مصفوفة التخدير التسلسلي للتحقيق عالي الإنتاجية للعوامل المتطايرة باستخدام ذبابة الفاكهة الميلانية

إن وجود تأثيرات مخدرة جانبية (أي تأثيرات لا يمكن ملاحظتها على الفور ولكن قد يكون لها عواقب سلوكية متأخرة) مقبول بشكل عام ، لكن فهم آلياتها وعوامل الخطر يظل بدائيا ^1,2. يحد تأخرها في ظهورها ودقتها من عدد المتغيرات المهمة المحتملة التي يمكن التحقيق فيها في نماذج الثدييات ضمن أطر زمنية معقولة وبتكلفة مقبولة. تقدم ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر) مزايا فريدة في سياق المرض التنكسي العصبي³ ولفحص السموم⁴ التي لم يتم تطبيقها حتى الآن على دراسة التأثيرات الجانبية المخدرة.

قمنا بتطوير مصفوفة التخدير التسلسلي (SAA) لتسهيل استخدام ذباب الفاكهة في دراسة الديناميكا الدوائية المخدرة وعلم الوراثة الدوائي. الميزة الرئيسية ل SAA هي التعرض المتزامن لظروف تجريبية متطابقة لمجموعات متعددة. عند إقرانها بالمرونة التجريبية لذباب الفاكهة ، فإن الإنتاجية العالية ل SAA تسمح باستكشاف المتغيرات البيولوجية والبيئية على نطاق مستحيل في نماذج الثدييات.

من حيث المبدأ ، فإن SAA هي ببساطة سلسلة من مواقع التخدير المتصلة (غرف مصنوعة من قارورة سعة 50 مل) يقوم من خلالها الغاز الناقل بتوصيل عوامل متطايرة. تحتوي الغرفة الأولى للنظام على ماء مقطر يتم من خلاله ترطيب الغاز الناقل (الذباب حساس للجفاف) ، وينتهي بمؤشر تدفق بسيط يشير إلى تدفق الغاز عبر النظام. تفصل الشباك الدقيقة الموضوعة على فتحات أنبوب التوصيل الغرف لمنع هجرة الذباب بين الغرف. عدد المواقع "في سلسلة" محدود بمقاومة تدفق الغاز غير المضغوط (الأنابيب ، الشباك).

قمنا بتمييز حركية هذا النموذج الأولي SAA في منشور سابق⁵. على الرغم من أن الخصائص الدوائية الدقيقة ستختلف بين SAAs ، فإن الأساسيات ذات الصلة التي تم اختبارها تجريبيا هي كما يلي: (i) التدفق الأولي من 1.5-2 لتر / دقيقة يوازن جميع الغرف (الحجم الإجمالي ±550 مل) مع التركيز المطلوب للمخدر في غضون دقيقتين. (ii) لا يتغير تركيز بخار التخدير الذي يتم توصيله إلى الغرف بشكل ملحوظ بين الموقع الأول والأخير لأن كمية المخدر الموجودة في حجم الغاز في غرفة فردية (50 مل) تتجاوز بكثير الكمية التي يمتصها أي عدد من الذباب ؛ و (iii) بمجرد توازن الغرف ، يمكن تقليل تدفق الغاز الناقل (50-100 مل / دقيقة أو أقل) لتجنب الهدر وتلوث البيئة (التخدير المتطاير له خصائص غازات الدفيئة). يعتمد الحد الأدنى من التدفق الضروري للحفاظ على تركيز بخار الحالة المستقرة في المقام الأول على تسرب SAA ، حيث أن امتصاص البخار بواسطة الذباب لا يكاد يذكر. في ظل هذه الظروف القياسية (2٪ إيزوفلوران و 1.5 لتر / دقيقة تدفق الغاز الناقل) ، يتم تخدير الذباب (أي غير متحرك) في جميع مواضع المصفوفة في غضون 3-4 دقائق ، مع وجود اختلافات غير ملحوظة بين المواضع. يمكن إعطاء VGAs لمدة دقائق إلى ساعات ، ونماذج التعرض النموذجية لدينا في حدود 15 دقيقة إلى 2 ساعة. لشطف النظام ، يتم إيقاف تشغيل المرذاذ ، ويتم الحفاظ على التدفق لتبادل ما يقرب من 10 أضعاف أحجام الصفيف (1.5 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق). تختلف سرعة التخلص من التخدير باختلاف معدل التدفق المحدد.

تتفاعل عوامل التخدير المتطايرة مع العديد من الأهداف التي لا تزال مجهولة الهوية ، بما في ذلك نظام الالتهاب المناعي⁶. إن مساهمة الأهداف الجزيئية الفردية في النتائج الأولية مقابل النتائج الجانبية ("حالة التخدير" مقابل "الآثار الجانبية" طويلة وقصيرة الأجل) غير مفهومة بشكل جيد. لذلك ، يعد نظام الذباب الحساس عالي الإنتاجية ذا قيمة لإبلاغ التجارب في الحيوانات العليا ، على الرغم من الاختلافات الواضحة بين الذباب والثدييات⁷. بعض الاختلافات ، في الواقع ، يمكن أن تكون مفيدة. على سبيل المثال ، يختلف الجهاز المناعي للذبابة عن الحيوانات العليا من حيث أنه يفتقر إلى الذراع التكيفي للاستجابة⁸. في حين أن هذا قد يبدو وكأنه قيد لفهم المرض لدى البشر ، إلا أنه يوفر فرصة فريدة لدراسة تفاعل VGAs مع الاستجابة الالتهابية المناعية الفطرية بمعزل عن الاستجابة التكيفية⁹. وهذا يسمح بدراسات التأثيرات الدوائية ل VGA على الالتهاب وتعديلها من خلال الخلفيات الجينية المتنوعة الموجودة في السكان.

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في البروتوكول.

1. بناء SAA

1. اصنع الإطار عن طريق قطع الخشب وتجميع الإطار باستخدام الأبعاد الواردة في الشكل 1 أ.
2. تعديل 50 مل من أغطية الأنابيب المخروطية.
   1. حفر فتحتين في كل غطاء مع 9/32 في مثقاب الثقاب. صنفر الثقوب لتنظيف البلاستيك الخشن. صنفر الجزء العلوي من الغطاء لتخشين السطح (وهذا يساعد في التصاق الغراء).
   2. قم بقص 5 مل من الماصات المصلية حسب الحجم (3 بوصات للتدفق الداخلي و 1.5 بوصة للتدفق الخارجي) عن طريق تسجيل البلاستيك ثم كسره نظيفا عند الخط المسجل. صنفر نهايات الماصات المقطوعة / المكسورة.
   3. شبكة الغراء على الأنابيب (السماح بوقت تجفيف مناسب للمادة اللاصقة). قطع المعاوضة إلى حجم الأنبوب بعد أن يجف اللاصق.
   4. أدخل الأنابيب في فتحات الأغطية المخروطية مع امتداد كلا الأنبوبين (3/4 بوصة) فوق الغطاء ؛ تأكد من أن أنبوب التدفق يمتد إلى الأنبوب لفترة أطول من التدفق الخارجي (الشكل 1 ب).
   5. ضع الغراء على قمم الأغطية حول الأنابيب لتثبيت الأجزاء معا (اترك وقت تجفيف مناسب للمادة اللاصقة قبل المتابعة).
3. قم بتوصيل الأغطية بالإطار ، وقم بتوجيه الأنبوب (الشكل 1C).
   1. قم بتوصيل أربطة الكابلات اللاصقة بالإطار (3.25 في المسافة ، من المركز إلى المركز).
   2. تثبيت الأغطية على الإطار باستخدام الروابط المضغوطة ؛ قطع علامة ربطة عنق الرمز البريدي ينتهي قصيرة.
   3. قطع وتوصيل أطوال (9 بوصات) من أنابيب Tygon بأنابيب التدفق / التدفق على كل غطاء معدل (الشكل 1D). بدءا من نهاية المنبع ، قم بإرفاق التدفق أولا ، ثم قم بتوصيل الأنبوب من التدفق الخارجي بتدفق الموضع التالي.
   4. أضف مؤشر تدفق إلى "التدفق" الأكثر تفيا (الموضع 10 ، الشكل 1E).
   5. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل في الموضع الأول ، واملأه بالماء أسفل أنبوب التدفق مباشرة (الشكل 1F).
4. تحضير الواجهة للمبخر. قم بإزالة الغطاسات ، وقطع الشقوق من حقنتين سعة 10 مل (1/2 بوصة عميقة × 1/4 بوصة بعرض ، الشكل 1 ج) ، وأدخلها في تدفق المرذاذ وتدفقه مع توجيه الشقوق مباشرة نحو مقدمة المرذاذ لتتماشى مع الثقوب (الشكل 1 ح). اختياري: الصق المحاقن المعدلة في مكانها. إذا كان ذلك ميسور التكلفة ، فاستخدم مشعبا تجاريا (انظر جدول المواد للحصول على خيار واحد).
5. ربط النظام بأكمله. استخدم أنابيب Tygon لربط المكونات معا بالترتيب التالي: خزان غاز ناقل مع منظم > مقياس تدفق خاص بالغاز > مبخر > SAA (الشكل 1C).
6. املأ المواضع الفارغة على الصفيف بأنابيب مخروطية فارغة سعة 50 مل. قم بتشغيل خزان الغاز ، وافتح مقياس التدفق إلى ~ 2 لتر / دقيقة ، وقم بتشغيل المرذاذ إلى 0٪. تأكد من تدفق الغاز عبر النظام عن طريق فحص مقياس التدفق في أعلى المنبع للمبخر ومؤشر التدفق في اتجاه مجرى الغرفة الأخيرة من SAA للتدفق. بدلا من ذلك ، أدخل طرف الأنبوب في الماء ، وابحث عن الفقاعات.
   ملاحظة: نظرا لأن النظام غير مضغوط ، فإن عمود الماء الذي يزيد ارتفاعه عن بضعة سنتيمترات سيوقف التدفق. إذا لم يكن هناك تدفق في نهاية المصب للصفيف ، فتحقق مما يلي: يجب أن يكون المرذاذ قيد التشغيل للسماح بالتدفق ؛ تأكد من أن منظم الخزان وعدادات التدفق تسمح بالتدفق ؛ تحقق من مواضع الصفيف للتأكد من ثمل الأنابيب بإحكام ؛ وتحقق من وجود تسربات حول المادة اللاصقة على الأغطية المعدلة.

الشكل 1: بناء SAA. (أ) تخطيطي ، مع قياسات ، للإطار الخشبي الذي يدعم SAA. (ب) مقطع عرضي مخطط ، مع قياسات ، لغطاء معدل مع أنابيب تدفق وتدفق مصنوعة من ماصات مصلية سعة 5 مل. (ج) SAA المجمع (مستنسخ من Olufs et ^al.5) (د) تفاصيل غطاء مخروطي معدل سعة 50 مل يوضح أنابيب التدفق الداخلة والخارجة. (ه) التدفق الخارجي (الموضع 10) مع مؤشر التدفق. (F) أنبوب مملوء بالماء في المنبع (الموضع 1) لترطيب الغاز الناقل. يشير السهم الأحمر إلى مستوى الماء. (ز) حقنة توزيع معدلة سعة 10 مل للمشعب المؤقت. تبرز الدائرة الحمراء الشق المقطوع الواقع بين علامات 8 مل و 10 مل (أو 1/2 بوصة × 1/4 بوصة). (H) منظر خلفي لمبخر Tec7 يوضح إدخال واتجاه المحاقن المعدلة. توجد حقنة واحدة فقط في هذا العرض لإظهار ، على اليسار ، الثقب (السهم الأحمر) الذي يجب محاذاته مع شق المحقنة المعدلة. ملاحظة: سيؤدي اختلال محاذاة هذا الشق المقطوع وفتحة التدفق الخارجي إلى تعطيل إعطاء التخدير. هذا الجزء هو نقطة ضعف محتملة في هذا النظام المخصص. إذا كانت الأموال متاحة ، يجب استخدام مشعب تجاري. اختصار: SAA = مجموعة التخدير التسلسلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. قبل التعرض للتخدير

1. قبل أربع وعشرين ساعة أو أكثر من التعرض للمخدر ، قم بفرز مجموعات الذباب حسب الحاجة للتجربة باستخدام الطريقة المفضلة (على سبيل المثال ، CO₂ أو الأثير).

3. تشغيل SAA

1. نقل الذباب من قوارير الطعام إلى أنابيب مخروطية فارغة سعة 50 مل (بدون ثاني أكسيد الكربون₂).
   1. عد وسجل أي ذباب ميت قبل التعرض.
2. قم بفك وربط الأنابيب المخروطية سعة 50 مل مع الذباب على SAA.
3. قم بتشغيل الغاز الناقل ، واضبطه على معدل التدفق المطلوب.
   ملاحظة: نستخدم عادة 1-2 لتر / دقيقة.
4. اضبط مبخر التخدير على التركيز المطلوب.
   ملاحظة: نستخدم عادة 2٪ للأيزوفلوران و 3.5٪ للسيفوفلوران ، وهي جرعات متساوية في الثدييات¹⁰.
5. فضح الذباب للمدة المطلوبة (دقيقة: 15 دقيقة).
   ملاحظة: يوصى بوقت تعرض لا يقل عن 15 دقيقة لتجنب التباين المحتمل في التوازن عبر مواضع SAA. في هذا النظام ، يستغرق التخدير 2-3 دقائق لتحقيق التوازن في جميع المواقف.
6. في نهاية التعرض ، اغسل النظام بتدفق الغاز الطازج (ضبط المرذاذ على 0٪) عند 1.5 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق تقابل حوالي 10 أضعاف أحجام إجمالي حجم SAA.

4. قائمة مرجعية قبل بدء التجربة

1. افتح منظم الضغط العالي (أعلى خزان الهواء) تماما ، ثم أغلقه نصف دورة لضمان تدفق الغاز الناقل.
2. اتبع الأنبوب لكل سطر إلى i) مقاييس التدفق و ii) المرذاذ (تأكد من توصيل التدفق الداخل / الخارج بشكل صحيح) ، و iii) تحقق من مستوى التخدير في المبخرات.
3. بعد تحميل الغرف بالموضوعات ، تحقق من تدفق الهواء / الغاز باستخدام اختبار الفقاعة أو مؤشر التدفق.
   ملاحظة: لا تسمح بعض أجهزة التبخير بتدفق الهواء عندما يكون القرص في وضع إيقاف التشغيل.
4. عندما يتدفق الغاز ، تأكد من أن كلا من مقياس التدفق ومؤشر التدفق السفلي يشيران إلى التدفق.
5. في نهاية التجربة ، اترك 4-5 دقائق من تدفق الهواء لغسل المخدر.

يتم توفير رابط فيديو SAA هنا: طرق بحث Perouansky - قسم التخدير - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) استخدم مختبرنا SAA من أجل (i) دراسة تأثير النمط الجيني على الحساسية السلوكية للتخدير5 ؛ (ii) فحص طفرات الميتوكوندريا بحثا عن الآثار الجانبية للتخدير11 ؛ و (iii) التحقيق في الديناميكا الدوائية للأيزوفلوران والسيفوفلوران على النتائج في إصابات الدماغ الرضحية (TBI)12،13،14،15،16،17. تظهر النتائج المنشورة بوضوح أن الخلفية الجينية تؤثر على الديناميكا الدوائية ل VGAs المستخدمة سريريا فيما يتعلق بكل من النمط الظاهري التقليدي للتخدير والآثار الجانبية للسمية المخدرة ، وكذلك حماية الأنسجة5،11،13،14،15.

المثال التمثيلي 1 (الشكل 2): الانجراف الجيني في القدرة على الصمود أمام سمية الأيزوفلوران المكتشفة بواسطة ظروف تجريبية قابلة للتكرار بشكل موثوق
يعد اكتشاف التغير الكمي التدريجي في الوفيات الناجمة عن VGA بين ذباب ND2360114 المستزرع بشكل منفصل مثالا على فائدة المقارنات الموثوقة للديناميكا الدوائية المخدرة عبر المجموعات التجريبية باستخدام SAA. ND23 هو جين يشفر وحدة فرعية في قلب المركب الأول من mETC (مشابه ل Ndufs8 في الثدييات)18. الطفرات في هذه الوحدة الفرعية هي سبب لمتلازمة لي ، وهو مرض ميتوكوندريا مميت. لاحظنا ضعفا تدريجيا في النمط الظاهري للوفيات الناجم عن الأيزوفلوران بمرور الوقت في العديد من مخزونات ND2360114 متماثلة الزيجوت المستزرعة في وقت واحد في ظل ظروف المختبر القياسية (أي دون التعرض ل VGAs). حدث هذا التكيف التطوري مع سمية الأيزوفلوران في غياب أي تعرض ل VGAs وربما يكون تأثيرا جانبيا ل "البقاء للأصلح" داخل الأرصدة الطافرة. كان هذا التغيير التدريجي في حساسية الأيزوفلوران سيبقى غير معترف به بدون ثقتنا في أن الظروف التجريبية كانت متطابقة عبر المقايسات وبمرور الوقت. نستنتج أن الاختيار يفضل معدلات تأثيرات ND2360114 ، مع زيادة المرونة من قبيل الصدفة لسمية الأيزوفلوران. نظرا لأن الالتهاب في الجهاز العصبي المركزي يلعب دورا مهما في التسبب في متلازمة لي ، فقد يكون التطور الملحوظ للمقاومة ناتجا عن التغيرات التكيفية في الاستجابة الالتهابية المناعية الفطرية ، مع كون مقاومة سمية الأيزوفلوران منتجا ثانويا عرضيا.

الشكل 2: التباين في الوفيات الناجمة عن سمية الأيزوفلوران نتيجة للضغط التطوري في ذباب ND2360114. سبعة خطوط (A-G) معزولة من مجموعة واحدة من خلال تزاوج زوج واحد ، تم توسيعها واختبارها لمعدل الوفيات لمدة 24 ساعة (PM24) بعد التعرض لمدة ساعتين ل 2٪ إيزوفلوران (في عمر 10-13 يوما) تظهر تباينا في النمط الظاهري ناشئا عن مجموعة سكانية واحدة. تظهر البيانات كمخططات مربعة وشارب. تمثل المربعات الربعين الثاني والثالث من البيانات ، مع امتداد الشعيرات إلى الحد الأدنى والحد الأقصى لنقاط البيانات. يشار إلى المتوسط والوسيط بخطوط "+" وأفقية ، على التوالي. يتم عرض النسبة المئوية لوفيات النسخ المتماثلة الفردية (N) كدوائر. N = 3-4 قوارير من 20-50 ذباب / قارورة. قيمة P ل ANOVA عادي أحادي الاتجاه ؛ p = 0.012 يشير إلى اختلاف كبير بين الوسائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مثال تمثيلي 2 (الشكل 3): رسم توضيحي لتطبيق عالي الإنتاجية ل SAA للكشف عن تأثيرات الخلفية الجينية على الديناميكا الدوائية للأيزوفلوران
كمثال على الإنتاجية العالية للنظام ، يوضح الشكل 3 آثار التعرض المتطابقة للأيزوفلوران (15 دقيقة من 2٪ إيزوفلوران) قبل إصابة الدماغ الرضحية (TBI) 16 ، وهو بروتوكول يختبر التكييف المسبق للتخدير (AP) في نموذج الذبابةهذا 13،15،19. القراءة هي معدل الوفيات بعد 24 ساعة من تصحيح إصابات الدماغ الرضية للاستنزاف الطبيعي (MI24). في هذا النموذج ، استعادت جميع الذباب حركتها (أي كانت على قيد الحياة) في غضون 30 دقيقة بعد إصابات الدماغ الرضية ، وكانت الوفيات المسجلة في MI24 نتيجة لإصابة الدماغ الثانوية (sBI). في خطوط الطيران الأربعة ، خفضت AP مع isoflurane MI24 بدرجات مختلفة ، مما يشير إلى أن الاستجابة ل AP هي سمة كمية. نظرا لأن الاستجابة الالتهابية هي عامل مهم في المراضة من sBI ، فقد تتضمن AP تعديل الجهاز المناعي20.

الشكل 3: تأثير الخلفية الوراثية على قمع الوفيات (MI24) عن طريق التكييف المسبق مع الأيزوفلوران. أدى ذباب التكييف المسبق مع 15 دقيقة من 2٪ إيزوفلوران (أرجواني) إلى خفض مؤشر الوفيات عند 24 ساعة (MI24) في سلالات w 1118 و y1w1118 (p < 0.0001 و p = 0.036 ، على التوالي ). لم يكن MI 24 أقل بكثير في خطوط Oregon R (OR) و Canton S (CS) المشروطة مسبقا (p = 0.16 و p = 0.27 ، على التوالي). تظهر البيانات كمخططات مربعة وشارب. تمثل المربعات الربعين الثاني والثالث من البيانات ، مع امتداد الشعيرات إلى الحد الأدنى والحد الأقصى لنقاط البيانات. يشار إلى المتوسط والوسيط بخطوط "+" وأفقية ، على التوالي. يتم عرض قيم MI24 للتكرارات الفردية (N) كدوائر. N = 15-33 قارورة من 30-40 ذباب / قارورة للذباب المعالج بإصابات الدماغ الرضية. N = 2-15 قارورة من 30-40 ذباب / قارورة للضوابط غير المعالجة. قيم P من اختبار t للطالب غير المزاوج ثنائي الذيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.