يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

القياس الكمي لتكاليف اللياقة البدنية في بعوض الزاعجة المصرية المعدلة وراثيا

1.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65136

⸱

سبتمبر 15, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Vector-borne Infectious Diseases, Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 4National Center for Microbiology, Instituto de Salud Carlos III

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول كيفية قياس بيانات معلمات الحياة الشائعة في بعوض الزاعجة المصرية ، بما في ذلك الخصوبة ، وحجم الجناح ، والخصوبة ، ونسبة الجنس ، والقدرة على البقاء ، وأوقات النمو ، ومساهمة الذكور ، وطول عمر البالغين. يمكن استخدام هذه القياسات لتقييم لياقة البعوض المعدل وراثيا.

الملخص

غالبا ما يعرض البعوض المعدل وراثيا تكاليف اللياقة البدنية مقارنة بنظرائه من النوع البري. وفي هذا الصدد، تنطوي دراسات تكاليف اللياقة على جمع بيانات بارامترات الحياة من البعوض المعدل وراثيا ومقارنتها بالبعوض الذي يفتقر إلى جينات التحوير من نفس الخلفية الجينية. توضح هذه المخطوطة كيفية قياس سمات تاريخ الحياة الشائعة في البعوضة Aedes aegypti ، بما في ذلك الخصوبة ، وحجم الجناح وشكله ، والخصوبة ، ونسبة الجنس ، والقدرة على البقاء ، وأوقات النمو ، ومساهمة الذكور ، وطول عمر البالغين. تم اختيار هذه المعلمات لأنها تعكس النجاح الإنجابي ، وسهلة القياس ، ويتم الإبلاغ عنها بشكل شائع في الأدبيات. تحدد النتائج التمثيلية تكاليف اللياقة البدنية المرتبطة إما بالضربة القاضية الجينية أو إدخال واحد لعنصر محرك الجينات. يعد توحيد كيفية جمع بيانات معلمات الحياة أمرا مهما لأن هذه البيانات يمكن استخدامها لمقارنة صحة البعوض المعدل وراثيا المتولدة عبر الدراسات أو لنمذجة معدل تثبيت الجينات المحورة في محاكاة مجموعات البعوض من النوع البري. على الرغم من أن هذا البروتوكول خاص بالزاعجة المصرية المعدلة وراثيا ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام البروتوكول لأنواع البعوض الأخرى أو ظروف العلاج التجريبية الأخرى ، مع التحذير من أن بعض السياقات البيولوجية قد تتطلب تكيفات خاصة.

المقدمة

البقاء للأصلح هو الفكرة الداروينية القائلة بأن الأفراد الذين يؤوون جينات تتكيف بشكل أفضل مع بيئتهم سينقلون هذه الجينات إلى الأجيال اللاحقة1. هذا يعني أن اللياقة البدنية هي التي تحدد ما إذا كانت جيناتهم ستبقى على قيد الحياة. ربما يكون هذا المفهوم الذي يزيد عمره عن 150 عاما هو أهم محدد لهندسة محرك جيني ناجح في البعوض المعدل وراثيا. يتم استكشاف محركات الجينات ، أو نمط الوراثة الفائقة المندلية لعنصر وراثي أناني يسمح له بالانتشار عبر السكان2 ، من أجل الإدارة الوراثية للآفات3. وفي سياق مكافحة النواقل، تهدف هذه الاستراتيجية إما إلى الاستعاضة عن مفصليات الأرجل البرية بأخرى مقاومة لمسببات الأمراض (تعديل السكان) أو القضاء عليها جميعا معا (قمع التجمع)4. ومع ذلك ، غالبا ما يظهر البعوض المعدل وراثيا تكاليف اللياقة البدنية (وتسمى أيضا الحمل الجيني) مقارنة بنظرائهم في WT ، مما يعني أن الجينات المحورة ستفقد في المجموعات التي يمكن أن تتفوق عليها. لذلك فإن اقتران جينات التحوير بنظام محرك الجينات ضروري لتعويض أي تكاليف للياقة البدنية ودفع الجينات المحورة عبر السكان بمستويات أكبر من المتوقع من الوراثة المندليةالنموذجية 4.

أظهرت الدراسات المختبرية عبر أنواع البعوض الناقل أن جينات التحوير غالبا ما تعرض تكاليف اللياقةالبدنية 5،6،7. على سبيل المثال ، Irvin et al. قياس معلمات الحياة المختلفة في الزاعجة (Ae.) aegypti المصممة للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) أو جينات transposase تحت ذبابة الفاكهة أكتين 5C أو محفزات 3XP3 الاصطناعية ، ومقارنتها بسلالة أورلاندو من النوع البري (نفس الخلفية الجينية التي اشتقت منها) 5. والجدير بالذكر أنهم وجدوا أن جميع السلالات المعدلة وراثيا قد قللت بشكل كبير من اللياقة الإنجابية5. اعتمادا على جين التحوير ، أظهر بعض بعوض الأنوفيلة (An.) الذي يعبر عن جينات التحوير التي تثبط تطور طفيلي البلازموديوم أيضا تكاليف اللياقةالبدنية 6. على وجه التحديد ، وضع An. stephensi الذي يعبر عن فوسفوليباز سم النحل (PLA2) تحت المروجين التأسيسيين أو المحرضين لمسحوق الدم عددا أقل بكثير من البيض مقارنة بالضوابط6. وجد هؤلاء المؤلفون أيضا أن الأنوفيلة المعدلة وراثيا التي تعبر عن جين محوري مختلف ، وهو رباعي دوديكاببتيد SM1 لم يظهر تكاليف اللياقة البدنية ، مما دفعهم إلى استنتاج أن تكاليف اللياقة البدنية الممنوحة للجينات المعدلة تعتمد ، على الأقل جزئيا ، على تأثير البروتين المعدل وراثياالمنتج 6. في الواقع ، يمكن أن تعزى تكاليف اللياقة البدنية إلى منتجات الجينات المحورة ، أو التأثيرات الموضعية ، أو التأثيرات غير المستهدفة ، أو الطفرات الإدراجية ، أو تأثيرات زواج الأقارب في السلالات التي يتم تربيتها في المختبر7. لذلك يجب أن تكون محركات الجينات قوية بما يكفي لتعويض تكاليف اللياقة البدنية التي يسببها التحوير الجيني مع تجنب تطوير عمليات الإدراج والحذف (indels) التي تمنع محرك الأقراص نفسه.

يمكن قياس تكاليف اللياقة التنموية أو الإنجابية في الدراسات المختبرية أو الأقفاص7 ، مع التحذير من أن العوامل غير المعروفة في هذا المجال قد يكون لها تأثير أيضا. ومع ذلك ، فإن دراسات اللياقة البدنية الخاضعة للرقابة هي خطوة أولى مهمة عند تخطيط أو تقييم إطلاق البعوض المعدل وراثيا ، مثل برنامج محرك الجينات ، لتحديد ما إذا كان الخط المعدل وراثيا سيستمر على مدى الأجيال اللاحقة. على سبيل المثال ، هاموند وآخرون. تم تقييم محركات الجينات المستندة إلى CRISPR / Cas9 في غامبيا والتي تهدف إلى تعطيل الجينات اللازمة لخصوبة الإناث8. من خلال دراسات الأقفاص التي تم الحفاظ عليها لمدة 25 جيلا على الأقل ، وجد المؤلفون أن البعوض تكبد أليلات مقاومة لمحرك الجينات منعت الانقسام المستهدف لكريسبر واستعادت خصوبة الإناث8. اقترحت جهود النمذجة التي بذلوها أن الخصوبة في الإناث غير المتجانسة الزيجوت لمحرك الجينات كان لها التأثيرات الأكثر دراماتيكية على تثبيت محرك الجينات في ظروف محاكاة8. على نفس المنوال ، Ae. aegypti (سلالة العين البيضاء هيغز ، HWE) المصممة للتعبير عن أشرطة محرك الجينات المستقلة تحت مروجين مختلفين أو في مواقع مختلفة بين الجينات أظهرت معدلات مختلفة من تثبيت محرك الجينات في مجموعات محاكاة9. باستخدام نمذجة MGDrivE10 ، جنبا إلى جنب مع المعدلات المقاسة لتكوين indel ، وتأثيرات الأمهات ، وبيانات معلمات الحياة التي تم جمعها في المختبر ، وجد المؤلفون أن لياقة البعوض أثرت بشدة على استمرار محرك الجينات في ظروف محاكاة9. تعزى تكاليف اللياقة البدنية التي من المرجح أن تضعف كفاءة محرك الجينات إلى التعبير الجسدي Cas9 (الزائد) أو من الجين المستهدف ، خاصة في الزيجوتات غير المتجانسة ، بدلا من المحرك الداخلي نفسه11،12،13،14،15،16،17.

نظرا لأهميتها ، تعد اللياقة البدنية عاملا مهما لقدرة الخط المعدل وراثيا على الاستمرار على مدى الأجيال اللاحقة ، ويمكن استخدامه كمؤشر لأي تأثيرات فسيولوجية مرتبطة بجين التحوير. على سبيل المثال ، قد ترتبط التأثيرات غير المستهدفة بتكاليف اللياقة البدنية. في هذه الحالة ، يوصى بعبور خط معدل وراثيا لعدة أجيال. علاوة على ذلك ، قد يكون من الضروري أيضا عبور الخط المعدل وراثيا بخط يعكس مجموعة الحقل للتحقيق في مدى قدرة السكان المحورين وراثيا على المنافسة في العالم الحقيقي. لتحديد تكاليف اللياقة البدنية بحيث يمكن مقارنتها ، توفر هذه المخطوطة بروتوكولات بسيطة لقياس سمات تاريخ الحياة الشائعة في Ae. aegypti Mosquitoi ، مع التركيز بشكل خاص على تكاليف اللياقة البدنية المرتبطة بالجينات المحورة ، بحيث يمكن استنساخ مثل هذه الدراسات بسهولة أكبر. تشمل البروتوكولات الخصوبة والخصوبة ونسبة الجنس والجدوى وأوقات النمو ومساهمة الذكور وطول عمر البالغين. كما تم اختيار قياس طول الجناح ومساحته كقياس للياقة البدنية لأنه يرتبط بطول الصدر18,19 وقياسات حجم الجسم ، والتي ترتبط ارتباطا مباشرا بحجم وجبة الدم والخصوبة والمناعة20,21. على الرغم من وجود العديد من الطرق لتقييم اللياقة البدنية ، فقد تم اختيار هذه المعلمات لأنها تعكس النجاح الإنجابي ، وسهلة القياس ، ويتم الإبلاغ عنها بشكل شائع في الأدبيات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تمت كتابة هذا البروتوكول للخطوط Ae. aegypti المعدلة وراثيا والبرية التي تم التحقق من صحتها وتأسيسها مسبقا. لمزيد من المعلومات حول توليد Ae. aegypti المعدلة وراثيا ، انظر Kistler et al.22 وكوتس وآخرون.23. تم إجراء جميع التجارب الموضحة أدناه وفقا لإجراءات التربية القياسية Ae. aegypti . تم الحفاظ على البعوض عند 28 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 75٪ -80٪ ودورة مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة. يوصى بشدة بما لا يقل عن 100 ورقة بيض فردية لكل بقعة بعوض للأغراض الإحصائية. تستغرق دراسات اللياقة البدنية الشاملة حوالي 3 أشهر لإكمالها (الشكل 1).

1. قياس الخصوبة في إناث البعوض

  1. يفقس البعوض المعدل وراثيا و WT (من نفس الخلفية الجينية ولكن يفتقر إلى الجينات المحورة) عن طريق وضع أوراق البيض في الماء المعقم طوال الليل في الحشرة ، وفقا لظروف التربية القياسية. اسمح لليرقات بتغذية ad libitum من خلال توفير عدة قطرات (كل منها حوالي 50 ميكرولتر) من ملاط الأسماك المطحون (Tetramin) (حوالي 30٪ وزن / حجم). يمكن التعرف على اليرقات الأولى 1 يوم بعد الفقس. ضع اليرقات في حاويات أكبر حتى لا يكون هناك ازدحام ، وعموما يمكن تربية 100-150 يرقة في حجم 1 لتر من الماء بمساحة سطح حوالي 250 سم2. استمر في توفير ملاط Tetramin كمصدر للغذاء ، مما يسمح لليرقات بالتغذية الإعلانية. أضف ملاط الطعام في قطرات منفصلة بحيث يتوفر دائما طعام كاف لليرقات ، وحتى لا يبدو الماء غائما. سيزداد حجم اليرقات مع كل حشرة وستدخل في النهاية في الجرو في أحواض اليرقات.
  2. بمجرد أن تبدأ الشرانق في الظهور ، ~ 5-6 أيام بعد الفقس ، افصلها حسب الجنس للتأكد من أن البالغين عذارى بمجرد ظهورهم (للتزاوج اللاحق) ، كما هو موضح أدناه.
    1. لفرز الشرانق حسب الجنس ، ابدأ باختيار الشرانق باستخدام ماصات بلاستيكية سعة 3 مل في أكواب بلاستيكية صغيرة تحتوي على ماء صنبور نظيف. تميل ذكور الشرانق إلى أن تكون أصغر وتميل إلى الظهور أولا مقارنة بالإناث. أولا ، قم بفرز الشرانق حسب الحجم ، ثم قم بتأكيد هذه الشاشة الأولية حسب التشكل.
    2. انقل الخادرة إلى شريحة مجهر زجاجي وقم بإزالة الماء الزائد بمنديل. هذا يجمد الخادرة. تحت مجسم عند تكبير 2x-4x ، ضع الجانب البطني للخادرة لأعلى باستخدام فرشاة طلاء ذات رؤوس دقيقة.
    3. تحليل بصريا الذيل للاختلافات في شكل الفص التناسلي (في نهاية شرائح البطن العذراء خلف المجاذيف. الشكل 2). لدى الإناث زعانف مدببة تمتد إلى ما بعد الفصوص التناسلية ، تشبه تقريبا أسنان التاج أو مصاصي الدماء ، في حين أن الفصوص التناسلية الذكرية مستديرة ولا تحتوي على هذه الهياكل المدببة. انظر كارفالهو وآخرون.(24 ) للاطلاع على أرقام إضافية.
  3. ضع الشرانق من الذكور والإناث في أكواب ماء منفصلة وضعها في الاحتواء المناسب ، على سبيل المثال ، كرتون 1.9 لتر (1/2 جالون أو 64 أونصة) مع 0.2 م × 0.2 م (8 بوصة × 8 بوصة) من القماش العضوي الأبيض ، يحتوي كل منها على ~ 150 خادرة.
  4. توفير مصدر للسكر والماء فوق الأقفاص (على سبيل المثال ، الزبيب وكوب مملوء بالماء مغطى بشاش ، مثبت بشريطين مطاطيين). اقطع ثقبا بحجم القلم في الكراتين وقم بتغطيته بسدادة مطاطية بحيث يمكن إضافة الشرانق الإضافية إلى الأقفاص عند ظهورها.
  5. في 3-5 أيام بعد ظهور البالغين ، قم بتخدير البعوض عن طريق وضع الكراتين عند 4 درجات مئوية لمدة ~ 2-5 دقائق. على الرغم من أنها قد لا تزال ترتعش ، إلا أن البعوض يتم تخديره بشكل كاف بمجرد سقوط الغالبية في قاع الكرتون. ضع البعوض على طبق بتري زجاجي على الجليد لمدة ~ 30 دقيقة -1 ساعة.
    ملاحظة: ترك البعوض عند 4 درجات مئوية لفترة طويلة جدا قد يؤثر بشكل كبير على صحته ، على الرغم من أننا لم نجد أي آثار إذا ترك على الجليد لمدة تصل إلى 1 ساعة.
  6. عبر WT أو GD1 المعدلة وراثيا أو GD29 (محرك الجينات القائم على CRISPR / Cas-9) الذكور بشكل جماعي مع إناث WT البكر (السيطرة) عن طريق إضافة البعوض المخدر بنسب خمسة WT أو الذكور المعدلة وراثيا إلى أنثى WT واحدة في علب البعوض ، كل منها يحتوي على ~ 150 البعوض. تأكد من تسمية الأقفاص حسب نوع الذكور.
    ملاحظة: يهدف مخطط العبور هذا إلى تحديد مدى ملاءمة GD1 أو GD29 hemizygotes (أي البعوض الذي يؤوي نسخة واحدة من جين التحوير). لتحديد مدى ملاءمة الخطوط المعدلة وراثيا متماثلة الزيجوت ، يمكن تكييف مخطط العبور بحيث يسمح للذكور والإناث المحورين وراثيا بالتزاوج مقارنة بتهجين الذكور والإناث WT.
  7. بعد 2-3 أيام ، إطعام الدم الإناث باتباع ممارسات التربية القياسية25 من خلال توفير مصدر دم أعلى القفص. قم بإزالة مصدر السكر قبل تغذية الدم لمدة 24 ساعة ومصدر المياه ~ 2-3 ساعات قبل تغذية الدم لزيادة كفاءة التغذية.
  8. بعد تغذية الدم ، قم بتخدير البعوض عن طريق وضعه عند 4 درجات مئوية ، كما في الخطوة 1.5.
  9. فرز الإناث التي تتغذى على الدم (احتقان بالكامل) من الإناث غير المغذية عن طريق فحص بطونهن بصريا للاحتقان. تخلص من غير المتغذين ، والذين يتغذون جزئيا ، والذكور.
  10. ضع الإناث المحتقنة مرة أخرى في أقفاصها ووفر مصدرا للسكر والماء فوق الأقفاص.
  11. بعد 2-3 أيام ، ضع الإناث الفردية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل مبطنة بورق ترشيح تم تسميته مسبقا بالقلم الرصاص (الشكل 3). قم بتغطية الأنابيب المخروطية بشبكة وختم بشريطين مطاطيين.
  12. بمجرد استيقاظ الإناث ، املأ جميع الأنابيب ب ~ 5 مل من ماء الصنبور. ضع قطعة صغيرة من الزبيب أو كرة قطنية مبللة بالسكر فوق كل أنبوب مخروطي. اترك الإناث لمدة 1-2 أيام في الحشرة واسمح لها بالبيض.
  13. بعد 1-2 أيام ، صفي كل أنبوب مخروطي وتخدير البعوض عن طريق وضعه عند 4 درجات مئوية. للمعالجة السريعة ، استخدم طرف ماصة بلاستيكية سعة 3 مل مضغوطة على الشبكة لتصريف المياه من كل أنبوب مخروطي. قم بتدوير الأنابيب رأسا على عقب وضعها فوق منشفة ورقية لتصريفها. ضع الأنابيب المخروطية سعة 50 مل في حامل أنبوب وضع الرف على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  14. اجمع ورقة البيض واحسب عدد البيض على كل ورقة. عد الإناث التي لا تضع البيض على أنها 0 وأدرجها في التحليل. احسب متوسط الخصوبة باعتباره إجمالي عدد البيض المحسوب على كل ورقة مقسوما على إجمالي عدد الإناث التي تم فحصها.
    ملاحظة: قد تكون الصور الرقمية لأوراق البيض الفردية بمثابة سجل مرئي لتأكيد العد (الشكل 4).
  15. جفف أوراق البيض وضعها مرة أخرى في الحشرة. يوصى بأن تجف أوراق البيض لمدة 3-5 أيام على الأقل من أجل الفقس الأمثل25.

2. قياس طول الجناح ومساحته وحجمه مركزيا

  1. قم بتجميد ما لا يقل عن 25 WT أو الإناث المتطابقة مع العمر المعدلة وراثيا التي تغذت على الدم من دراسة الخصوبة المكتملة عن طريق وضع أقفاص البعوض عند -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا.
    ملاحظة: لا تجمد لفترة أطول من الوقت ولا تهز الحاوية أو تسقطها ، لأن ذلك قد يتسبب في سقوط الأجنحة من البعوض.
  2. تشريح الجناح الأيسر لكل بعوضة ، واستئصال مفصل الجناح والصدر ، وإزالة الجناح بأكمله ، باتباع البروتوكول أدناه.
    1. في يد واحدة ، أمسك البعوض بالملقط ، وأمسك منطقة الصدر تحت الأجنحة.
    2. باستخدام زوج آخر من الملقط في اليد الأخرى ، قم بتشريح الجناح الأيسر لكل بعوضة ، واستئصالها عند مفصل الجناح والصدر باستخدام ضغط لطيف لسحب الجناح ، وإزالة الجناح بالكامل دون تمزيق عروق الجناح.
  3. باستخدام ملقط ، ضع الجناح على شريحة زجاجية ، مستلقيا بشكل مسطح. باستخدام ماصة نقل ، أضف قطرة واحدة من محلول مخزون سعة 15 مل ، يتكون من 70٪ إيثانول ، وقطرة واحدة من صابون الأطباق إلى الجناح الموجود على الشريحة.
  4. أضف قطرة واحدة من 80٪ من الجلسرين إلى الغطاء وضعه أعلى الجناح في محلول صابون الإيثانول.
  5. قم بتصوير الأجنحة المثبتة على الشرائح باستخدام كاميرا بعدسة 65 مم (7D-65 mm-1x ؛ التكبير = 1 ، 200 ، 6.3 ، ISO = 100). لاحظ مقياس البكسل / مم وتأكد من بقاء هذا كما هو لجميع الصور. إذا تم تصوير أجنحة متعددة معا، فقم بقص الصور إلى أجنحة فردية وأضف أشرطة مقياس إلى كل صورة. احفظ الصور بتنسيق TIFF مع ضغط LZW ، مع تسمية كل صورة بوضوح بجميع المعلومات الخاصة بالجناح الفردي.
    ملاحظة: يمكن تصوير الأجنحة باستخدام كاميرا وتكبير مختلفين أو بكاميرا متصلة بمجهر لدراسات أخرى ، إذا ظلت الإعدادات كما هي وظل مقياس البكسل / مم كما هو لكل جناح تم تصويره في الدراسة. سيتم احتساب نسبة البكسل / مم عند تحديد القياسات.
  6. قم بتنزيل tpsUtil و tpsDig ، وهما برنامجان مجانيان لمعالجة الصور المورفومترية. راجع Rohlf 26,27 للحصول على معلومات أكثر تفصيلا حول البرنامج.
  7. رقمنة الأجنحة باستخدام tpsUtil لإنشاء ملف TPS لصور الجناح للخطوة التالية من الرقمنة.
    1. للقيام بذلك ، افتح tpsUtil ، وتحت التشغيل ، حدد إنشاء ملف tps من الصور. انقر فوق إدخال ، وحدد الملف الذي يحتوي على صور الجناح الفردية ، ثم حدد أي صورة لاختيار هذا المجلد. انقر فوق الإخراج وقم بتسمية الملف الذي سيتم إنشاؤه بتنسيق .tps. انقر على حفظ.
    2. ثم ضمن إجراءات، انقر فوق إعداد. حدد تضمين الكل، وانقر فوق إنشاء وأغلق المربع المنبثق. تحت العملية ، حدد الآن ترتيب العينات بشكل عشوائي. انقر فوق الإدخال وحدد ملف .tps الذي تم إنشاؤه للتو. انقر فوق الإخراج ، وأعد تسمية ملف .tps للإشارة إلى أن هذا هو إصدار الملف مع العينات العشوائية ، وانقر فوق حفظ. ثم انقر فوق إنشاء. أغلق برنامج tpsUtil.
      ملاحظة: لتقليل خطأ القياس ، قد يتم تكرار صور الجناح واستخدامها مرتين للنسخ المتماثل الفني.
  8. استخدم برنامج tpsDig لتحديد الإحداثيات الديكارتية ثنائية الأبعاد للمعالم. ضمن الإدخال، حدد ملف .tps الذي تم إنشاؤه في الخطوة 2.7. اضبط المقياس على المقياس المحدد في الخطوة 2.5 ؛ ضمن خيارات، حدد أدوات الصورة، ثم انقر فوق قياس.
  9. أضف معالم إلى الصورة بالنقر فوق رمز التقاطع الأزرق الذي يمثل رقمنة المعالم ، ثم انقر فوق مفاصل الجناح المشار إليها في الشكل 5 ، بالترتيب من المعلم 1 إلى المعلم 14.
    ملاحظة: تم اختيار هذه المعالم لأنها استخدمت سابقا في رقمنة وتحليل معالم الجناح19 ، ويسهل تحديد موقعها عند مفاصل عروق الجناح عبر العديد من العينات ، وتوفر معالم جناح كافية لالتقاط حجم وشكل الجناح.
  10. عند وضع علامة على المعالم ، ضع علامة على أي معالم مفقودة أو محجوبة (بسبب طي الجناح أو تلفه) على أنها مفقودة في tpsDig بالنقر فوق الرمز M لاستبعادها من التحليل والاحتفاظ بالترتيب الصحيح للمعالم. انقر فوق السهم الأحمر المواجه لليمين لتكرار رقمنة المعالم للصور التالية حتى تكتمل جميع الصور الموجودة في الملف. احفظ الملف وأغلقه.
    ملاحظة: يجب إضافة المعالم إلى صورة الجناح بالترتيب الصحيح لكل صورة حتى تكون حسابات طول الجناح ومساحته وحجمه صحيحة.
  11. احسب طول الجناح ومساحته باستخدام البرنامج النصي R المتوفر في الملف التكميلي 1 ، مع تعديل موقع ملف .tps ومقياس الصورة وفقا للتجربة.
  12. احسب حجم الجناح المركزي ، وهو مقياس للحجم مستقل إحصائيا عن الشكل ، ويعرف بأنه الجذر التربيعي لمجموع المسافات التربيعية لكل معلم من نقطة مركز الجناح28,29.
  13. استخدم محاذاة procrustes المعممة لإزالة التباين غير الشكلي ورسم إحداثيات المعالم ، باستخدام الأجنحة التي تحتوي على جميع المعالم سليمة. لكل من حجم الجناح المركزي ومتوسط تحديد المعالم ، استخدم البرنامج النصي R المقدم في الملف التكميلي 2 ، مع تعديل موقع ملف .tps ومقياس الصورة وفقا للتجربة.

3. تقييم خصوبة البويضات

  1. فقس بيض F1 فردي من الأوراق التي تم جمعها من الإناث العازبات (التي تم جمعها في الخطوة 1) في حاويات أطعمة لذيذة شفافة من مادة البولي بروبيلين تحتوي على ~ 100 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم حديثا. أضف قطرتين أو ثلاث قطرات من ملاط طعام السمك المطحون لتغذية المخصص . قم بتبطين قمم الحاويات بشبكة أو أورجاندي ، وثبتها بشريط مطاطي.
  2. في 2-3 أيام بعد الفقس ، قم بإزالة أوراق البيض من الماء واتركها تجف طوال الليل عن طريق وضعها في وعاء جديد مغطى بغطاء أو شبكة وتركها في الحشرة.
  3. أعد تفريخ أوراق البيض في نفس الحاويات التي فقست فيها في البداية عن طريق وضعها مرة أخرى في وعاء الماء.
    ملاحظة: تجفيف وإعادة تفريخ أوراق البيض يحسن بشكل كبير من كفاءة الفقس. قد لا يكون هذا ضروريا لأنواع البعوض الأخرى.
  4. في 3-5 أيام بعد الفقس الأولي ، افحص اليرقات بصريا (2 إلى 4 من instar) بحثا عن علامة معدلة وراثيا (إن أمكن ؛ الشكل 6). افحص العديد من اليرقات تحت مجهر الفلورسنت في نفس الوقت عن طريق وضعها على قطعة من ورق الترشيح موضوعة فوق عضو أو شبكة مبطنة بمناشف ورقية. تمتص المناشف الورقية الماء الزائد ، بحيث يمكن استخدام ورق الترشيح لفحص اليرقات المجمدة ومعالجتها.
  5. سجل عدد اليرقات المعدلة وراثيا الإيجابية أو السلبية. تخلص من اليرقات السلبية.
  6. تنظيف مياه اليرقات لضمان أوقات النمو المثلى. للقيام بذلك ، ماصة اليرقات في كوب صغير ، وتجاهل المياه القذرة ، واستبدالها بماء الصنبور العذب أضف اليرقات الإيجابية وتأكد من توفر ما يكفي من ملاط طعام الأسماك المطحون.
  7. احسب الخصوبة على أنها عدد اليرقات المعدلة وراثيا أو الضابطة مقسومة على إجمالي عدد البيض.

4. تحديد نسبة الجنس في الشرانق

  1. حتى 14 يوما بعد الفقس ، استمر في جمع وتسجيل عدد الشرانق من الذكور والإناث (كما هو موضح في الخطوة 1.2.3). يمكن تجميع الإناث أو الذكور ، حسب الجنس ، في أكواب صغيرة موضوعة في حاويات سعة 1.9 لتر.
  2. لتحديد نسبة الجنس ، أضف عدد إناث F1 أو عدد ذكور F1 التي تم جمعها عبر الجدول الزمني للدراسة لكل بعوضة أنثى بالغة. اقسم هذا الرقم على إجمالي عدد الشرانق التي تم جمعها لنفس خط البعوض الناتج من أنثى واحدة.

5. تحديد صلاحية اليرقات

  1. لتحديد صلاحية اليرقات ، أضف العدد الإجمالي للشرانق التي تم جمعها عبر الجدول الزمني للدراسة لكل بعوضة أنثى بالغة.
  2. اقسم هذا الرقم على إجمالي عدد اليرقات التي تم عدها لكل أنثى بعوضة بالغة لنفس الخط الذي تم حسابه في الخطوة 3.

6. تحديد وقت تطور اليرقات إلى الشرانق

  1. لتحديد تطور اليرقات إلى الشرانق ، تتبع عدد اليرقات وعدد الشرانق لكل سطر يوميا.
  2. احسب تطور اليرقات إلى الشرانق كمتوسط الوقت اللازم لتطور الشرانق بعد الفقس.

7. تحديد مساهمة الذكور

  1. باستخدام الذكور المتطابقة مع العمر ، قم بتخدير ذكور البعوض البكر المعدلة وراثيا على الجليد ، وكذلك البعوض البكر البالغ من الذكور والإناث.
  2. اعبر إما البالغين الذكور المحورين وراثيا أو الضابطين مع السيطرة على الإناث البالغات عن طريق إضافة 50 من الذكور المحورين وراثيا أو 50 من الذكور الضابطين (المطابقين للعمر) مع 100 أنثى ضابطة في علب 64 أونصة ، بحيث يكون هناك ما مجموعه 50 ذكرا مع 100 أنثى (إناث ضابطة: واحدة تحكم أو ذكر معدل وراثيا). تأكد من تسمية الكرتون الذي يحتوي على ذكور معدلة وراثيا وأي كرتون يحتوي على ذكور التحكم.
  3. السماح بالتزاوج يحدث لمدة 2-3 أيام. بعد هذا الوقت ، قدم للبعوض وجبة دم وفقا لممارسات التربية القياسية.
  4. بعد ثلاثة أيام من تغذية الدم ، افصل الإناث المحتقنة بالكامل إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل مبطنة بورق ترشيح أبيض مسمى مسبقا ، كما هو موضح في الخطوة 1 (فحص الخصوبة). تخلص من الإناث غير المغذيات أو قدم لهن وجبة دم أخرى في اليوم التالي. املأ جميع الأنابيب ب ~ 5 مل من ماء الصنبور. ضع قطعة صغيرة من الزبيب على الشبكة الموضوعة فوق كل أنبوب مخروطي.
  5. اترك الإناث لمدة 1-2 أيام في الحشرة واسمح لهم بالبيض. فحص بصريا أوراق البيض لمدة 4-5 أيام بعد وجبة الدم للبيض. السماح للإناث يوم إضافي ل oviposit لزيادة معدلات وضع البيض.
  6. لجمع أوراق البيض ، قم بتصريف الماء وتخدير الإناث عن طريق وضع أنابيب مخروطية عند 4 درجات مئوية ، كما هو موضح سابقا. تخلص من إناث البعوض عن طريق وضع 70٪ من الإيثانول.
  7. اترك الأوراق في أنابيب في الحشرة لمدة 5 أيام على الأقل حتى تجف. استخدم ملقط لإزالة الأوراق ووضعها في حاويات أطعمة لذيذة شفافة من مادة البولي بروبيلين تحتوي على ~ 100 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم حديثا للتفقيس. أضف 2-3 قطرات من ملاط طعام الأسماك المطحون لتغذية المخصص . قم بتبطين قمم الحاويات بشبكة أو عضوي ، مثبتة بشريط مطاطي.
  8. في 2-3 أيام بعد الفقس ، قم بإزالة أوراق البيض من الماء واتركها تجف طوال الليل عن طريق وضعها في وعاء جديد مغطى بغطاء أو شبكة ووضعها مرة أخرى في الحشرة.
  9. أعد تفريخ أوراق البيض في نفس الحاويات عن طريق وضعها مرة أخرى في وعاء الماء.
  10. في 3-5 أيام بعد الفقس الأولي ، افحص اليرقات بصريا (2 إلى 4 من instar) بحثا عن علامة معدلة وراثيا (إن وجدت). احسب مساهمة الذكور على أنها عدد اليرقات المعدلة وراثيا F2 مقسوما على عدد اليرقات الكلية لكل خط بعوضة.

8. تحديد طول عمر البعوض

  1. نقل 50 من الذكور و 50 أنثى من WT أو البعوض المعدل وراثيا المطابق للعمر غير المغذي للدم إلى حاوية مناسبة. استخدم كرتون سعة 64 أونصة ، مع فتحة علوية مبطنة بخرطوم اللباس الداخلي ، ملتوية ومغلقة معقودة ، لسهولة الوصول والتلاعب بالبعوض مع تقدم التجربة (الشكل 7).
    ملاحظة: يوصى بالقيام بذلك في ثلاث نسخ للأغراض الإحصائية.
  2. توفير مصدر للسكر والمياه. هنا ، تم استخدام الزبيب وكوب مملوء بالماء مبطن بشاش ، مثبت بشريطين مطاطيين.
  3. تتبع عدد البعوض النافق من الذكور والإناث كل يوم. احسب طول العمر كمتوسط عدد الأيام التي مرت قبل موت البعوض عبر الأقفاص ، مع حذف البعوض الذي يموت لأسباب غير إعلامية (أسباب لا ترجع إلى عمر البعوض ، مثل السحق أو الغرق في السكر) وحذف البعوض الذي لا يزال على قيد الحياة في نهاية الدراسة.
    ملاحظة: يتم تعريف البقاء على قيد الحياة على أنه احتمال أن تكون على قيد الحياة حتى الوقت t ، أو الوظيفة S (t) = Pr (T>t). متوسط البقاء على قيد الحياة هو الوقت الذي يكون فيه احتمال البقاء على قيد الحياة 0.5 ، أو T_0.5 = S-1 x 0.5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باتباع البروتوكول المذكور أعلاه ، تم تقييم ملاءمة سلالتين من البعوض: (1) CRISPR / Cas9 بوساطة الضربة القاضية من Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) بروتين لعابي و (2) Ae. خطوط aegypti التي تعبر عن محركات الجينات المستقلة بوساطة CRISPR / Cas99. في الحالة الأولى ، تم إنشاء خط خروج المغلوب D7L1 متماثل الزيجوت من خلال استغلال مسار الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) لتوليد الاضطراب بعد الحقن الدقيق للأجنة باستخدام sgRNAs الخاصة بجين D7L1 . تم تهجين البعوض D7L1-KO غير المتجانس لمد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

غالبا ما يتم إجراء دراسات اللياقة البدنية المصرية في المختبر لتقييم تكاليف اللياقة البدنية المرتبطة بالبضائع المعدلة وراثيا (على سبيل المثال ، عناصر محرك الجينات) أو الضربات القاضية الجينية ، كما تمت مناقشته في هذه المخطوطة ؛ ومع ذلك ، يمكن إجراء هذه الدراسات لمجموعة متنوعة من الأغراض - أي مجموعة تهدف إلى تقييم صحة مجموعة Ae. aegypti ، مثل Wolbachia المصابة 30,31 ، المقاومة للمبيدات الحشرية32,33

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور بيل ريد وألكسندر فرانز من جامعة ميسوري على دعمهم لهذا البروتوكول. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور بنيامين كراجاتش من المعاهد الوطنية للصحة / NIAID على دعمه لتحليل R. تم تمويل هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، رقم المنحة R01 AI130085 (KEO) ، وقسم المعاهد الوطنية للصحة / NIAID لبرنامج البحوث الداخلية AI001246 (EC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 أونصة أكواب سوفليه بلاستيكية شفافةWebstaurantStore301100PC
2 أونصة. أكواب سوفليه البوليسترين الشفافةWebstaurantStore760P200N
3 مل ماصات بلاستيكية  كورنين357524
50 مل أنابيب مخروطيةعلامة تجارية
64 أونصة كوب طعام ورقي مطلي باللون الأبيضالمزدوج WebstaurantStore999SOUP64WBلإحاطة البعوض
عدسة 65 مم   ؛كانونMP-E 65mm f / 2.8 1-5x ماكرو صوركانون ماكرو الصورة MP-E 65 مم, 7D-65mm-1X; تكبير = 1, 200, 6.3, ISO = 100; لتصوير الأجنحة أو أوراق البيض, على الرغم من أن الكاميرات الأخرى من المحتمل أن تكون كافية
الزاعجة المصرية  البعوض BEIسلالات متعددة مثل البيض متوفرة
مغذيات غشاء اصطناعيةhttps://lillieglassblowers.com/مغذي غشاء Meduim ، مخصص ، 33 ممتقدم Chemglass أيضا ، لكن الأحجام خاطئة بالنسبة لنا. لدينا حوالي 3 سم؟
ATPMP الطب الحيويICN15026605أي نوعية جيدة ATP, 10mM مرشح معقمة aliquots في -20
الأوتوكلافلتعقيم المياه لتفقيس
كاميرا كانون EOS 7D كانون3814B004لتصوير الأجنحة أو أوراق البيض, على الرغم من أن الكاميرات الأخرى من المحتمل أن تكون كافية
دم الأغنام منزوعة التفريف شركة كولورادو سيروم60 مل ، كل أسبوعينhttps://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
مضيء مجهر مزدوج معقوفةدولان جينر ألياف لايت 180181-1 نظام
ملقطالإيثانول
شاشomnisorb ii4 "غير منسوج الإسفنج
أطباق بيتري زجاجية من فيشر ساينتفيك12-544-2
، 100 مرة ؛ 15 ممVWR75845-546لتخدير / التلاعب بالبعوض على
أمعاء خنازيرأي أطعمة لذيذةنشتريها بكميات كبيرة ، وتقسيمها ، وغسلها ونخزنها في كميات صغيرة من ~ 4 × 12 بوصة عند -20 في 50 مل
دلو
ثلج
الشكل Kimwipeفيشر ساينتفيك06-666A
Leica GZ4 مجهرلفحص البعوض المعدل وراثيا (إن أمكن)
الرسمAIT فرشاة الاصطناعية  حجم 10-0للتلاعب باليرقات / الشرانق (أمازون)
خرطوم اللباسWalmartL'eggs Everyday  ؛ نايلون نسائي <قوي> بالإضافة إلى < / قوي> الركبة المرتفعة إصبع القدم الشفاف ، 16 زوجا (بالإضافة إلى الكرتون)
أقلام رصاص أيعلامة تجارية
حاويات بلاستيكية ل 2 درجة ؛ تخزين الكرتونوول مارتSterilite 58 Qt صندوق تخزين غطاء أبيض واضح القاعدة مجموعة من 8
حاويات بلاستيكية لزراعة اليرقاتWalmartSterilite 28 Qt. صندوق تخزين بلاستيك ، أبيض ، مجموعة من 10
حاويات بلاستيكية لتفريخWalmartSterilite 6 Qt. صندوق تخزين بلاستيك ،
حاويات لذيذة شفافة من مادة البولي بروبيلين البيضاء   ؛WebstaurantStore  127DM12BULK12 أونصة ، أو 16 أونصة إذا لزم الأمر لأكبر (127RD16BULK)
الأربطة المطاطيةOffice Max  # 100736 / # 909606 / # 377741512 "و # 64 و # 10
سدادة مطاطيةVWR217-0515لإحاطة البعوض
مصدر السكر ، مثل مكعبات السكر أو الزبيب
رقائق طعام Tetramin16106
tpsDigStony Brook Morphometricsبرنامج مجاني لمعالجة الصور المورفومترية يتم توزيعه عبر الإنترنت ومتاح على https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtilStony Brook Morphometricsبرنامج مجاني لمعالجة الصور المورفومترية يتم توزيعه عبر الإنترنت متاح على https://www.sbmorphometrics.org/
نسيج الأورجانزا الأبيض 8" & مرات 8"FabricWholesale.com 4491676Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection 
ويتمان الصف 1 ورق ترشيح نوعي ويتمان1001-824لأوراق البيض. اللون الأبيض يجعل من السهل رؤية البيض الأسود.
أي دومون 5SF زجاج المجهر الشريحة الثلج مخروطي StereoZoom فرشاة الداخلي يرقات

المراجع

  1. Dawkins, R. The Selfish Gene. New edition. , University Press. Oxford, New York. Oxford. (1989).
  2. Crow, J. F. Unmasking a Cheating Gene. Science. 283 (5408), 1651-1652 (1999).
  3. Gould, F. Broadening the application of evolutionarily based genetic pest management. Evolution. 62 (2), 500-510 (2008).
  4. Williams, A. E., Franz, A. W. E., Reid, W. R., Olson, K. E. Antiviral effectors and gene drive strategies for mosquito population suppression or replacement to mitigate arbovirus transmission by Aedes aegypti. Insects. 11 (1), (2020).
  5. Irvin, N., Hoddle, M. S., O'Brochta, D. A., Carey, B., Atkinson, P. W. Assessing fitness costs for transgenic Aedes aegypti expressing the GFP marker and transposase genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (3), 891-896 (2004).
  6. Moreira, L. A., Wang, J., Collins, F. H., Jacobs-Lorena, M. Fitness of anopheline mosquitoes expressing transgenes that inhibit Plasmodium development. Genetics. 166 (3), 1337-1341 (2004).
  7. Dilani, P. V. D., Dassanayake, R. S., Tyagi, B. K., Silva Gunawardene,, N, Y. I. The impact of transgenesis on mosquito fitness: A review. Frontiers in Insect Science. 38, (2022).
  8. Hammond, A. M., et al. The creation and selection of mutations resistant to a gene drive over multiple generations in the malaria mosquito. PLOS Genetics. 13 (10), (2017).
  9. Reid, W., et al. Assessing single-locus CRISPR/Cas9-based gene drive variants in the mosquito Aedes aegypti via single-generation crosses and modeling. 3 (12), (2022).
  10. Wu, S. L., et al. MGDrivE 2: A simulation framework for gene drive systems incorporating seasonality and epidemiological dynamics. PLOS Computational Biology. 17 (5), (2021).
  11. Oberhofer, G., Ivy, T., Hay, B. A. Gene drive and resilience through renewal with next generation Cleave and Rescue selfish genetic elements. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (16), 9013-9021 (2020).
  12. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553(2020).
  13. Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
  14. Champer, J., et al. A CRISPR homing gene drive targeting a haplolethal gene removes resistance alleles and successfully spreads through a cage population. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24377-24383 (2020).
  15. Champer, S. E. 15, et al. Computational and experimental performance of CRISPR homing gene drive strategies with multiplexed gRNAs. Science Advances. 6 (10), (2020).
  16. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9. 51701, (2020).
  17. Champer, S. E., Kim, I. K., Clark, A. G., Messer, P. W., Champer, J. Anopheles homing suppression drive candidates exhibit unexpected performance differences in simulations with spatial structure. eLife. 11, 79121(2022).
  18. Petersen, V., et al. Assessment of the correlation between wing size and body weight in captive Culex quinquefasciatus. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 49 (4), 508-511 (2016).
  19. Yeap, H. L., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M., Ritchie, S. A., Johnson, P. H. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 89 (1), 78-92 (2013).
  20. Fecundity Briegel, H. metabolism, and body size in Anopheles (Diptera: Culicidae), vectors of malaria. Journal of Medical Entomology. 27 (5), 839-850 (1990).
  21. Hurd, H., Hogg, J. C., Renshaw, M. Interactions between bloodfeeding, fecundity and infection in mosquitoes. Parasitology Today. 11 (11), 411-416 (1995).
  22. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  23. Coates, C. J., Jasinskiene, N., Miyashiro, L., James, A. A. Mariner transposition and transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (7), 3748-3751 (1998).
  24. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), (2014).
  25. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2010).
  26. Rohlf, F. J. TpsDig (2.32) [Computer software. , (2018).
  27. Rohlf, F. J. TpsUtil (1.79) [Computer software. , (2018).
  28. Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric Morphometrics for Biologists. , Elsevier Academic Press. New York, NY. (2017).
  29. Size Klingenberg, C. P., shape, and form: concepts of allometry in geometric morphometrics. Development Genes and Evolution. 226 (3), 113-137 (2016).
  30. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: Parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
  31. Ross, P. A., Hoffmann, A. A. Fitness costs of Wolbachia shift in locally-adapted Aedes aegypti mosquitoes. Environmental Microbiology. 24 (12), 5749-5759 (2022).
  32. Rigby, L. M., Johnson, B. J., Peatey, C. L., Beebe, N. W., Devine, G. J. The impact of sublethal permethrin exposure on susceptible and resistant genotypes of the urban disease vector Aedes aegypti. Pest Management Science. 77 (7), 3450-3457 (2021).
  33. Smith, L. B., Silva, J. J., Chen, C., Harrington, L. C., Scott, J. G. Fitness costs of individual and combined pyrethroid resistance mechanisms, kdr and CYP-mediated detoxification, in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009271(2021).
  34. Chaves, B. A., et al. Vertical transmission of Zika virus (Flaviviridae, Flavivirus) in Amazonian Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) delays egg hatching and larval development of progeny. Journal of Medical Entomology. 56 (6), 1739-1744 (2019).
  35. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  36. David, M., Garcia, G., Valle, D., Maciel-de-Freitas, R. Insecticide resistance and fitness: the case of four Aedes aegypti populations from different Brazilian regions. BioMed Research International. , (2018).
  37. Wendell, M. D., Wilson, T. G., Higgs, S., Black, W. C. Chemical and gamma-ray mutagenesis of the white gene in Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 9 (2), 119-125 (2000).
  38. Koenraadt, C. J., Kormaksson, M., Harrington, L. C. Effects of inbreeding and genetic modification on Aedes aegypti larval competition and adult energy reserves. Parasites and Vectors. 3, (2010).
  39. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Developmental Biology. 8, (2008).
  40. Farnesi, L. C., Vargas, H. C. M., Valle, D., Rezende, G. L. Darker eggs of mosquitoes resist more to dry conditions: Melanin enhances serosal cuticle contribution in egg resistance to desiccation in Aedes, Anopheles and Culex vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), (2017).
  41. Carvalho, D. O., et al. Mosquito pornoscopy: Observation and interruption of Aedes aegypti copulation to determine female polyandric event and mixed progeny. PLoS ONE. 13 (3), (2018).
  42. Helinski, M. E., Harrington, L. C. Male mating history and body size influence female fecundity and longevity of the dengue vector Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 48 (2), 202-211 (2011).
  43. Felipe Ramarez-Sanchez,, Camargo, L., Avila, C., W, F. Male sexual history influences female fertility and re-mating incidence in the mosquito vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Insect Physiology. 121, 104019(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

البعوض المعدل وراثياًسمات تاريخ الحياةالمحرك الجينيالقياسات المورفومترية للجناحقياس الخصوبةحيوية اليرقاتتحليل نسبة الجنسطول عمر البالغين
القياس الكمي لتكاليف اللياقة البدنية في بعوض الزاعجة المصرية المعدلة وراثيا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.