الناجم عن إصابة الصمام الأبهري
للحث على نموذج AVS للأرانب ، تم استخدام ذكور الأرانب النيوزيلندية التي تزن 3.5-4.0 كجم لهذه الدراسة. وفقا للإجراءات الجراحية الموضحة في الخطوة 2 (الشكل 2) ، تم إنشاء نموذج AVS عن طريق إصابة الصمام الأبهري ، مما أدى إلى تنكس الصمام الأبهري الميكانيكي والتكلس. تضمنت المجموعة الضابطة الأرانب التي تتغذى على نظام غذائي غني بالكوليسترول بنسبة 0.5٪ (ارتفاع الكوليسترول ، HC) و 50000 وحدة من فيتامين D2 (VitD2) ، والذي يعرف باسم نموذج...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويشيع استخدام نماذج AVS الحيوانية لدراسة الجوانب المرضية للمركبات الAVS، بما في ذلك بدء وتطور AVS. يقدم هذا البروتوكول نموذجا جديدا للمركبات الخارقة للدماغ الناجم عن إصابة بالون مباشرة للصمام الأبهري. في هذه الدراسة ، أظهر نموذج إصابة الصمام الأبهري سماكة كبيرة للوريقات وتكلسها. بالمقارنة مع نموذج AVS الخفيف الناجم عن المكملات الغذائية ، أصيب الصمام الأبهري في نموذج إصابة البالون المباشر بشكل انتقائي ، مما أدى إلى شرف سميكة وتقييد الحركة ، بالإضافة إلى وريقات سميكة ومتكلسة. تتوافق هذه النتائج مع الخصائص العامة ل AVS
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه مع هذا العمل.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من الحكومة الكورية (رقم 2020R1A4A3079570) ، ووزارة التعليم (رقم 2021R1I1A1A01051425) ، وبرنامج تطوير التكنولوجيا الاستراتيجية الصناعية (رقم 20014873) بتمويل من وزارة التجارة والصناعة والطاقة ، جمهورية كوريا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3-0 خياطة الحرير | AILEE | SK312 | |
| 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) | إنترون | IBS-BP031-2 | |
| محلول أليزارين الأحمر | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION Blue | الخلفي من | سلك دليل ASAHI | |
| يوهان كيمبرلي | 80101-30 | ||
| جهاز انكماش بالون | ديماكس الطبية | DID30s | |
| Bionet مراقب بيطري | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7٪ زيت جوز الهند المهدرج ، 0.5٪ كوليسترول ، و 1٪ Molasse |
| Curadle الحاضنة الذكية | Autoelex | CS-CV206 | وحدة العناية المركزة (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | فيتامين D2 |
| Fechtner ملقط الملتحمة التيتانيوم | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| ملقط | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | شين بونغ | ||
| Glycopyrrolate ؛ | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | محلول ملحي عادي 500 مل | |
| محلول هيماتوكسيلين | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| مجموعة التسريب Heparin | JW الصيدلانية | 25,000 U | |
| للاستخدام الفردي | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green الصيدلانية | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (عامل تباين) |
| قسطرة IV 22 G | BD & nbsp ؛ | 382423 | |
| قسطرة IV 24 جم | BD | 382412 | |
| كيتوبروفين | SamChunDang | ||
| Luer-Lok حقنة 10 مل | حقنة Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok 3 مل | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT طقم البقع | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| حامل إبرة | Solco | 009-1304 | |
| حامل إبرة مع قفل وخياطة | JEUNGDO BIO & مصنع | H-1222-18 | |
| البارافين | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| كلوريد البوتاسيوم 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude غمد محب للماء | المثالي MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | غمد 4F |
| قسطرة توسيع بالون PTA | بوسطن Scientific | H749-3903280208-0 | قسطرة بالون 8.0 مم |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| معقم شاش | DAE HAN Medical | 10 سم × 20 سم & nbsp; | |
| قفازات جراحية | أنسيل | أنسيل | |
| ثوب جراحي | يوهان كيمبرلي | 90002-02 | |
| مقص جراحي | نوبا ، ألمانيا | AC020 / 16 | |
| شريط جراحي | 3M ميكوبور | 1530-1 | |
| حقنة 1 مل | حقنة شين تشانغ الطبية | ||
| 10 مل | شين تشانغ الطبية | ||
| كاسيت الأنسجة | Scilav korea | Cas3003 | |
| هلام محول الطاقة | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | ترامادول هيدروكلوريد | |
| فيلبس | أفينيتي 50 | ||
| طقم وصمة عار فون كوسا | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac كوريا | Tiletamine & zolazepam |
المراجع
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580(2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al. Calcific aortic stenosis. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16006(2016).
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
