القياس الكمي لتعديلات هيستون العالمية بعد الترجمة باستخدام قياس التدفق الخلوي داخل النواة في الخلايا الدبقية الصغيرة لدماغ الفأر المعزول

Summary

يصف هذا العمل بروتوكولا للقياس الكمي لتعديلات الهستون العالمية باستخدام قياس التدفق الخلوي داخل النواة في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة في الدماغ. يحتوي العمل أيضا على بروتوكول عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الذي تم استخدامه لجمع البيانات.

Abstract

يحدث التحكم في التعبير الجيني جزئيا عن طريق التعديلات في بنية الكروماتين ، بما في ذلك إضافة وإزالة تعديلات ما بعد الترجمة على ذيول الهستون. يمكن لتعديلات هيستون بعد الترجمة (HPTMs) إما تسهيل التعبير الجيني أو القمع. على سبيل المثال ، يعمل أستلة بقايا ليسين ذيل هيستون على تحييد الشحنة الموجبة وتقليل التفاعلات بين الذيل والحمض النووي سالب الشحنة. يؤدي الانخفاض في تفاعلات الحمض النووي لذيل هيستون إلى زيادة إمكانية الوصول إلى الحمض النووي الأساسي ، مما يسمح بزيادة الوصول إلى عامل النسخ. تعمل علامة أستلة أيضا كموقع التعرف على منشطات النسخ المحتوية على البرومودومين ، مما يؤدي معا إلى تعزيز التعبير الجيني. يمكن تنظيم علامات الهستون ديناميكيا أثناء تمايز الخلايا واستجابة للبيئات والمحفزات الخلوية المختلفة. بينما بدأت مناهج التسلسل من الجيل التالي في توصيف المواقع الجينومية لتعديلات الهستون الفردية ، يمكن فحص تعديل واحد فقط في وقت واحد. نظرا لوجود المئات من HPTMs المختلفة ، فقد طورنا مقياسا كميا عالي الإنتاجية ل HPTMs العالمية التي يمكن استخدامها لفحص تعديلات الهستون قبل إجراء مناهج تسلسل جينوم أكثر شمولا. يصف هذا البروتوكول طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي للكشف عن HPTMs العالمية ويمكن إجراؤها باستخدام الخلايا الموجودة في المزرعة أو الخلايا المعزولة من الأنسجة في الجسم الحي . نقدم أمثلة على البيانات من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة في دماغ الفأر لإثبات حساسية الفحص للكشف عن التحولات العالمية في HPTMs استجابة لمحفز مناعي مشتق من البكتيريا (عديد السكاريد الشحمي). يسمح هذا البروتوكول بالتقييم السريع والكمي ل HPTMs ويمكن تطبيقه على أي منظم نسخ أو لاجيني يمكن اكتشافه بواسطة جسم مضاد.

Introduction

علم التخلق هو دراسة الآليات التي تنظم التعبير الجيني دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسي. التنظيم اللاجيني للتعبير الجيني ديناميكي داخل الخلايا ويمكن أن يسمح باستجابات سريعة ومنسقة لمختلف المحفزات البيئية. يحدث التنظيم الديناميكي جزئيا بسبب التغيرات في بنية الكروماتين على مستوى النواة ، والتي تتكون من بروتينات هيستون (H2A ، H2B ، H3 ، H4) مجمعة في قلب أوكتامير ملفوف بإحكام بواسطة الحمض النووي¹. يمكن للتفاعلات بين بروتينات هيستون والحمض النووي التحكم في إمكانية وصول الحمض النووي إلى آلية النسخ ، والتي يمكنها في النهاية التحكم في التعبير الجيني والجوانب الأخرى لبيولوجيا الكروماتين². تحتوي بروتينات الهستون على ذيول غير منظمة تتميز ببقايا موجبة الشحنة تشكل تفاعلات كهروستاتيكية مع العمود الفقري للحمض النووي سالب الشحنة. تؤدي هذه التفاعلات إلى تعبئة ضيقة للحمض النووي وتقليل إمكانية الوصول إلى الحمض النووي. يمكن للتعديلات التساهمية على ذيول هيستون ، والتي تسمى تعديلات هيستون بعد الترجمة (HPTMs) ، تنظيم هذه التفاعلات ^3,4. تتضمن بعض HPTMs الأكثر تميزا أستلة ذيل هيستون ومثيلة ، والتي يمكن أن تغير تقارب التفاعلات الكهروستاتيكية بين ذيول هيستون والحمض النووي ، مما يؤدي إلى إمكانية الوصول التفاضلية إلى الحمض النووي الأساسي وتوظيف عوامل النسخ التي تتعرف على HPTMs هذه في مواقع محددة. يتم تنظيم HPTMs بواسطة ثلاث فئات مهمة من الإنزيمات تسمى القراء - والتي تتعرف ، والكتاب - التي ترسب ، والممحاة - التي تزيل HPTMs. وبالتالي ، فإن توظيف أو حل إنزيمات القارئ أو الكاتب أو الممحاة يمكن أن يغير في النهاية مشهد HPTMs ويحكم بنية ووظيفة الكروماتين ، مما يجعل تنظيمها وقراءتها ضروريين لفهم البيولوجيا الخلوية والوظيفة ^3,4.

تتميز الخلايا الموجودة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) بالمرونة اللاجينية لأنها تغير نسختها للتكيف مع المثيرات البيئية. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن التغيرات في الجينوم ، مثل مثيلة الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي غير المشفر ، و HPTMs ، تلعب دورا أساسيا في تكوين الذاكرة والوظيفة المشبكية⁵. يمكن أن يؤدي تعطيل ديناميكيات HPTM من خلال التلاعب بالقراء أو الكتاب أو المحايات ذات الصلة إلى منع أو تعزيز التعلم الترابطي والتعزيز طويل المدى^6،7،8. تقوم الخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي الخلية المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي ، بتنظيم نسخها بسرعة استجابة للتحفيز المناعي من خلال التغيرات الديناميكية في epigenome^9،10،11. هذا المستوى العالي من التكيف مع بيئة الدماغ المحلية يجعل من الصعب فحصها في سياق معزول حيث أظهرت الدراسات أن epigenome و transcriptome من الخلايا الدبقية الصغيرة يتغير بعد بضع ساعات فقط في وسط الثقافة بعد إزالته من بيئة الدماغ¹¹. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الخلايا الدبقية الصغيرة لا تشكل سوى 10٪ من خلايا الدماغ ، فإن مقاييس فحص التغيرات على مستوى الأنسجة بأكملها تفتقر إلى الحساسية والنوعية ^12,13. نتيجة لذلك ، يجب عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بسرعة لفحص التغيرات اللاجينية مثل مستويات HPTM ، خارج الجسم الحي.

تشمل الطرق المستخدمة بشكل شائع لفحص HPTMs تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP-seq) والانقسام تحت الأهداف وتسلسل العلامات (CUT&Tag-seq)⁴. في حين أن هذه التقنيات محددة للغاية ل HPTM فردي ويمكن أن تبلغ عن وجود HPTMs في سياق جينومي محدد ، إلا أنها لا تستطيع فحص سوى واحدة من العديد من HPTMs المحتملة في تجربة واحدة^11,14 لذلك ، قبل الشروع في مثل هذه التجارب ، والتي تتطلب استثمارا كبيرا للوقت والمال ، من المفيد للغاية تضييق قائمة HPTMs التي يحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام لمزيد من التحقيق من خلال فحص التغييرات في العالم أولا مستويات HPTMs. النهجان الرئيسيان لفحص مستويات HPTM العالمية هما الكيمياء المناعية وتحليل اللطخة الغربية ، لكن كلا النهجين شبه كمي فقط ، ومنخفض الإنتاجية ، ويتطلبان أعدادا كبيرة من أقسام الأنسجة أو الخلايا المعزولة^15,16. وبالتالي ، فإننا نهدف إلى تطوير طريقة كمية حساسة للغاية يمكن استخدامها لفحص مستويات HPTM العالمية بسرعة وعلى مستوى الخلية الواحدة.

يتيح البروتوكول المقدم الكشف عن مستويات HPTM العالمية بسرعة باستخدام قياس التدفق الخلوي داخل النواة. بررت الدراسات السابقة التي أجريت على الخلايا السرطانية أهمية فحص المستويات العالمية من منظور سريري ^17,18. من الشائع أيضا أن تستخدم الدراسات المستويات العالمية كطريقة فحص قبل تقييم الموقع الجينومي ل HPTMs المحددة ذات الأهمية^19,20. بالنسبة للخلايا الدبقية الصغيرة ، يعد تقييم المستويات العالمية بعد العزل أمرا صعبا بسبب انخفاض إنتاجية الخلايا. يقدم Pan et al مستويات HPTM العالمية من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة ، حيث تم تجميع الخلايا الدبقية الصغيرة من ثلاثة لتمكين اكتشاف مستوى البروتين بواسطة اللطخة الغربية¹⁹. باستخدام بروتوكولنا ، نحن قادرون على اكتشاف التغييرات العالمية بمدخلات خلايا أقل بكثير ، مما يتيح فحص علامات متعددة لكل والقضاء على الحاجة إلى تجميع العينات.

هنا ، نصف بروتوكولا للكشف عن مستويات HPTM بسرعة عبر قياس التدفق الخلوي الكمي داخل النواة في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة. بينما نركز بشكل خاص على القياس الكمي HPTM من أجل الإيجاز ، يمكن استخدام هذا البروتوكول بنفس الطريقة لتحديد المستويات العالمية لإنزيمات القارئ والكاتب والممحاة. يتم تسليم البروتوكول في جزأين: أولا ، طريقة عزل الخلايا الدبقية الصغيرة ، وثانيا ، الطريقة القائمة على قياس التدفق الخلوي لتحديد مستويات HPTM. تنتج طريقة العزل خلايا يمكن استخدامها لكل من عزل الحمض النووي الريبي وتقييم مستوى HPTM الذي يسمح بتقييم التعبير الجيني ومستويات HPTM من نفس العينة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام طريقة تقييم HPTM على أنواع الخلايا الأخرى كما هو موضح في البروتوكول.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات رعاية من قبل لجنة رعاية بجامعة كولومبيا البريطانية وفقا لإرشادات المجلس الكندي لرعاية.

1. هضم الدماغ لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة

الشكل 1: مخطط انسيابي بسيط للبروتوكول. يتم ترشيح الفئران أولا عبر القلب مع HBSS ، ويتم تشريح الدماغ. ثم يتم فصل الدماغ من خلال الهضم الكيميائي والاضطراب الميكانيكي لينتج عنه تجانس خلية واحدة. يتم جمع الجزء المخصب المناعي عن طريق تدرج الكثافة المتقطع ، وبعد ذلك يتم تلطيخ الخلايا ل P2RY12. الخلايا الملطخة إما 1) يتم فرزها عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتؤدي إلى تحليل الحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين في اتجاه مجرى النهر و / أو 2) ثابتة ونفاذية وملطخة للبروتينات داخل النواة. يتم قياس مستوى البروتين من خلال متوسط شدة التألق في قناة الاهتمام التي يحددها قياس التدفق الخلوي. المربعات الملونة باللون الأزرق هي جزء من بروتوكول الخطوة 1) هضم الدماغ لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة. المربعات الملونة باللون الأحمر هي جزء من البروتوكول الخطوة 2) تلطيخ التدفق داخل النواة لتحليل تعبير البروتين. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تحضير الكواشف
   ملاحظة: إذا كنت تخطط للاستخراج لجمع كل من الحمض النووي الريبي والخلايا لتحليل HPTM ، فارجع إلى القسم 1.7.1 للحصول على تعديلات لتشمل مثبطات النسخ والترجمة. ومع ذلك ، هذا ليس مطلوبا إذا كان مجرد تقييم إشارة البروتين لأن الخلايا هادئة إلى حد كبير عند الاحتفاظ بها على الجليد.
   1. المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (20 مل لكل عينة): قم بإذابة ألبومين مصل الأبقار (BSA) في 1x محلول ملح هانكس المتوازن (HBSS) لإنشاء محلول BSA بنسبة 2٪. قم بإذابة EDTA إلى تركيز نهائي قدره 1 mM في محلول 2٪ BSA. قم بتعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر وخزنه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الاستخدام.
   2. مخزن الهضم المؤقت (1 مل لكل عينة): إعادة تكوين قارورة من غراء في HBSS إلى تركيز نهائي قدره 20 وحدة / مل في 1 mM L-cysteine مع 0.5 mM EDTA. ينشط عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 10 دقائق أو حتى يصبح جاهزا لهضم الأنسجة. قبل الاستخدام مباشرة ، أضف DNase I إلى محلول غراء المنشط إلى تركيز نهائي يبلغ 200 وحدة / مل. تحضير هذا في يوم التجربة ولا تخزن.
   3. محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر (5.5 مل لكل عينة): أضف 10x HBSS إلى وسط تدرج الكثافة الباردة إلى تركيز نهائي قدره 1x HBSS ، مما ينتج عنه كثافة نهائية تبلغ 1.117 جم / مل. دوامة لخلط لمدة 30 ثانية على الأقل قبل الاستخدام. ضعه على الثلج حتى الاستخدام.
   4. محلول تدرج الكثافة 37٪ (4 مل لكل عينة): أضف تدرج الكثافة متساوي التوتر إلى 1x HBSS لعمل تركيز نهائي بنسبة 37٪ بكثافة نهائية تبلغ 1.043 جم / مل. أضف 20 ميكرولتر من الفينول الأحمر لكل مل من تدرج الكثافة بنسبة 37٪ لعمل محلول وردي للتصور أثناء الطبقات. دوامة لمدة 30 ثانية على الأقل قبل الاستخدام. ضعه على الثلج حتى الاستخدام.
   5. محلول تدرج الكثافة بنسبة 70٪ (2 مل لكل عينة): أضف تدرج الكثافة متساوي التوتر إلى 1x HBSS لعمل تركيز نهائي بنسبة 70٪ بكثافة نهائية تبلغ 1.082 جم / مل. أضف 5 ميكرولتر من التريبان الأزرق لكل مل من وسط الكثافة 70٪ لعمل حل أزرق للتصور أثناء الطبقات. دوامة لمدة 30 ثانية على الأقل قبل الاستخدام. ضعه على الثلج حتى الاستخدام.
2. التروية وتسريح الدماغ
   ملاحظة: بروتوكول التروية مشابه ل Posel et al. الذي يتميز بتصوير فيديو لبضع صدر الفأر ، والتروية عبر القلب ، وإزالة الدماغ²¹. هنا ، نستخدم الفئران البالغة C57BL / 6J من الذكور والإناث (10-15 أسبوعا ، 20-30 جم) ، ولكن يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء بضع الصدر لأي فأر. يجب الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية قبل إجراء التجارب.
   1. تخدير الفئران: تخدير الفئران بنسبة 4٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ حتى تجاوز مستوى التخدير الجراحي ، والذي يمكن تأكيده بقرصة إصبع القدم ، أو عدم وجود رد فعل عند الضغط بقوة على قدم الفأر. ضع الفأر على ظهره وقم بتثبيت كفوفه الأربعة بإحكام في لوحة التشريح الجراحي الموضوعة مائلة في صينية بلاستيكية ، مما يضمن تثبيت الأنف في مخروط الأنف isofluorane. بعد النقل ، تأكد من أن لا يزال يتجاوز المستوى الجراحي للتخدير قبل المتابعة.
   2. استئصال صدر الفأر: أمسك جلد البطن وارفعه باستخدام الملقط وقم بعمل شق ضحل عبر الجلد وجدار البطن لكشف الإكسيفوئيد دون الإضرار بالشريان الأورطي النازل أو أي أعضاء كامنة.
   3. أمسك الإكسيفوئيد بالملقط وقم بعمل شقوق جانبية أسفل القفص الصدري لكشف الحجاب الحاجز والكبد. قم بعمل جروح ضحلة دقيقة من خلال الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري باستخدام مقص دقيق ومن خلال القفص الصدري باستخدام مقص الأنسجة وقم بتثبيت القص بالمحطة الجراحية بالقرب من رأس الفأر لكشف القلب والرئتين للنضح عبر القلب.
   4. التروية عبر القلب: قم بإعداد مضخة التروية التمعجية وقم بتوصيل إبرة 26.5 جرام بأحد طرفي الأنبوب. قم بتجهيز الأنبوب للإجراء عن طريق إدخال أحد طرفي الأنبوب في قارورة من 1x HBSS البارد وتشغيل المضخة لملء الأنبوب بالكامل ب 1x HBSS.
   5. أثناء إمساك القلب بالملقط الحاد ، أدخل طرف إبرة 26.5G مع أنبوب التروية المرفق في البطين الأيسر للقلب وقم بعمل شق صغير في الأذين الأيمن. قم بتشغيل مضخة التروية لتغذية الماوس بعناية بمعدل ~ 2-4 مل / دقيقة مع ما لا يقل عن 15-20 مل من البرد 1x HBSS.
      ملاحظة: غالبا ما يشار إلى التروية الكاملة عندما يبدأ الكبد في تنظيف الدم ويصبح بنفس لون القلب.
   6. إزالة الدماغ: قطع رأس الفأر باستخدام مقص تشريح الأنسجة وإجراء شق خط الوسط في فروة الرأس من الرقبة إلى الأنف. قشر اللوحات الجلدية على الجانبين لكشف الجمجمة وإزالة الأنسجة والعظام الزائدة في الطرف الذيلي من الجمجمة بمقص تشريح.
   7. حرك شفرة واحدة من المقص بعناية أسفل الجمجمة في الثقبة العظمى مع الجانب الحاد المواجه للعظم وقطع خط الوسط بعناية نحو الأنف. قم بعمل جروح جانبية في كل من قاعدة الجمجمة وبالقرب من الأنف باستخدام مقص تشريح. باستخدام ملقط رفيع ، قم بتحريك الجمجمة من خط الوسط إلى الخارج لكسر قطع الجمجمة وكشف الدماغ. ارفع الدماغ برفق باستخدام ملعقة وضعه على ورق لطخة التشريح.
   8. تشريح الدماغ: ضع الدماغ على قطعة من ورق لطخة التشريح مبلل ب 1x HBSS فوق طبق بتري مغلق مملوء بالثلج. إزالة المخيخ وتقسيم نصفي الكرة المخية باستخدام شفرة حلاقة نظيفة.
   9. قم بإزالة جذع الدماغ والمخطط والمادة البيضاء من كل نصف كرة ، مع الحفاظ على الحصين والقشرة المتراكبة سليمة. انقل نصفي الكرة الأرضية التي تحتوي على قشرة معزولة وأنسجة الحصين إلى أنبوب سعة 15 مل مع 5 مل من HBSS البارد 1x واحتفظ به على الجليد.
      ملاحظة: من المهم إجراء التشريح في أسرع وقت ممكن بحيث تظل الأنسجة باردة مع ما لا يزيد عن 2 دقيقة بين قطع الرأس والوضع النهائي للأنسجة المشرحة في 1x HBSS على الجليد. في حالة عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من متعددة ، يمكن تخزين الأدمغة على الجليد في 1x HBSS لمدة ~ 1 ساعة قبل الشروع في معالجة مجموعة بأكملها للهضم وما إلى ذلك.
3. هضم الدماغ والتجانس
   1. التفكك الميكانيكي والكيميائي: ضع أنسجة المخ من كل فأر و 1 مل من محلول الهضم في أطباق بتري الفردية على الجليد. باستخدام شفرة مشرط نظيفة ، قم بتقطيع الدماغ جيدا إلى قطع صغيرة (<1 مم).
   2. اقطع طرف ماصة نقل البلاستيك وانقل بعناية كل من الأدمغة المفرومة إلى آبار منفصلة داخل صفيحة من 24 بئرا على الجليد. غطي الطبق بغشاء مرن شفاف واحتضانه على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: عند تقطيعها بشكل صحيح ، تشبه أنسجة المخ الثوم المفروم جيدا.
   3. ارتداد التجانس: نقل محلول الدماغ المهضوم من كل بئر إلى مجانسات زجاجية فردية سعة 7 مل على الجليد مملوءة ب 5 مل من مخزن FACS البارد. ارتد كل دماغ برفق باستخدام المدقة السائبة (A) ، حوالي 30-40 مرة ، حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة. بعد الغسل باستخدام المدقة A ، ارتد برفق باستخدام المدقة الضيقة (B) 3-4 مرات لضمان تعليق خلية واحدة.
      ملاحظة: لا تدفع المدقة أكثر من 3/4 من الطريق لأسفل لتجنب سحق الأنسجة في الجزء السفلي من الخالط. يجب أن يكون الحل النهائي معتما وحليبيا.
      ملاحظة: في حالة هضم أدمغة متعددة في تجربة واحدة، حدد وقت نقل هضم الدماغ إلى مخزن FACS المؤقت بحيث تكون كل عينة في المخزن المؤقت للهضم لمدة 30 دقيقة فقط. يمكن أن يؤدي الإفراط في الهضم إلى انقسام البروتينات السطحية ، مما يقلل من ارتباط الأجسام المضادة والإشارة في اتجاه مجرى النهر.
4. الحصول على جزء مناعي مخصب
   1. إنشاء تدرج الكثافة: انقل التجانس من كل دماغ إلى أنابيب منفصلة من مادة البولي بروبيلين سعة 15 مل وأضف 2.125 مل من تدرج الكثافة متساوي التوتر وأعلى إلى 8.5 مل مع مخزن مؤقت FACS لكل منها للحصول على تركيز نهائي من تدرج الكثافة بنسبة 25٪. اقلب برفق أنابيب 15 مل 20x لتختلط جيدا.
   2. باستخدام ماصة نقل ضيقة التدرج ، قم بتغطية 4 مل من تدرج الكثافة بنسبة 37٪ برفق لكل أنبوب ، مع الحرص الشديد على إنشاء طبقات نظيفة. قم بتبديل ماصات النقل وقم بتغطية 2 مل برفق من تدرج الكثافة بنسبة 70٪ (الشكل 2 أ). نقل إلى جهاز طرد مركزي مبرد إلى 4 درجات مئوية وتدور عند 500 × غرام لمدة 20 دقيقة مع ضبط منحدر الكبح على الصفر.
   3. جمع الجزء المخصب بالمناعة: باستخدام ماصات نقل نظيفة ، قم بشفط المايلين برفق من أعلى الحجم في أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة نقل نظيفة وتخلص منها. اجمع بعناية الجزء العلوي من تدرج الكثافة في أنبوب بولي بروبيلين نظيف سعة 15 مل باستخدام ماصة نقل.
   4. اجمع بعناية الجزء المخصب بالمناعة (1.5 مل أعلاه و 1.5 مل أدناه حيث تلتقي طبقات التدرج الكثافتي 70٪ و 37٪) في أنبوب بولي بروبيلين جديد سعة 15 مل (الشكل 2 ب). أضف 10 مل من المخزن المؤقت FACS إلى العينة المخصبة بالمناعة لتخفيف وسط تدرج الكثافة وقلب الأنبوب برفق 20x للخلط جيدا.
      ملاحظة: نظرا لأن الخلايا تميل إلى الالتصاق بجوانب الأنبوب ، فتأكد من جمع كل الخلايا في العينة أثناء خطوات التجميع عن طريق تدوير الماصة ببطء على طول جوانب الأنبوب أثناء جمع السائل.
   5. قم بتجميع الخلايا الموجودة في العينة المخصبة بالمناعة عن طريق الطرد المركزي لأنابيب سعة 15 مل في جهاز طرد مركزي 4 درجات مئوية عند 500 × جم لمدة 10 دقائق مع ضبط فرامل منحدر المنحدرات على الصفر. فور انتهاء الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، تاركا حوالي 300 ميكرولتر من السائل في أنبوب 15 مل ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات (التي قد لا تكون مرئية).
   6. اجمع المادة الطافية في أنبوب آخر سعة 15 مل للتأكد من أن الخلايا قد تم تكويرها في الدوران (تخلص من هذا الكسر بمجرد الانتهاء من التحقق من عدد خلايا الحبيبات المعاد تعليقها). بعد تعليق حبيبات الخلية في حجم 300 ميكرولتر باستخدام ماصة P1000 ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم لتقدير إجمالي إنتاجية الخلية.

الشكل 2: الحصول على الجزء المخصب بالمناعة عن طريق تدرج الكثافة المتقطع. (أ) يتكون تجانس الدماغ من وسط كثافة بنسبة 25٪ ، ويقوم على 4 مل من اللون الوردي المتوسط الكثافة بنسبة 37٪ عبر الفينول الأحمر و 2 مل من اللون الأزرق المتوسط الكثافة بنسبة 70٪ عبر التريبان الأزرق. (ب) بعد الطرد المركزي، انفصلت الكسور. تقع الخلايا الدبقية الصغيرة على واجهة شظايا الوسائط ذات الكثافة 37٪ و 70٪. توجد قطعة الميالين في الجزء العلوي من الأنبوب سعة 15 mL وسيتم التخلص منها. يتم جمع الجزء العلوي كنسخة احتياطية في حالة فشل الدوران ، ولا يتم استرداد أي خلايا. إذا حدث ذلك، يمكن تكرار التدرج باستخدام هذا الكسر. يتم جمع الجزء المخصب المناعي في اتجاه مجرى النهر. يبقى الجزء السفلي الذي يحتوي على أي خلايا دم حمراء في الأنبوب ويتم التخلص منه. (ج) مثال على شكل يوضح طبقات كاملة. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. تلطيخ الأجسام المضادة خارج الخلية
   1. حجب: نقل الخلايا إلى لوحة بئر مستديرة القاع 96 على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 500 × غرام مع الفرامل لحبيبات الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية بسرعة في الحوض عن طريق تحريك اللوحة للتخلص من المادة الطافية ، مع ترك حبيبات الخلية سليمة في قاع البئر.
   2. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS باستخدام كاشف مانع لمستقبلات CD16 / 32 FC المضاد للفأر باستخدام ماصة P200 (التركيز النهائي 10 ميكروغرام / مل ، عامل التخفيف 1:50) لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بالوحيدات أو الخلايا الحاملة الأخرى ل FcR. احتضان لمدة 10 دقائق على الجليد.
   3. تلطيخ الأجسام المضادة: قم بإعداد الحجم المناسب لمزيج رئيسي 2x يحتوي على P2RY12- Allophycocyanin (APC ؛ عامل التخفيف 1:50 ، تركيز 4 ميكروغرام / مل لتركيز بئر نهائي 1: 100 ، تركيز 2 ميكروغرام / مل) والبنفسج 525 بقعة حية ميتة (عامل التخفيف 1:50 لتركيز البئر النهائي 1: 100). أضف 50 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتلوين إلى تعليق الخلية (تم الحصول عليه بعد الحجب في القسم 1.5.1) واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في الظلام على الجليد.
      ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، نقدم تلطيخ الخلايا باستخدام P2RY12. أولا ، P2RY12 هو علامة استتباب للخلايا الدبقية الصغيرة التي يمكن تنظيمها في سياقات مرضية معينة. على سبيل المثال ، قامت الفئران النموذجية لمرض الزهايمر 5XFAD بتخفيض مستويات P2RY12 مما قد يجعل من الصعب تحديد²². تشمل البقع البديلة التي يمكن استخدامها للعزل Tmem119 و Cd11b و CD45²³. ثانيا ، يمكن تعديل APC الفلوروكروم المترافق ليناسب لوحة الأجسام المضادة المطلوبة. ومع ذلك ، فإن اختيار الفلوروكروم اللامع ، مثل APC أو PE ، سيساعد على ضمان سهولة تمييز السكان الموجبة والسلبية²⁴.
   4. بعد التلوين ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS مباشرة إلى كل بئر لغسل الخلايا. قم بالدوران عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لإزالة المادة الطافية عن طريق النقر. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS باستخدام ماصة P200 ، وقم بتدويرها عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية ، ونفض الغبار عن اللوحة لإزالة المخزن المؤقت من الآبار.
   5. تحضير عناصر التحكم في التدفق: قبل التلوين ، افصل الأحجام الضرورية من الخلايا عن كل عينة بعد حظرها في الخطوة 1.5.1 لعناصر التحكم في التدفق المطلوبة.
      ملاحظة: عناصر التحكم في التدفق مطلوبة لكل تجربة لإنشاء البوابات. يمكن أخذ ضوابط التدفق من إضافي أو من جزء صغير من كل بئر من الآبار التجريبية. عند تقسيم الخلايا ، تأكد من تعيين خلايا كافية لكل عنصر تحكم حيث يلزم وجود 10000-30000 خلية لكل عنصر تحكم لإنشاء بوابات بثقة عالية.
      1. هناك ثلاثة عناصر تحكم ذات صلة بالتدفق: لا توجد بقع ، ميت حي ، والتحكم في النمط المتماثل P2RY12. لعدم التحكم في البقع ، لا تضيف أي جسم مضاد. في التحكم في النمط المتماثل P2RY12 ، عالج الخلايا بصبغة الصلاحية (1: 100) وجسم مضاد للتحكم في النمط المتماثل مترافق مع APC (1: 100).
      2. لتحضير السيطرة الميتة الحية ، قم بتحويل الخلايا القسمة إلى بئر منفصل ونقل نصف حجم الخلية إلى أنبوب 500 ميكرولتر. ضع أنبوب 500 ميكرولتر في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لقتل الخلايا. أعد حصصة الخلايا الميتة إلى بئر التحكم في الموتى الأحياء وصمة عار بصبغة صلاحية ملزمة للأمين على البنفسج 525 (عامل التخفيف 1: 100) لتمييز الخلايا الميتة.
         ملاحظة: تمت كتابة البروتوكول لتلطيخ الألواح بطريقة النقر لإزالة المواد الطافية. ومع ذلك ، يتطلب ذلك إزالة المادة الطافية فور الانتهاء من الدوران ويجب أن يتم النقر بقوة كافية لإزالة المادة الطافية بسرعة دون إزعاج الحبيبة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أنابيب خالية من 1.5 مل RNAse / DNase للتلطيخ ، مع التعديلات التالية: نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل وحبيبات عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح طاف مع الماصات. نصيحة: للسرعة ، يمكن لماصة نقل 5 مل مع طرف P200 أن تستنشق المادة الطافية بسرعة وبدقة. عند الشفط ، تحقق من وجود حبيبات. إذا لم تكن الحبيبات مرئية ، فاترك 50 ميكرولتر من المادة الطافية واضبط الحسابات وفقا لذلك. عند غسل الأجسام المضادة ، أضف FACS إضافية لزيادة تخفيف الأجسام المضادة (1000 ميكرولتر بدلا من 200 ميكرولتر) لحساب الإزالة غير الكاملة للطاف. اعتمادا على مقياس الخلايا ، استخدم أنابيب 1.5 مل للفرز ، مما يقلل من كمية الإمدادات المطلوبة.
6. فرز FACS للخلايا الدبقية الصغيرة
   1. التحضير: يعاد تعليق كل بئر في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS باستخدام ماصة P200 ونقلها إلى أنابيب فرز التدفق الموسومة وإضافة مخزن FACS المؤقت إلى ما مجموعه 500 ميكرولتر لتركيز حوالي 5 × 10⁵ أحداث لكل مل. تخزينها على الجليد في الظلام حتى التحليل. قم بإعداد أنابيب ما بعد الفرز عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS كوسادة للخلايا في أنابيب خالية من الحمض النووي الريبي سعة 1.5 مل.
   2. إعدادات مقياس الخلايا: فرز الخلايا على فارز خلايا قياس التدفق الخلوي الذي تم إعداده باستخدام فوهة 100 ميكرومتر. فرز الخلايا باستخدام 18-20 رطل / بوصة مربعة.
   3. البوابة: على مقياس الخلايا، بوابة لحجم الخلية باستخدام منطقة التشتت الجانبي (SSC) مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC) باستخدام التحكم في عدم وجود بقع للمساعدة في تمييز الحطام، ضع SSC-A على محور لوغاريتمي لتصور عدد الخلايا والبوابة عن كثب لتحديد الخلايا (البوابة S1; الشكل 3). لإزالة أي ثنائيات ، ارسم FSC-H مقابل FSC-W وقم بالبوابة عن كثب حول مجموعة الخلايا لإزالة أي حطام ومضاعفة (البوابة S2). باستخدام عنصر التحكم في النمط المتماثل P2RY12 ، افحص الخلايا في قناة APC واضبط بوابة التألق الذاتي لتحديد خلايا P2RY12 +. باستخدام عناصر التحكم بدون بقع وميتة حية ، قم ببوابة الخلايا غير الفلورية على البنفسجي 525 نانومتر كخلايا حية.
   4. الفرز: ارسم البنفسج 525 نانومتر مقابل APC وحدد السكان الذين هم P2RY12 + ويعيشون بواسطة FMOs (MG). قم بفرز هذه الخلايا في أنبوب الفرز اللاحق المسمى (الشكل 3). تبلغ نسبة الفرز النهائية حوالي 50٪ من إجمالي الأحداث مع إزالة غالبية إجمالي الخسائر في الحدث في البوابة S1 (~ 70٪ من الأحداث عبارة عن خلايا ؛ الجدول 1).
7. عزل وتحليل الحمض النووي الريبي
   1. مثبطات النسخ والترجمة: في حالة التخطيط لاستخراج الحمض النووي الريبي ، للقضاء على خطر عزل التوقيعات النسخية المرتبطة ، قم بتضمين مثبطات الترجمة والنسخ في خطوات المخزن المؤقت. تحضير كوكتيل المانع كما وصفه مارش وآخرون بما في ذلك الأكتينومايسين D وأنيسوميسين وتريبتوليد²⁵.
      1. تحضير المثبطات: إعادة تكوين مخزون المثبطات وتخزينها على النحو التالي: إعادة تكوين الأكتينومايسين D في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 5 ملغ / مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. أعد تكوين ثلاثي التوليد في DMSO إلى 10 مللي متر وتخزينه عند -20 درجة مئوية ، محميا من الضوء. إعادة تكوين أنيسوميسين في DMSO إلى 10 ملغ / مل وتخزينها في 4 درجة مئوية ، محمية من الضوء. تخزين جميع مخزونات المثبطات لمدة لا تزيد عن 1 شهر بعد إعادة تشكيلها.
      2. تعديلات المخزن المؤقت: أضف مثبطات في أربعة مخازن مؤقتة مختلفة في البروتوكول على النحو التالي: عند إجراء التروية عبر القلب ، قم بإعداد HBSS مع الأكتينومايسين D (5 ميكروغرام / مل ، 1: 1000 من المخزون) وثلاثي التوليد (10 ميكرومتر ، 1: 1000 من المخزون). بعد التروية ، انقل الأدمغة إلى المختبر في HBSS التي تحتوي على الأكتينومايسين D (5 ميكروغرام / مل ، 1: 1000 من المخزون) ، ثلاثي التوليد (10 ميكرومتر ، 1: 1000 من المخزون) وأنيسوميسين (27.1 ميكروغرام / مل ، 1: 368.5 من المخزون). تحضير المخزن المؤقت FACS مع الأكتينومايسين D (5 ميكروغرام / مل ، 1: 1000 من المخزون) ، ثلاثي التوليد (10 ميكرومتر ، 1: 1000 من المخزون) وأنيسوميسين (27.1 ميكروغرام / مل ، 1: 368.5 من المخزون). تحضير مخزن الهضم مع الأكتينومايسين D (5 ميكروغرام / مل ، 1: 1000 من المخزون) ، تريبتوليد (10 ميكرومتر ، 1: 1000 من المخزون) وأنيسوميسين (27.1 ميكروغرام / مل ، 1: 368.5 من المخزون). قم بإعداد مخزن مؤقت للغسيل بعد الفرز ، مع HBSS يحتوي على الأكتينومايسين D (5 ميكروغرام / مل ، 1: 1000 من المخزون) ، ثلاثي التوليد (10 ميكرومتر ، 1: 1000 من المخزون) وأنيسوميسين (27.1 ميكروغرام / مل ، 1: 368.5 من المخزون).
         ملاحظة: عند إضافة المثبطات ، تأكد من إضافتها مباشرة قبل الاستخدام وحماية أي مخازن مؤقتة معدة من الضوء أثناء الاستخدام. تجنب تجميد ذوبان محاليل المخزون.
   2. غسل ما بعد الفرز: نظرا لأن الخلايا قد تم فرزها إلى أنابيب خالية من RNase سعة 1.5 مل في المخزن المؤقت FACS ، مما سيتداخل مع عزل الحمض النووي الريبي ، فمن الضروري غسل الخلايا. أدر الخلايا عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وأزل المادة الطافية ، تاركا حوالي 50 ميكرولتر من السائل.
   3. أضف 200 ميكرولتر من 1x HBSS يحتوي على أكتينومايسين D (5 ميكروغرام / مل ، 1: 1000 من المخزون) ، ثلاثي التوليد (10 ميكرومتر ، 1: 1000 من المخزون) وأنيسوميسين (27.1 ميكروغرام / مل ، 1: 368.5 من المخزون) واخلطه جيدا. كرر الدوران وإزالة المادة الطافية مع ترك 50 ميكرولتر من السائل (اغسل 1). أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل بعد الفرز ، واخلطه جيدا وكرر الدوران وأزل المادة الطافية تاركا 25 ميكرولتر من السائل (اغسل 2).
   4. استخراج الحمض النووي الريبي: لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الدبقية الصغيرة ، استخدم مجموعة عزل الحمض النووي الريبي منخفضة المدخلات للحصول على إنتاجية عالية ومتسقة من الحمض النووي الريبي ودرجات RIN أعلى من 9 (انظر أدناه وجدول المواد للحصول على توصيات المنتج). إلى حبيبات الخلية ، أضف 350 ميكرولتر من محلول التحلل من المجموعة الموصى بها + β-mercaptoethanol (1: 100) واخلطها جيدا.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن تعليق البروتوكول في هذه المرحلة. يمكن تخزين العينات في المخزن المؤقت للتحلل في -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي. في حالة استخراج الحمض النووي الريبي بعد التخزين ، قم بإذابة المحلول على الثلج وتابع التعليمات الخاصة بالمجموعة للعزل.
   5. انقل المحللة إلى آلة تقطيع الخلايا القائمة على العمود (انظر جدول المواد للحصول على توصيات المنتج) وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة عند 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة. قم بالتخلص من الماء الخالي من RNase في ما لا يقل عن 14 ميكرولتر وتحديد التركيز حسب الاقتضاء. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي لأي تطبيق المصب بعد هذه النقطة.

الشكل 3: استراتيجية البوابات لفرز التدفق. يتم بوابات الأحداث لحجم الخلية على SSC-A مقابل FSC-H (S1). بعد ذلك ، يتم بوابات الخلايا لتكون مفردات على FSC-H مقابل FSC-W (S2). يتم فرز الخلايا المفردة على أنها حية إذا كانت سالبة على Comp-FL8-A :: 405-526-52 (البنفسجي 525 بقعة حية ميتة) و P2RY12 + إذا كانت موجبة على Comp-FL32-A :: 640-671_30 (P2RY12-APC) باستخدام عنصر تحكم P2RY12-isotype. يتم تصنيف الخلايا على أنها MG ويتم فرزها إذا كان كلاهما حيا و P2RY12 +. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

السكان المسورة	تواتر الوالدين	تواتر المجموع	عد
م1	68.10%	68.10%	162186
S2>S1	93.59%	63.70%	151707
P2Ry12+ (670+) > S2 > S1	83.05%	52.90%	125986
مباشر (525-) > S2 > S1	92.78%	59.10%	140752
إم جي (P2RY12 + لايف) >S2>S1	78.96%	50.30%	119794

الجدول 1: مثال على جدول نسب نموذجي مع نسب البوابات وأرقام الأحداث المتوقعة.

2. تلطيخ التدفق داخل النواة لتحليل التعبير عن البروتين

ملاحظة: يمكن بدء أنواع الخلايا الأخرى في هذه المرحلة ، يتم اختبار هذا البروتوكول مع الخلايا المستزرعة بما في ذلك خلايا HEK293 والخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة BV2 والخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من IPSC البشرية.

1. تثبيت وتلطيخ الخلايا
   ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول التالي ، استخدم مجموعة تلطيخ داخل الخلايا محسنة للتلطيخ النووي. رأى جدول المواد لتوصيات المنتج.
   1. الخلايا الملطخة خارج الخلية من القسم 1.5.2 إلى 96 لوحة بئر (5 × 10⁴- 1 × 10⁶ خلايا). قم بتدوير الخلايا لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية ثم قم بنفض الغبار لإزالة المخزن المؤقت FACS.
      ملاحظة: للحصول على بيانات ذات ثقة عالية من المستويات المتوسطة ، يجب استخدام ما لا يقل عن 10000 خلية لكل بئر. على الرغم من عدم وجود حد أقصى موصى به ، فمن الأفضل الحفاظ على عدد الخلايا ثابتا طوال التجربة لضمان عدم وجود تأثير كبير لمعامل الاختلافات المختلفة (CV).
   2. التثبيت والنفاذية: أضف 200 ميكرولتر من 1x مثبت التركيز واخلطه برفق مع ماصة P200 لإعادة تعليق الخلايا. احتضان في الظلام لمدة 45-60 دقيقة. لوحة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) ونفض الغبار للتخلص من المادة الطافية.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن تعليق البروتوكول في هذه المرحلة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت طويل الأجل للخلايا المناعية (انظر جدول المواد للحصول على توصيات المنتج). يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 12-18 ساعة ، محمية من الضوء ومغطاة بغشاء شفاف لحماية تبخر المخزن المؤقت.
   3. أضف 200 ميكرولتر من 1x عازلة نفاذية لكل بئر وماصة مع P200 للخلط. لوحة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم في RT ونفض الغبار للتخلص من المادة الطافية. كرر العازلة نفاذية غسل ما مجموعه 3x.
   4. إعداد ضوابط التدفق: تقسيم حجم الخلايا من كل عينة لعناصر التحكم في التدفق المطلوبة (يكفي 10000-30000 خلية لكل بئر تحكم).
      1. لتحضير التحكم في عدم وجود بقع ، قم بتثبيت الخلايا الخالية من البقع من الخلايا غير الملوثة من النوع أو القسمة في بئر منفصل لن يتلقى أي جسم مضاد.
      2. لتحضير عنصر التحكم الفلوري ناقص واحد (FMO) ، خلايا القسمة لكل من الأجسام المضادة على اللوحة باستثناء تلك الموجودة في تلك القناة.
      3. بالنسبة للقنوات ذات الصلة ، قم بتضمين الجسم المضاد للتحكم في النمط المتماثل في FMO للبوابة. على سبيل المثال ، في لوحة تحتوي على P2RY12-APC و H3K27Ac-AlexaFluor568 - يجب أن يكون هناك نوعان من FMOS: (1) APC-FMO الذي يحتوي فقط على H3K27Ac-AlexaFluor568 والجسم المضاد للتحكم في النمط المتماثل P2RY12 و (2) 568-FMO الذي يحتوي فقط على P2RY12-APC والتحكم في النمط المتماثل الأساسي و 568 الثانوي.
         ملاحظة: يتم تقديم هذا البروتوكول لاختبار HPTM واحد ، ولكن يمكن إنشاء لوحات تحتوي على العديد من HPTMs مترافقة مع فلوروفورات مختلفة.
   5. تلطيخ الأجسام المضادة الأولية: أضف 50 ميكرولتر من محلول النفاذية 1x مع التركيز المناسب للأجسام المضادة الأولية لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. اغسل 2x ب 200 ميكرولتر من 1x عازلة للنفاذ.
      ملاحظة: يتم تضمين تركيز الأجسام المضادة المستخدمة لكل HPTM في جدول المواد. يتم تحديد التركيز عن طريق اختبار تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة على الخلايا المستزرعة المعالجة بمنبه من شأنه أن يسبب زيادة كبيرة ، على سبيل المثال ، مثبط HDAC لعلامات أستلة وضمان أن كل من الخلايا غير المعالجة والمعالجة كانت ضمن نطاق الكشف (فوق التحكم في النمط المتماثل وأقل من نطاق الكشف الأقصى لمقياس الخلايا). يجب أن يكون لتركيز الأجسام المضادة الأمثل ل HPTMs متوسط كثافة الفلورسنت في قناة الفلوروفور بين 5 × 10⁴ و 1 × 10⁵.
   6. تلطيخ الجسم المضاد الثانوي: كتلة مع 200 ميكرولتر من 1x العازلة نفاذية مع 2٪ مصل الحمير العادي (NDS) لمدة 10 دقائق في RT. تدور لمدة 5 دقائق عند 500 × غرام في RT وانقر لإزالة المادة الطافية.
   7. أضف 50 ميكرولتر من 1x عازلة نفاذية مع 2٪ NDS والتركيز المناسب للأجسام المضادة الثانوية واحتضانها لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. أضف 200 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للنفاذ إلى الآبار لتخفيفها ، وطرد مركزي اللوحة لمدة 5 دقائق عند 500 × جم في RT ، ونفض الغبار للتخلص من المادة الطافية. اغسل الخلايا 2x مع 200 ميكرولتر من 1x العازلة للنفاذ.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بتعليق البروتوكول في هذه المرحلة. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من مخزن التخزين طويل الأجل للخلايا المناعية باستخدام ماصة P200 (انظر جدول المواد للحصول على توصيات) وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة 12-24 ساعة محمية من الضوء.
   8. التحضير لقياس التدفق الخلوي: لوحة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم في RT ونفض الغبار للتخلص من المادة الطافية. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS باستخدام ماصة P200 لقياس التدفق الخلوي. ختم مع فيلم شفاف للنقل إلى مقياس الخلايا.
2. قياس التدفق الخلوي
   1. لتحليل لوحة الأجسام المضادة المقترحة ، تأكد من أن مقياس الخلايا مزود بأربعة ليزر على الأقل بما في ذلك البنفسجي (405 نانومتر) والأزرق (488 نانومتر) والأصفر (561 نانومتر) والأحمر (633 نانومتر). يحتاج مقياس الخلايا إلى مرشحات للكشف عن FITC (أزرق 525 نانومتر) ، KRO (بنفسجي 525 نانومتر) PE (أصفر -585 نانومتر) ، و APC (أحمر -660 نانومتر). أضف أجساما مضادة إضافية اعتمادا على مقياس الخلايا المختار.
   2. المعايرة والتوحيد القياسي: في بداية كل تجربة ، قم بتشغيل حبات الفلورسنت قوس قزح واضبط جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) حتى تصبح قمم الخرزة قابلة للمقارنة مع القيم المستهدفة التي تم تشغيلها للتجارب السابقة. تسمح طريقة التوحيد هذه باستيعاب انجراف المعدات بمرور الوقت.
   3. التعويض: بعد ضبط جهد وكسب PMT للتجربة ، استخدم حبات التعويض الملتقطة بالأجسام المضادة لإنشاء مصفوفة التعويض للوحة الأجسام المضادة. سيضمن هذا الحساب أن الفلوروفورات لا تساهم في تغييرات الإشارة في القنوات الأخرى. هذا ضروري بشكل متزايد عند تعدد إرسال أجسام مضادة متعددة.
   4. بوابة الحجم: في مخطط نقطي ، ارسم SSC-A على السجل مقابل FSC-H على الخطية. قم بإخراج الحطام وحدد حجم الخلية باستخدام بوابة S1. حدد للخلايا المفردة في مخطط نقطي ل FSC-W مقابل FSC-H والبوابة ك S2. (الشكل 4).
   5. إنشاء بوابات الفلوروفور: باستخدام FMO ذات الصلة لكل قناة فلوروفور ، قم بإنشاء البوابات لتحديد ما هي الإشارة الإيجابية في كل قناة باستخدام الرسوم البيانية ذات المعلمة المفردة (الشكل 4).
   6. قياس العينات: سجل العينات بعناية باستخدام استراتيجية البوابات المعمول بها. تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام إشارة P2RY12 + ، وتحديد التعبير عن البروتين في القنوات المعنية للخلايا الدبقية الصغيرة فقط.
3. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
   1. إنشاء بوابات التحليل: باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه لمقياس الخلايا على واجهة مستخدم برنامج التحليل ، استخدم نفس البوابات المستخدمة للتسجيل للتحليل.
   2. الحصول على قيم MFI باستخدام برنامج تحليل التدفق الخلوي (انظر جدول المواد للحصول على توصيات): تلخيص استراتيجية بوابة مقياس الخلايا لتحليل التدفق. باستخدام وظيفة إضافة إحصائيات، حدد الوسيط للسكان محل الاهتمام (على سبيل المثال، 568+) على ارتفاع القناة المعوضة. باستخدام محرر الجدول ، قم بتصدير قيم متوسط كثافة الفلورسنت (MFI) للقنوات المعنية إلى جدول بيانات لمتابعة التحليل الإحصائي (الجدول 2).
      ملاحظة: يتضمن الملف التكميلي S1 أمثلة على بيانات من عديد السكاريد الشحمي (LPS) والفئران المحقونة بالمحلول الملحي الفوسفات (PBS) وملف تحليل مثال مع استراتيجية البوابات وقيم MFI.
   3. تحليل قيم MFI لتغيير طية البروتين: بعد الحصول على قيم MFI ، احسب تغير طية MFI بالنسبة إلى المجموعة الضابطة أو السكان غير المعالجين (المعادلة 1). يعكس تغيير طية MFI تغير الطي في مستويات البروتين. باستخدام قيم تغيير الطي ، قم بتقييم التغيير في التعبير وحساب الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t أو ANOVA.
      المعادلة 1

الشكل 4: استراتيجية البوابات لتقييم بروتين MFI. يتم إغلاق الأحداث أولا لحجم الخلية على SSC-A مقابل FSC-H (S1). ثم يتم بوابات الخلايا للمفردات على FSC-H مقابل FSC-W (S2). ثم يتم تحديد الخلايا المفردة على أنها خلايا دبقية صغيرة بواسطة إشارة P2RY12-APC (APC +) مع إنشاء البوابة بناء على التألق في عنصر تحكم APC-FMO الذي يحتوي على جسم مضاد للتحكم في النمط المتماثل. ثم يتم بوابات الخلايا لإشارة H3K27Ac-AlexaFluor568 على Comp-FL5-A :: Y610-mCherry. يتم تحديد شدة الفلورسنت لخلايا 610+ كوكيل للتعبير عن البروتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Results

تم تفريط الفئران البالغة عبر القلب والتضحية بها من أجل عزل الخلايا الدبقية الصغيرة. تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة على الجليد وصبغها بالأجسام المضادة الحية الميتة P2RY12-APC والبنفسجي 525. تم فرز الخلايا التي تم تحديدها على أنها إيجابية ل P2RY12 وسالبة للبقعة الميتة الحية البنفسجية 525 على أنها خلايا دبقية صغيرة حية. كان متوسط إنتاج الخلايا الدبقية الصغيرة من دماغ الفأر المشريح 1.28 × 10⁵ ± 0.05 (متوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) ، N = 100). لا يوجد فرق في محصول الخلايا الدبقية الصغيرة من الإناث (1.25 × 10⁵ ± 0.09 [المتوسط ± SEM ، N = 46]) والذكور (1.32 × 10⁵ ± 0.07 [المتوسط ± SEM ، N = 54]) الفئران (t (98) = 0.6365 ، p = 0.526). عند العزل من مناطق معينة من الدماغ ، يكون متوسط إنتاج الخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة الفئران 8.3 × 10⁴ ± 0.08 (متوسط ± SEM ، N = 15) ومن قرن آمون الفأر هو 4.1 × 10⁴ ± 0.02 (متوسط ± SEM ، N = 16). كما هو متوقع ، هناك فرق كبير في محصول الخلايا الدبقية الصغيرة من كل منطقة دماغية (F (2 ، 128) = 25.25 ، P<0.0001). بعد عزل الخلايا الدبقية الصغيرة ، تم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا المعزولة باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي منخفضة المدخلات. كانت درجة سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) باستمرار أعلى من 9.0 (9.62 ± 0.05) وكان متوسط عائد الحمض النووي الريبي لكل خلية 0.25 ± 0.01 بيكوغرام (المتوسط ± SEM ، N = 32 ؛ الملف التكميلي S2).

تم حقن الفئران البالغة داخل الصفاق ب 1 مجم / كجم من عديد السكاريد الدهني (LPS) قبل 24 ساعة من التضحية. تم ترشيح الفئران عبر القلب مع HBSS ، وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الدماغ كله وفقا للبروتوكول الموصوف (الشكل 5A). لكل بقعة ، تم تخصيص 20000-30000 خلية لكل لوحة من الأجسام المضادة. تم تقييم المستويات العالمية لأسيتيل هيستون 3 ليسين 27 (H3K27Ac) في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة عن طريق قياس التدفق الخلوي. بالنسبة للذكور والإناث من الفئران ، تسبب علاج LPS في زيادة H3K27Ac عندما يتم تطبيع MFI داخل الجنس (t (6) = 9.676 ، p<0.0001 ؛ الشكل 5 ب). عند فحص الرسوم البيانية للخلايا الملطخة ، تظل المجموعات موزعة بشكل طبيعي مع اختلاف مماثل. ومع ذلك ، فقد تحولت الخلايا إلى زيادة مضان مما أدى إلى زيادة في MFI (الشكل 5C). عند فحص H3K9Ac في نفس العلاج ، هناك زيادة مماثلة في H3K9Ac (t (6) = 7.299 ، p = 0.0003 ؛ الشكل 5D ، E) ومع ذلك ، فإن تغيير طية LPS بالنسبة إلى PBS لإشارة H3K9Ac أقل من إشارة H3K27Ac.

الشكل 5: التغيرات العالمية في أستلة الهستون في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة. (أ) يتم حقن الفئران داخل الصفاق بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو 1 مجم / كجم من عديد السكاريد الدهني (LPS) قبل 24 ساعة من التضحية. يتم جمع الخلايا الدبقية الصغيرة من الجزء المخصب المناعي ويتم تثبيتها لقياس التدفق الخلوي وتقييم تعديل هيستون العالمي بعد الانتقالية. يتم تقييم متوسط كثافة الفلورسنت كبديل لتعبير البروتين. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. (ب) زادت المستويات العالمية من H3K27Ac استجابة لعلاج LPS. أضعاف التغيير إلى PBS تطبيع داخل التجربة والجنس. اختبار t ثنائي الذيل غير المزاوج ، t (6) = 9.676 ، p<0.0001. يصور الرسم البياني الشريطي متوسط ± SEM. N = 8 ؛ 2 لكل حالة في تجربتين مستقلتين. (ج) مثال على الرسوم البيانية التي تصور تحول شدة الفلورسنت H3K27Ac. يصور Modal الرسوم البيانية من الفئران المحقونة ب PBS مقابل الفئران المحقونة ب LPS. (د) مثال على الرسوم البيانية التي تصور تحول شدة الفلورسنت H3K9Ac. يصور Modal الرسوم البيانية من الفئران المحقونة ب PBS مقابل الفئران المحقونة ب LPS. (ه) زادت المستويات العالمية من H3K9Ac استجابة لعلاج LPS. أضعاف التغيير إلى PBS تطبيع داخل التجربة والجنس. اختبار t ثنائي الذيل غير المزاوج ، t (6) = 7.299 ، p = 0.0003. يصور الرسم البياني الشريطي متوسط ± SEM. N = 8 ؛ 2 لكل حالة في تجربتين مستقلتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

للتأكد من أن الطريقة الموصوفة كانت قابلة للمقارنة مع الطرق الأخرى المستخدمة سابقا لقياس كمية تعديل الهستون العالمي ، كنا نهدف إلى استخدام اللطخة المناعية كأداة مقارنة. ومع ذلك ، فإن العائد من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة هو ببساطة منخفض للغاية بحيث لا يمكن إجراء تقييم معقول. لذلك ، استخدمنا خلايا BV2 المستزرعة لمقارنة طريقة قياس التدفق الخلوي داخل الخلايا باللطخة الغربية (WB). نمت خلايا BV2 في وسائط كاملة (DMEMF12 ، 10٪ FBS ، 1x بنسلين / ستربتاميسين ، و 1x L-glutamine) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂. تم تمرير الخلايا بنسبة 0.25٪ من التربسين-EDTA ومطلية بكثافة 250000 خلية / بئر ومعالجتها في وسائط مصل مخفضة (DMEM F12 ، 2٪ FBS ، 1x بنسلين / ستربتاميسين ، و 1x L-glutamine) وسمح لها بالتعافي لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂. تمت معالجة الخلايا ب 25 نانوغرام / مل LPS لمدة 24 ساعة قبل التثبيت كما هو موضح أعلاه أو التحلل باستخدام مخزن مؤقت لتحلل WB. تم تنفيذ إشارة H3K27Ac بكلتا الطريقتين مع استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل ل WB. تم تحديد تحليل شدة الفلورسنت الطبيعية مقارنة بمراقبة PBS لكل مجموعة (الشكل 6 أ). عند فحص التغيير في إشارة H3K27Ac الطبيعية بواسطة WB ، كانت هناك زيادة بمقدار 1.527 ضعفا في حالة معالجة LPS بالنسبة إلى عنصر التحكم H₂O الذي تم تحديده على أنه مهم من خلال اختبار t غير المزاوج (t = 3.024 ، df = 5 ؛ p = 0.0293). عند فحص التغيير باستخدام قياس التدفق الخلوي ، كانت هناك زيادة بمقدار 1.482 ضعفا في الحالة المعالجة LPS والتي تم تحديدها على أنها كبيرة (t = 7.843 ، df = 10 ؛ p<0.0001). باستخدام 2-way ANOVA لمقارنة الطرق ، تم تحديد أن يكون هناك تأثير كبير للعلاج (F (1،15) = 45.21 ، p < 0.0001) ، ولكن ليس الطريقة (F (1،15) = 0.05545 ، p = 0.8697) أو التفاعل (F (1،15) = 0.02785 ، p = 0.8697). بالإضافة إلى ذلك ، نتحقق هنا من عدم وجود تغيير في مستويات هيستون H3 من خلال كل من اللطخة الغربية وقياس التدفق الخلوي حيث كشف 2-way ANOVA عن عدم وجود تأثير كبير لعلاج LPS (F (1،7) = 0.02170 ، p = 0.8870) ، الطريقة (F (1،7) = 0.01191 ، p = 0.9162) أو التفاعل (F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162 ؛ F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162 ؛ F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162 ؛ F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162 ؛ F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162 ؛ F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162 ؛ F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162 ؛ F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162 ؛ F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162 الشكل 6 ب). يتم عرض أمثلة على البقع وتحولات الرسم البياني لهذه البيانات أيضا (الشكل 6C ، D).

الشكل 6: مقارنة طريقة القياس الكمي لتغير تعديل الهستون العالمي بين قياس التدفق الخلوي واللطخة الغربية. (أ) تعالج خلايا BV2 باستخدام عديد السكاريد الدهني 25 نانوغرام/مل (LPS) أو H₂O لمدة 24 ساعة قبل التحليل. تم تصوير شدة الفلورسنت ل H3K27Ac على أنها تغيير في الطي للتحكم في السيارة ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، لكل من قياس التدفق الخلوي واللطخة الغربية. كشف 2-way ANOVA عن تأثير معنوي لعلاج LPS (F (1،15) = 45.21 ، p<0.0001) ، ولكن ليس الطريقة (F (1،15) = 0.05545 ، p = 0.8697) أو التفاعل (F (1،15) = 0.02785 ، p = 0.8697). تم تطبيق تصحيح توكي لاختبار فرضيات متعددة على البقايا. * يقدم 0.0332 ، ** يقدم 0.0021. (ب) توصف شدة الفلورسنت للهيستون H3 بأنها تغير في الطي إلى PBS لكل من قياس التدفق الخلوي واللطخة الغربية. لم يكشف ANOVA ثنائي الاتجاه عن أي تأثير معنوي لعلاج LPS (F (1،7) = 0.02170 ، p = 0.8870) أو الطريقة (F (1،7) = 0.01191 ، p = 0.9162) أو التفاعل (F (1،7 = 0.01191 ، p = 0.9162). (ج) أمثلة على البقع و(د) تحولات قياس التدفق الخلوي. يتم تسوية حجم الرسم البياني إلى النسبة المئوية بناء على عدد الخلايا الموجودة في شدة الفلورسنت في الوضع. يصور الرسم البياني الشريطي متوسط SEM. n = 2 تجارب مستقلة ، 2 لكل شرط لكل تجربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تظهر هذه النتائج مجتمعة أنه يمكن استخدام هذه التقنية لتقييم مستويات HPTM العالمية كميا في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة. بالإضافة إلى ذلك ، تبين أن الطريقة قابلة للمقارنة مع التقنيات السابقة ولكنها تتطلب مدخلات خلية أقل بكثير. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من عدم ظهورها ، مع التعويض المناسب ، يمكن استخدام التقنية الحالية مع أجسام مضادة متعددة على نفس اللوحة لتقييم HPTMs المختلفة.

الملف التكميلي S1: مثال على ملفات التحليل. يحتوي هذا الملف على ملف تحليل wsp وملفات 7 fcs بما في ذلك عدم وجود بقع ، P2RY12FMO ، 568FMO ، حيوانان معالجان ب PBS وحيوانان معالجان ب LPS ملطختان ب H3K27Ac. الغرض من هذا الملف هو إظهار التحليل والبوابة على تجربة يمكن أن تصور كيف تبدو التجربة الناجحة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي S2: بيانات العزل. يحتوي الملف المتضمن على البيانات ذات الصلة بعد فرز الخلايا الدبقية الصغيرة التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة وعائد الحمض النووي الريبي من البروتوكول الموصوف. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

السكان المسورة	تواتر الوالدين	تواتر المجموع	عد
م1	89.00%	89.00%	25672
S2>S1	88.73%	78.97%	22779
APC+ > S2 > S1	76.61%	60.50%	17452
610+ > APC+ > S2 > S1	99.56%	60.24%	17376

الجدول 2: مثال على نموذج مخطط النسب يصور النسبة المئوية وأرقام الأحداث المطلوبة للكشف الدقيق عن البروتين.

Discussion

يتيح البروتوكول المقدم التقييم الكمي لمستويات HPTM العالمية من خلال قياس التدفق الخلوي. في حين أن هذا البروتوكول يقدم طريقة جديدة ، فقد أجرت الدراسات السابقة تقييما كميا للبروتينات باستخدام نهج مماثل²⁶. تشمل الطرق السابقة المستخدمة لتقييم المستويات العالمية ل HPTMs الكيمياء الهيستولوجية المناعية واللطخة الغربية^{16،17،19،20}. الطريقة القائمة على قياس التدفق الخلوي المقدمة هي طريقة قابلة للقياس الكمي بسهولة ، في حين أن اللطخة الغربية والكيمياء الهيستولوجية المناعية شبه كمية ولها إنتاجية أقل. تعتمد اللطخة الغربية على تحلل الخلايا وبالتالي تتطلب كلا من تطبيع البروتين وبروتين التحكم في التحميل الذي يفترض أنه لم يتغير بسبب الحالة التجريبية²⁷. الكيمياء الهيستولوجية المناعية شبه كمية وإنتاجية منخفضة للغاية حيث يصعب تقييم كمية البروتين كميا دون فحص مستوى خلية^{واحدة 16}. وبالمثل ، بالنسبة للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة ، هناك فائدة لاستخدام طريقة قياس التدفق الخلوي بسبب العائد المحدود لأن اللطخة الغربية تتطلب مدخلات بروتين أكبر بكثير¹⁹. تسمح متطلبات رقم الخلية المنخفض بتشغيل ألواح تلطيخ متعددة من نفس.

ومع ذلك ، كما هو الحال مع أي طريقة أخرى ، هناك قيود على هذه التقنية بما في ذلك تكلفة الأجسام المضادة وتوافرها ، حيث لا تعمل جميع الأجسام المضادة بشكل جيد في إعداد قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع اللطخة المناعية ، فإن تركيز الأجسام المضادة المطلوبة أعلى بكثير. بينما يسمح تعدد الإرسال باستخدام أجسام مضادة متعددة على نفس لوحة الخلايا ، لا يمكن تجريد الخلايا من الجسم المضاد بعد التحليل ، مما يحد من استخدام الخلية إلى واحد لكل نوع من أنواع الأجسام المضادة. هذا يختلف عن اللطخة المناعية التي يمكن فيها استخدام نفس اللطخة بشكل متكرر. ومع ذلك ، اعتمادا على توافر الأجسام المضادة وعدد قنوات الكشف على مقياس الخلايا ، سيكون من الممكن فحص ما يصل إلى اثنتي عشرة علامة في وقت واحد.

تلتقط الطريقة الحالية المستويات العالمية فقط من التعبير عن البروتين وليس الموقع الجينومي المحدد ، وقد لا تعكس التغييرات في المستويات العالمية التغييرات في المواقع الجينومية الفردية. وبالمثل ، قد لا يعني عدم حدوث تغيير في المستويات العالمية أنه لا توجد مواقع جينومية تخضع لتغييرات ، ببساطة أن التغييرات العالمية لا تجمع أي اختلافات بين العلاجات. على هذا النحو ، تهدف هذه التقنية إلى استخدامها كشاشة لتحديد HPTMs ذات الأهمية للتحليل الجينومي. بالإضافة إلى ذلك ، لا تسمح هذه الطريقة بالمقارنة عبر علامات البروتين المختلفة إلا عند تقييمها على أنها تغيير أضعاف التحكم. لذلك ، هذا محدود مقارنة بالطريقة القياسية القائمة على المنحنى مثل ELISA لتحديد البروتين.

يقدم البروتوكول المقدم استراتيجية لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الحية في الدماغ. يعتمد هذا البروتوكول على تعبير بروتين P2RY12 لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة. ومع ذلك ، فإن P2RY12 هي علامة استتبابية في الخلايا الدبقية الصغيرة ويمكن تنظيمها في نماذج الأمراض ، مثل 5XFAD²². لذلك ، عند استخدام نموذج المرض ، تأكد من اختيار بروتينات علامة أخرى مثل TMEM119 أو CD11b أو CD45 للمساعدة في عزل الخلايا الدبقية^{الصغيرة 23}. وبالمثل ، نقدم هذا البروتوكول على أنه عزل عن الحصين و / أو القشرة. سيعمل هذا البروتوكول على عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن مناطق الدماغ الأخرى بما في ذلك مناطق المادة البيضاء ، ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى متعددة للحصول على ما يكفي من الخلايا الدبقية الصغيرة اعتمادا على حجم المناطق المعنية.

يمكن للبروتوكول المقدم أن يعزل بقوة الخلايا الدبقية الصغيرة الحية في الدماغ ، ولكن هناك عدة خطوات ، موصوفة أدناه ، في مرحلة العزل يمكن أن تقلل من إنتاج الخلايا إذا تم إجراؤها بشكل غير صحيح.

يؤدي الإرواء لهذا البروتوكول إلى نسبة أعلى من الخلايا الدبقية الصغيرة في الجزء المخصب المناعي مما يقلل من مقدار الوقت في الفرز. ومع ذلك ، فإن التروية غير مطلوبة ، ويمكن استخدام طرق أخرى للقتل الرحيم إذا لزم الأمر.

أثناء عزل الخلايا الدبقية الصغيرة ، يجب إزالة المايلين بالكامل. تعتمد مقاييس التدفق الخلوي على قدرة الخلايا على الانتقال عبر الأنابيب الضيقة بوتيرة سريعة. بسبب لزوجته وميله إلى التكتل ، يسبب المايلين مشاكل في أجهزة قياس الخلايا ، وغالبا ما يتسبب في حدوث انسدادات يمكن أن تلحق الضرر بالمعدات وتدمر العينة ، مما يقلل من العائد بشكل كبير. كن حذرا لإزالة كل المايلين أثناء جمع الشظايا المخصبة بالمناعة لتجنب حدوث مشاكل في اتجاه مجرى النهر.

تلطيخ الألواح مقابل تلطيخ الأنبوب: في هذا البروتوكول ، وصفنا خيارين لتلطيخ الخلايا إما في أنابيب سعة 1.5 مل أو لوحة بئر 96. تعتمد حالة الاستخدام لكل منها على التجربة ؛ ومع ذلك ، فإن تلطيخ الأنبوب بشكل عام هو خطر أقل للتأثير على المحصول من تلطيخ اللوحة لأن النقر يخاطر بفقدان الخلايا إذا تم القيام به بشكل غير صحيح. تلطيخ اللوحة أسرع بكثير لأن استنشاق المادة الطافية لكل أنبوب يستغرق وقتا طويلا. قبل التثبيت (للفرز ، وما إلى ذلك) ، استخدم تلطيخ الأنبوب لزيادة العائد وتقليل مخاطر الخسارة. ومع ذلك ، بالنسبة لتحليل HPTM ، بمجرد تثبيت الخلايا للتلطيخ داخل النواة ، تكون الحبيبات أكثر استقرارا ، وهناك خطر أقل للفقدان مع النقر.

إنشاء تدرج الكثافة المتقطع: عند إنشاء الطبقات ، يعد إعداد الطبقات بشكل صحيح أمرا ضروريا للحصول على الجزء المخصب بالمناعة. إذا كانت الطبقات مضطربة أو مختلطة وظهرت غائمة ، فلن يتم فرز الخلايا إلى الموقع المطلوب ، وستكون هناك صعوبة في الحصول على جزء الخلية المخصب بالمناعة. في حالة حدوث ذلك ، قم بالدوران باستخدام وسط الكثافة لإزالة المايلين ثم اجمع الأجزاء المتبقية بالكامل ، وقم بتخفيفها باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت FACS إلى 1 مل من وسط الكثافة واخلطها جيدا (سيتطلب ذلك أنابيب متعددة). تدور عند 500 × جم لمدة 10 دقائق مع تشغيل الفرامل 0. تخلص من المادة الطافية ، ولم يتبق سوى محلول ~ 300 ميكرولتر. جمع العينة بأكملها وصمة عار. سينتج عن ذلك نسب فرز مخفضة ومقدار أكبر من الوقت المستغرق في مقياس الخلايا ، ولكن لا يزال من الممكن أن يكون العائد قابلا للمقارنة.

عند استخدام طريقة العزل ، من المفيد أن تكون قادرا على جمع الخلايا للحمض النووي الريبي ولتقييم HPTM من نفس دماغ الفأر. في هذه الحالة ، بعد فرز الخلايا الدبقية الصغيرة الحية ، يمكن تقسيم الخلايا لتخصيص جزء لتقييم الحمض النووي الريبي (الحد الأدنى لعدد مدخلات الخلايا للحصول على عائد لائق من الحمض النووي الريبي هو 75000 خلية) وجزء لمزيد من تحليل قياس التدفق الخلوي (الحد الأدنى 10000 خلية لكل بئر لتحديد جيد ل MFI). في هذه الحالة ، مطلوب فرز مقياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، عند التخطيط فقط لاستخدام الخلايا لتحليل HPTM ، لا يلزم الفرز ، ويمكن تلطيخ الجزء المناعي بالجسم المضاد P2RY12 والجسم المضاد HPTM. يمكن بعد ذلك ضبط البوابات على مقياس الخلايا الخلوية للخلايا الدبقية الصغيرة P2RY12 + ، كما هو الحال بالنسبة لفرز التدفق ، لتحليل إشارة HPTM فقط داخل الخلايا الدبقية الصغيرة. يسمح التخلص من الفرز بأن يكون البروتوكول أسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان تقييم HPTMs من الخلايا المستزرعة ، فإن البدء من بروتوكول التلوين كاف ولا يلزم وجود أجسام مضادة لعلامة الخلية كما هو موضح في الشكل 6. يمكن استخدام بروتوكول تقييم HPTM للعديد من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا المستزرعة والأولية والمشتقة من IPSC.

أخيرا ، بينما قدمنا استخدامين محتملين فقط للخلايا الدبقية الصغيرة في اتجاه مجرى العزل ، هناك العديد من الاستخدامات الأخرى بما في ذلك التقنيات اللاجينية مثل ChIP و CUT &Tag و CUT &RUN. في حالة التقنيات اللاجينية الجينومية ، حيث يكون توصيف التغييرات في مواقع معينة أمرا مهما ، اختر مثبطات محددة لكتاب وممحاة علامات^{الكروماتين 11} المصممة خصيصا للتجارب للتأكد من أن أي تعديلات جينية دبقية صغيرة ليست قطعا أثرية تقنية من أي خطوات في إجراء العزل مثل الهضم الأنزيمي. عند تقييم التغيرات في المستويات العالمية للعلامات اللاجينية ، مثل استخدام قياس التدفق الخلوي الكمي ، لا يتوقع أن تكون أي تغييرات ناتجة عن الإجراء كبيرة بحيث يتم اكتشافها على المستوى العالمي.

بشكل عام ، توفر الطرق التي تمت مناقشتها طريقة جديدة أحادية الخلية لتحديد المستويات العالمية لتعديلات الهستون والتغيرات اللاجينية الأخرى عن طريق قياس التدفق الخلوي. لقد أثبتنا أن هذه الطريقة حساسة بما يكفي للكشف عن التغيرات العالمية في علامة المحسن H3K27ac في الخلايا الدبقية الصغيرة استجابة ل LPS في الجسم الحي. يتوافق هذا مع تسلسل ChIP السابق ل H3K27ac بعد تحفيز LPS الذي يظهر إعادة عرض دراماتيكية للمحسنات التي تستجيب ل LPS²⁸. ستسمح تطبيقات هذه الطريقة بفحص التغيرات اللاجينية العالمية عبر أنواع مختلفة من خلايا الدماغ في التطور والمرض.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	AM9260G
15 مل Falcon أنابيب الطرد المركزي ، البولي بروبيلين ، المعقمة & nbsp ؛	Falcon	352196
24 بئر Clear Not Processing Plates	Costar	3738
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
96 WellClear Polystyrene Microplate ، قاع دائري شفاف ، سطح غير معالج	Corning	3788
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11)	تقنية إشارات الخلية	9649S	التخفيف: 1: 100
أسيتيل هيستون H4 K8 (2594)	تقنية إشارات الخلية	2594S	التخفيف: 1: 100
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4)	تقنية إشارات الخلية	8173S	التخفيف: 1: 100
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516)	Invitrogen	MA523516	التخفيف: 1: 100
Actinomycin D	New England Biolabs	15021S
Anisomycin	New England Biolabs	2222S
مضاد هيستون H3 (ثلاثي ميثيل K4)	Abcam	ab213224	التخفيف: 1:100
مضاد لللاكتيل هيستون H4 (Lys 12) أرنب mAb	PTM Biolabs	PTM-1411RM	التخفيف: 1:250
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb	PRM Biolabs	PTM-1401RM	التخفيف: 1:250
APC الأجسام المضادة المضادة ل P2RY12 ، الاستنساخ: S16007D	BioLegend	848006
BSA	Tocris	5217
Cyto-Last Buffer	BioLegend	422501
ثنائي ميثيل سلفوكسيد ،	تقنية إشارات الخلية	12611S
DNAse I	STEMCELL Technologies	07900
الحمار المضاد للفأر AlexaFluor488	Jackson ImmunoResearch	715-546-150	التخفيف: 1: 500
الحمار المضاد للأرانب AlexaFluor488	أ	النسيلي AS035	: 1:500
الحمار المضاد للأرانب AlexaFluor568	Invitrogen	A10042	التخفيف: 1:500
الحمار المضاد للأرانب البنفسجي اللامع 421	BioLegend	406410	التخفيف: 1:500
ماصات النقل المتدرجة المتاح Fisherbrand		Fisherbrand 13-711-9AM
Fisherbrand وحدة تصفية PES القابل للتصرف ، 250 مل & nbsp ؛	فيشربراند	FB12566502
H3K18ac الأجسام المضادة متعددة النسيلة	Invitrogen	720095	التخفيف: 1: 100
HBSS (10X) ، خال من الكالسيوم ، لا مغنيسيوم ، لا فينول أحمر	Gibco	14185052
HBSS ، بدون كالسيوم ، خال من المغنيسيوم ، لا الفينول الأحمر	Gibco	14175103
هيستون 3 ثلاثي ميثيل K27 (ab6002)	Abcam	ab6002	التخفيف: 1: 100
مطاحن المناديل الورقية KONTES Dounce 125 مم 7 مل & nbsp ؛	VWR	885300-0007
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb	PTM BIolabs	PTM-1406RM	التخفيف: 1: 250
Lipopolysacharide   ؛	Sigma-Aldrich	L5418
مصل الحمار	العادي Jackson ImmunoResearch	017-000-121
OneComp eBeads تعويض	الخرز Invitrogen	01-1111-41
PDS Kit ، قارورة غراء - ورثينجتون بيوكيمياء	سيدارلين	LK003178
بيركول	سيجما ألدريتش	GE17-0891-02
فينول أحمر	VWR	RC57004
QIAshredder	Qiagen	79656
جسيمات قوس قزح الفلورية ، 1 ذروة (3.0-3.4 ميكرومتر -	BioLegend	422905
أنابيب الطرد الدقيق الخالية من RNase ، 1.5 مل	Invitrogen	AM12400
Rneasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
أنابيب البولي بروبلين ذات القاع المستدير مع أغطية ، 5 مل	كورنينج	352063
تريبتوليد	نيو إنجلاند بيولابس	97539
عامل النسخ النووي الحقيقي	مجموعة العازلة BioLegend	424401
TruStain FcX PLUS (مضاد للفأر CD16 / 32) الأجسام المضادة	BioLegend	156604
Trypan Blue	VWR	97063-702
مجموعة الزومبي أكوا القابلة للإصلاح	BioLegend	423102