مقالة منهجية

منصة المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلايا لتقييم مثبطات فيروس زيكا في الوقت الحقيقي

DOI:

10.3791/65149

⸱

مارس 24, 2023

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Rega Institute for Medical Research, Laboratory of Virology and Chemotherapy, KU Leuven

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نوضح هنا استخدام المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلايا (CEI) كطريقة سهلة ومباشرة للغاية لدراسة عدوى فيروس زيكا وتكراره في الخلايا البشرية في الوقت الفعلي. علاوة على ذلك ، فإن اختبار CEI مفيد لتقييم المركبات المضادة للفيروسات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقيس تقنية المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلايا (CEI) التغيرات في المعاوقة الناتجة عن طبقة أحادية الخلية الملتصقة المتنامية أو المتلاعب بها على آبار ألواح الاستزراع المدمجة مع الأقطاب الكهربائية. ويمكن استخدام هذه التقنية لرصد عواقب العدوى بفيروس زيكا (ZIKV) وتكاثر الخلايا الملتصقة في الوقت الحقيقي، لأن هذا الفيروس شديد الإمراض للخلايا. إنه اختبار مباشر لا يتطلب استخدام الملصقات أو الأساليب الغازية وله فائدة في توفير بيانات في الوقت الفعلي. تعتمد حركية عدوى ZIKV بشكل كبير على خط الخلية المستخدم ، وسلالة الفيروس ، وتعدد العدوى (MOI) ، والتي لا يمكن دراستها بسهولة باستخدام مقايسات نقطة النهاية التقليدية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام مقايسة CEI لتقييم وتوصيف المركبات المضادة للفيروسات ، والتي يمكن أن يكون لها أيضا خصائص مثبطة ديناميكية على مدار العدوى. تقدم مقالة الطرق هذه شرحا مفصلا للتنفيذ العملي لمقايسة CEI وتطبيقاتها المحتملة في أبحاث ZIKV والبحوث المضادة للفيروسات بشكل عام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترتبط فاشيات فيروس زيكا (ZIKV) بمضاعفات مرضية خطيرة ، مثل صغر الرأس ومتلازمة غيلان باريه1،2،3. على الرغم من أن الأوبئة المستقبلية معقولة بسبب عوامل الخطر المختلفة مثل انتشار توزيع البعوض الناقل وزيادة التحضر ، حتى الآن ، لم يصل أي لقاح أو دواء مضاد للفيروسات إلى السوق حتى الآن 3,4. ولذلك، ينبغي استكمال أساليب البحث التقليدية في فيروس زيكا بأدوات جديدة لدراسة هذا الفيروس ومركباته المحتملة المضادة للفيروسات. غالبا ما تعتمد الأبحاث المضادة للفيروسات على مقايسات النمط الظاهري ، حيث تكون نقطة النهاية هي وجود معلمة محددة ، مثل ظهور تأثير الاعتلال الخلوي الناجم عن الفيروس (CPE) أو إنتاج بروتين معين يسببه الفيروس عن طريق جين مراسل5،6،7. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها قراءات نقطة النهاية ، وهي كثيفة العمالة ، وقد تتطلب تحليلا معقدا. لذلك ، توفر الطرق القائمة على المعاوقة بديلا جذابا.

تعرف المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلية (CEI) بأنها مقاومة تدفق التيار من قطب كهربائي إلى آخر ، بسبب طبقة خلية ملتصقة بذر على آبار تحتوي على قطب كهربائي. تقنية CEI الراسخة المستخدمة في هذه المنهجية هي استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية (ECIS) ، الذي طوره في الأصل Giaever و Keese 8,9. يستخدم هذا في مجال واسع من مجالات البحث البيولوجي ، مثل ورم خبيث للسرطان ، وعلم السموم ، والتئام الجروح10،11،12. يعتمد مبدأه على مجال كهربائي يتم إنشاؤه بواسطة اكتساح مستمر لجهد التيار المتردد (AC) على نطاق من الترددات13. تتعرض الخلايا لهذه المجالات الكهربائية غير الغازية ، وعلى فترات محددة مسبقا ، يتم قياس تغيرات المعاوقة الناتجة عن نمو الخلايا أو التغيرات في التصاق الخلية أو مورفولوجيا14. علاوة على ذلك ، تؤدي قابلية بقاء الخلية المتغيرة أيضا إلى تغييرات في المعاوقة ، مما يجعل التكنولوجيا أداة مفيدة لمراقبة العدوى بالفيروسات المسببة للأمراض الخلوية15،16،17. نظرا لأنه سيتم اكتشاف التغيرات المورفولوجية لطبقة الخلية في النطاق النانوي ، فإن التكنولوجيا توفر أداة كشف حساسة للغاية. يعد اختبار CEI الموصوف في هذه المقالة طريقة سهلة وغير جراحية وفي الوقت الفعلي وخالية من الملصقات لقياس تغيرات مقاومة طبقة الخلية بمرور الوقت.

على الرغم من أن CEI لم يستخدم لتقييم مسار عدوى ZIKV أو مضادات الفيروسات المحتملة ، فقد تم التحقيق في استخدامه كأداة تشخيصية قبل18. في دراسة حديثة ، تم التحقق من صحة استخدام مقايسة CEI لتحديد النشاط المضاد للفيروسات للعديد من مثبطات ZIKV في خلايا A549 لأول مرة19. تصف مقالة الطرق هذه مقايسة CEI هذه بمزيد من التفصيل وتوسعها لتشمل خطوط الخلايا الملتصقة المختلفة ، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من سلالات ZIKV في مضاعفات مختلفة للعدوى (MOI). بموجب هذا ، يتم إثبات الاستخدام المتنوع لهذه الطريقة في أبحاث الفيروسات المصفرة. تتمتع هذه الطريقة بفائدة حاسمة تتمثل في مراقبة الخلايا في الوقت الفعلي ، والتي تسمح باكتشاف النقاط الزمنية المهمة للعدوى ونشاط التثبيط الديناميكي بواسطة المركبات المضادة للفيروسات المحتملة. مجتمعة ، توفر تقنية CEI أداة قوية وقيمة لاستكمال المجموعة الحالية من منهجيات مكافحة الفيروسات.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنفيذ جميع الخطوات الموصوفة في ظروف معقمة في خزانة تدفق رقائقي لمختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2. تم الحصول على جميع الفيروسات المستخدمة واستخدامها على النحو المعتمد ، وفقا لقواعد مجلس المراجعة المؤسسية البلجيكي (Departement Leefmilieu، Natuur en Energie، بروتوكول SBB 219 2011/0011) ولجنة السلامة البيولوجية في KU Leuven.

1. صيانة زراعة الخلايا

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا البروتوكول مع مجموعة مختارة من خطوط الخلايا ، ولكن يمكن بالطبع تكييفه مع أي خط خلية ملتصق ، ولا يتطلب سوى تحسين كثافة بذر الخلايا.

  1. قم بتنمية خط خلايا الورم الغدي الرئوي البشري A549 ، وخط خلايا الورم الأرومي الدبقي الخبيث البشري U87 ، وخلايا الخلايا الليفية الرئوية الجنينية البشرية HEL 299 في قوارير ثقافة T75 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة مرطبة.
  2. زراعة الخلايا الفرعية عند التقاء 80٪ -95٪. يجب أن تكون جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل زراعة الخلايا.
  3. قم بإزالة وسط الثقافة المشروط من الخلايا. استخدم 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) لغسل الطبقة الأحادية للخلية مرة واحدة.
  4. توزيع 1 مل من 0.25٪ حمض التربسين-إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) بالتساوي على الطبقة الأحادية للخلية. ثم احتضان لمدة تصل إلى 3 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ الخلايا في الانفصال.
  5. أضف 9 مل من وسط النمو الكامل الطازج (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل). ماصة بلطف صعودا وهبوطا لإعادة تعليق الخلايا.
  6. انقل الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى دورق ثقافة T75 جديد وأضف حجما مناسبا من وسط النمو الطازج للحصول على حجم إجمالي قدره 15 مل.
    ملاحظة: يتم استزراع خطوط الخلايا في المختبر المستخدمة في هذا البروتوكول في تخفيفات 1: 4 إلى 1: 10 ، اعتمادا على خط الخلية المحدد ، للسماح بظروف نمو مثالية. يتم إجراء الثقافات الفرعية كل 3-4 أيام ، لذلك يمكن أن يختلف حجم تعليق الخلية المطلوب أيضا بناء على عدد أيام الحضانة.

2. إعداد لوحة CEI

  1. خذ صفيحة 96 بئرا مع أقطاب كهربائية متداخلة (انظر جدول المواد) واملأ جميع الآبار ب 100 ميكرولتر من وسط زراعة النمو.
  2. املأ الفراغات بين الآبار باستخدام DPBS.
    ملاحظة: يتم ذلك لتقليل تأثير الحافة بسبب التبخر الذي يتم ملاحظته عند زراعة الخلايا في 96 صفيحة بئر.
  3. احتضان اللوحة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5 ٪ CO2.

3. بذر الخلايا

  1. افصل الخلايا عن دورق المزرعة ، كما هو موضح في القسم 1 ، وأعد تعليقها في وسط نمو جديد في أنبوب سعة 50 مل.
  2. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام الطريقة التي تختارها.
    ملاحظة: في حالة خلايا A549 ، تصل الصلاحية بشكل عام إلى ~ 100٪. لتحديد رقم الخلية ، نستخدم نظاما آليا لتحليل الخلايا يعتمد على تلطيخ أكريدين البرتقالي / بروبيديوم يوديد (انظر جدول المواد). تعمل طرق عد الخلايا الأخرى بشكل جيد على قدم المساواة.
  3. أعد تعليق الخلايا في وسط نمو جديد للحصول على كثافة الخلية المطلوبة. في هذه الدراسة ، كثافة الخلايا المثلى A549 هي 0.15 × 106 خلايا (قابلة للحياة) / مل.
  4. أخرج اللوحة المكونة من 96 بئرا مع أقطاب كهربائية متداخلة من الحاضنة وقم بإزالة الوسط باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  5. استغني عن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (المقابلة ل 15 × 103 خلايا في هذه الحالة) لكل بئر في لوحة 96 بئرا.
  6. اترك الخلايا تتوازن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل وضعها في جهاز CEI.

4. إعداد وتشغيل مقايسة CEI

  1. ضع الحاضنة التي تضم حامل لوحة جهاز CEI عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. ضع لوحة 96 بئرا في الجهاز.
  3. افتح برنامج الجهاز وقم بإعداد تجربة جديدة بالنقر فوق إعداد في جزء تجميع البيانات. انتظر حتى يتصل الكمبيوتر المحمول بجهاز ECIS وقم بتكوين اللوحة عن طريق التحقق من مقاومة الآبار. تحقق مما إذا كانت جميع الآبار قد تم تكوينها بشكل صحيح ، كما هو موضح باللون الأخضر. إذا لم يكن كذلك ، كرر الخطوة 4.2 حتى تصبح جميع الآبار خضراء.
  4. في جزء تكوين البئر، حدد نوع الصفيف، وفقا لأداة الزراعة المستخدمة.
  5. حدد وضع التردد / الوقت المتعدد.
    ملاحظة: في هذا الوضع، يقيس الجهاز تغيرات المعاوقة في نطاق من الترددات.
  6. ابدأ القياس بالنقر فوق ابدأ.
    ملاحظة: يمكن مراقبة المعاوقة في الوقت الفعلي على واجهة البرنامج. حدد التردد المطلوب ليتم عرضه. في هذا المثال ، يتم اختيار 16 كيلو هرتز.

5. إعداد مركب والحضانة

ملاحظة: كمثال على مركب مضاد للفيروسات ، يتم استخدام Labyrinthopeptin A1 (انظر جدول المواد). نظرا لأنه يمكن تعميم هذا البروتوكول على جميع المركبات ذات النشاط المضاد للفيروسات المحتمل ، فإننا نشير إليه باسم "المركب".

  1. السماح بوسط زراعة الخلايا الكامل دون إضافة مصل بقري الجنين (FBS) (يشار إليه باسم "مخزن المقايسة") لتحقيق التوازن عند RT.
  2. الحفاظ على المركبات على الجليد.
  3. قم بإعداد تخفيف مركز 10x لكل مركب في وسط الفحص في أنابيب البولي بروبلين سعة 5 مل.
  4. قم بتخفيف المركبات بشكل متسلسل في وسط الفحص في أنابيب البولي بروبلين سعة 5 مل للحصول على تركيزات 10x المطلوبة.
  5. أوقف جهاز CEI مؤقتا بالنقر فوق إيقاف مؤقت في جزء إعداد تجميع البيانات. انتظر حتى تكتمل النقطة الزمنية الحالية وأخرج لوحة 96 بئرا.
  6. تحقق من الالتصاق وتكوين أحادي الطبقة للخلايا تحت المجهر الضوئي.
  7. قم بإزالة 20 ميكرولتر من كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  8. أضف 20 ميكرولتر من المحلول المركب أو المركبة في الآبار المطلوبة. قم بإعداد تخطيط بالشروط المحددة للسحب المناسب.
  9. احتضان الطبق لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: يتم استخدام حاضنة الخلايا العادية لخطوة الحضانة هذه بدلا من جهاز CEI. آبار التحكم في الخلايا (CC) هي آبار معالجة بالمركبات.

6. إعداد الفيروس والعدوى

  1. ذوبان قارورة من مخزون الفيروسات. في هذا المثال ، يتم استخدام ZIKV MR766 و ZIKV PRVABC59.
  2. تحضير تخفيفات الفيروسات في MOI المطلوب أو التخفيفات في وسط الفحص في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل.
    ملاحظة: في هذا المثال التمثيلي، يتم استخدام MOI 0.5 و 0.1 و 0.05 و 0.01 و 0.005 و 0.001 و 0.005 و 0.00005.
  3. أضف 100 ميكرولتر من تخفيف الفيروس في الآبار المخصصة للوحة البئر 96. إضافة وسيط فحص إلى آبار CC.
  4. تطهير حاويات الفيروسات المستخدمة.
  5. ضع اللوحة مرة أخرى في جهاز CEI وتابع القياسات لمدة 6 أيام متتالية بالنقر فوق استئناف التجربة.
    ملاحظة: آبار مكافحة الفيروسات (VC) هي خلايا مصابة معالجة بالمركبات ، بينما في آبار CC ، يتم إضافة وسيط الفحص بدلا من تخفيف الفيروس. إذا تم تقييم السمية الخلوية للمركبات ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الفحص بدلا من تخفيف الفيروس.

7. تحليل البيانات

  1. قم بإنهاء التجربة بالنقر فوق إنهاء وإضافة تعليقات ملخص اختيارية، مثل معلومات حول الشروط التجريبية المحددة في النافذة الظاهرة. انقر فوق موافق عند اكتمال جمع البيانات.
  2. حدد التردد المطلوب في لوحة الرسم البياني حيث يتم قياس أكبر فرق مقاومة بين CC و VC في نهاية التجربة.
    1. لتحديد أفضل تردد ، قم بإجراء تجربة تجريبية مع الخلايا غير المصابة والمصابة واختر التردد الذي - في النقطة الزمنية التي انخفضت فيها مقاومة الخلايا المصابة إلى مستوى خط الأساس - يؤدي إلى أكبر فرق مقاومة ملحوظ بين الخلايا غير المصابة والمصابة. في حالة خلايا A549 المصابة بفيروس ZIKV ، يكون هذا 16 كيلو هرتز.
  3. لتصدير جميع البيانات بتنسيق جدول بيانات، تأكد من تحديد جميع الآبار في جزء تكوين البئر وانقر فوق ملف | تصدير البيانات | بيانات الرسم البياني.
  4. تطبيع البيانات عن طريق طرح متوسط قيمة مقاومة VC المقاسة في نهاية التجربة من جميع نقاط البيانات وقسمة ذلك على متوسط قيمة مقاومة CC لآخر نقطة زمنية تم قياسها قبل الإصابة.
  5. ارسم البيانات التي تمت تسويتها في دالة الوقت للحصول على الرسوم البيانية لملف تعريف CEI.
  6. احسب المنطقة الطبيعية تحت المنحنى (AUCn) لكل حالة لتحديد معلمات مثل تركيزات مثبطة بنسبة 50٪ (IC50).
  7. احسب المعلمات المفيدة الأخرى ، مثل CIT50 ، على سبيل المثال ، لمقارنة عدوى سلالات الفيروسات المختلفة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة ، يتم وصف استخدام مقايسة CEI في أبحاث ZIKV بالتفصيل. يوضح الشكل 1 سير عمل هذا الفحص. نثبت راحة المراقبة في الوقت الفعلي لعدوى ZIKV في نوع الخلية المطلوب ، وكذلك تقييم تثبيط العدوى بواسطة مركب مضاد للفيروسات. كمثال مضاد للفيروسات ، نستخدم متاهة الببتيد الموصوفة جيدا A1 (Laby A1) ؛ نشير إلى هذا باسم "المركب" ، نظرا لأن خصائصه المحددة خارج نطاق مقالة الطرق هذه وتتم مناقشتها في مكان آخر20،21. وتجدر الإشارة إلى أن قابلية استنساخ الطريقة لم تتم مناقشتها في قسم النتائج ، لأننا نريد التركيز على ملفات تعريف المعاوقة الفردية التي تم الحصول عليها باستخدام المنهجية. ومع ذلك ، فقد تم وصف هذا سابقا19.

في المجموعة الأولى من التجارب ، نوضح أهمية تحسين كثافة الخلايا عند إجراء فحوصات عدوى CEI (الشكل 2). عندما يتم زرع عدد كبير جدا من الخلايا ، ستكون الطبقة الأحادية للخلية قد نمت بالكامل ولن تتمكن من الانتشار عبر أقطاب CEI. هذا يؤدي إلى اختلاف أصغر بين CC و VC ، وبالتالي دقة أقل ، مما يقلل من نافذة الكشف عن النشاط المضاد للفيروسات. ويتجلى ذلك جيدا في الشكل 2E. بالنسبة لبعض أنواع الخلايا الأكبر حجما ، مثل خلايا U87 ، قد يؤدي بذر الخلايا بكثافة كبيرة إلى انفصال كامل للطبقة الأحادية للخلية عند معالجة اللوحة ، كما هو موضح هنا (الشكل 2F). ويلاحظ هذا أيضا مجهريا.

يوضح الشكل 2 أيضا أن الفحص مفيد جدا لإجراء دراسات حساسية الخلايا. يتضح من الشكل 2 أ ، ب أن حركية العدوى تعتمد بشكل كبير على نوع الخلية. يوضح الشكل 2C أن خلايا U87 معرضة فقط للإصابة بعدوى ZIKV عند ارتفاع MOIs.

في المجموعة الثانية من التجارب ، تم تسليط الضوء على الاستخدام متعدد الاستخدامات لمقايسة عدوى CEI باستخدام سلالات ZIKV المختلفة في MOIs مختلفة وفي وجود مركب مضاد للفيروسات موصوف جيدا (الشكل 3). يتم إجراء هذه التجارب باستخدام خلايا A549 ، وهو نموذج شائع الاستخدام في أبحاث الفيروسات المصفرة22,23. تم استخدام خط الخلية هذا أيضا في دراسات أخرى أثبتت ملاءمته في فحوصات CEI24. أولا ، تتم مقارنة حركية العدوى بواسطة سلالة ZIKV التمثيلية من السلالة الأفريقية MR766 ، مع تلك الموجودة في السلالة الآسيوية PRVABC59. يوضح الشكل 3 أ أن كلتا السلالتين لهما أنماط CEI قابلة للمقارنة ، حيث يتمتع PRVABC59 بخصائص أبطأ قليلا تحفز CPE. ينعكس هذا أيضا من خلال قيم CIT50 (الشكل 3B). تم تقديم هذه المعلمة المثيرة للاهتمام لأول مرة بواسطة Fang et al.16 وتأخذ في الاعتبار حركية قياسات CEI. يتم تعريفه على أنه الوقت اللازم لتقليل المقاومة بنسبة 50٪ مقارنة بالتحكم في الخلية.

بعد ذلك ، أصيبت الخلايا بثلاثة MOIs مختلفة إما ZIKV MR766 أو PRVABC59 ، في وجود أو عدم وجود تركيزات مركبة مختلفة ، وتم رصد ملامح المعاوقة. وكما يلاحظ من الشكل 3C-H، فإن بعض تركيزات المركبات تمنع أو تؤخر انخفاض المعاوقة الناجم عن عدوى فيروس زيكا. ينعكس هذا أيضا عند حساب قيم AUC. تظهر نتائج فحص CEI أيضا بصريا أن النشاط المضاد للفيروسات يعتمد على MOI وعلى النقطة الزمنية لتقييم الفاعلية. يمكن استخدام حسابات AUCn لتحديد قيم IC50 ، كما هو موضح في الشكل 3I. أخيرا ، يوضح الشكل 3H أنه يمكن أيضا استخدام قيم CIT50 لتحديد ومقارنة القدرات المركبة. تتميز المركبات غير النشطة أو تركيزات المركبات بملفات تعريف CEI و AUC و CIT50 القيم المماثلة لتلك الخاصة ب VC.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على سير عمل الفحص. يتم تصوير الجدول الزمني وخطوات المناولة والحضانة المختلفة لفحص CEI هنا. الاختصارات: CEI = المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلية ؛ ZIKV = فيروس زيكا. د = أيام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: ملامح CEI الطبيعية للخلايا المصابة بفيروس ZIKV بكثافات مختلفة. (أ ، د) A549 ، (ب ، ه) HEL 299 ، أو (C ، F) تم زرع خلايا U87 في (A-C) 15000-20000 ("الأمثل") أو (D-F) 75000 خلية ("دون المستوى الأمثل") لكل بئر في لوحة CEI ذات 96 بئرا. بعد 24 ساعة من مراقبة المعاوقة ، أصيبت الخلايا بتخفيفات MOI عشرة أضعاف من ZIKV MR766. تم رصد المعاوقة بشكل أكبر لمدة 5 أيام متتالية. يتم عرض ملفات تعريف CEI (متوسط ± نطاق تكرارين تقنيين) لتجربة تمثيلية. الاختصارات: CEI = المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلية ؛ MOI = تعدد العدوى ؛ ZIKV = فيروس زيكا. القاعدة = تطبيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: ملامح CEI الطبيعية لخلايا A549 بعد الإصابة بسلالتين من ZIKV وتثبيطها بواسطة مركب مضاد للفيروسات. (أ) أصيبت خلايا A549 الملتصقة بمختلف MOIs إما ZIKV MR766 أو ZIKV PRVABC59 ، وتم رصد المعاوقة باستمرار. يتم عرض متوسط ± SD لثلاث نسخ مكررة تقنية لتجربة تمثيلية. (ب) تم حساب قيم CIT50 بناء على ملف تعريف CEI ل A ومقارنتها. يتم عرض متوسط ± SD لثلاث نسخ مكررة فنية تم إجراؤها. (سي - ه) عولجت خلايا A549 الملتصقة بتركيزات مركبة مختلفة وأصيبت بعد ذلك ب MOI محدد إما ZIKV MR766 (C-E) أو ZIKV PRVABC59 (F-H). تم مراقبة المعاوقة باستمرار. يتم عرض متوسط المدى ± لتكرارين تقنيين لتجربة تمثيلية. (ط) لمقارنة تثبيط المركب بسلالات وتخفيفات مختلفة من فيروس زيكا ، تم حساب AUCn ، وتم تحديد النسب المئوية المثبطة بطرح جميع الشروط بواسطة CC AUC n والقسمة على VCAUC n. (ي) حسبت قيم CIT50 للتجربة المبينة في C-H لمقارنة مختلف سلالات ZIKV و MOI. يتم عرض متوسط ± المدى لاثنين من النسخ المتماثلة التقنية. الاختصارات: CEI = المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلية ؛ MOI = تعدد العدوى ؛ ZIKV = فيروس زيكا. القاعدة = تطبيع ؛ CIT 50 = الوقت الذي انخفضت فيه المعاوقة بنسبة50٪ بالنسبة إلى السيطرة غير المعالجة ؛ AUC = مساحة تحت المنحنى ؛ CC = التحكم في الخلية ؛ VC = مكافحة الفيروسات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة استخدام مقايسة CEI في أبحاث ZIKV المضادة للفيروسات. وللفحص فائدة الرصد في الوقت الحقيقي، وبالتالي يمكن استخدامه لتقييم حركية عدوى فيروس زيكا وتثبيط مضادات الفيروسات بمركبات انتقائية. تسمح البيانات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة بمراقبة موضوعية وبصرية ل CPE الناجم عن الفيروس وفعالية مركب مضاد للفيروسات محتمل.

نظرا لأن CEI طريقة حساسة للغاية ، يجب توخي الحذر الشديد عند إجراء هذا الفحص الخلوي. من الأهمية بمكان إجراء سحب دقيق لتجنب اختلاف السحب قدر الإمكان. علاوة على ذلك ، يجب أن تظل العوامل الأخرى التي قد تؤثر على النتائج التجريبية ، مثل عدد الخلايا والمخزون الفيروسي المستخدم ، ثابتة بين تكرار التجربة. هذه هي العوامل التي تؤثر بشكل كبير على حركية نمو الخلايا والعدوى ، وبالتالي يمكن أن تؤدي إلى اختلاف في قيم CIT50 المحسوبة و / أو المعلمات الأخرى.

عند إجراء مقايسة CEI في وجود مركبات مضادة للفيروسات (محتملة) ، من المهم تحديد ما إذا كانت تؤثر على مقاومة الخلايا في حالة عدم وجود فيروس. هذه التقنية حساسة للغاية بحيث يمكن قياس تغيرات المعاوقة أقل بكثير من تركيزات المركب السامةللخلايا 19.

على الرغم من أن بيانات ZIKV فقط تظهر في هذه المقالة ، يمكن تطبيق الفحص بسهولة على الفيروسات المسببة للأمراض الخلوية (flavi) الأخرى ، مع الحد الأدنى من جهد التحسين ، مثل تحديد تردد مراقبة CEI الأمثل. تم استخدام تعديلات مقايسة CEI مع العديد من الفيروسات البشرية والحيوانية ، مثل الشيكونغونيا والأنفلونزا A وفيروسات الهربس البشرية والخيول25،26،27،28. هنا ، يتم استخدامه أيضا كطريقة بسيطة لقياس التتر الفيروسي أو لتحديد المركبات المضادة للفيروسات. استخدمت هذه الدراسات تحليل الخلايا في الوقت الفعلي ، وهي طريقة بديلة ل CEI.

يقتصر استخدام تقنية CEI على أنواع الخلايا الملتصقة ، حيث يعتمد مبدأ الفحص على خصائص الخلايا الملتصقة للانتشار عبر الآبار المدمجة في القطب الكهربائي. يمكن استخدام طلاء سطح الآبار مثل الفبرونيكتين لتحسين ارتباط الخلية29. المنهجية لها بعض العيوب الأخرى ، أولها يتعلق بتكلفتها. بصرف النظر عن الاستثمار في جهاز مراقبة CEI والبرامج الصلبة المصاحبة له ، فإن المواد الاستهلاكية باهظة الثمن إلى حد ما. علاوة على ذلك ، نظرا لأن البروتوكول يتطلب مراقبة العدوى الفيروسية لعدة أيام ، يمكن تقييم لوحة واحدة من 96 بئرا في الأسبوع. إلى جانب التكلفة العالية ، يحد هذا من الاستخدام لإعدادات الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة.

بسبب مشكلات الإنتاجية هذه ، فإن التكنولوجيا غير مناسبة لإعدادات الفحص المضاد للفيروسات. ومع ذلك ، فهو جذاب للغاية في المراحل التجريبية الأولية ، على سبيل المثال ، عند تقييم حساسية الخلايا لدراسة عدوى ZIKV في بيئة معينة مرتبطة بالمرض. هذه التقنية مفيدة أيضا مع خطوط الخلايا المنقولة أو الضربة القاضية لمراقبة التغيرات في حركية العدوى بسهولة ، على سبيل المثال ، في وجود أو عدم وجود مستقبلات دخول معينة. هذا مثير للاهتمام عند التحقيق في تورط العوامل الخلوية في عدوى ZIKV. علاوة على ذلك ، في المراحل قبل السريرية اللاحقة ، عندما يتم اختيار مرشح رئيسي معين ، يمكن استخدام اختبار CEI لمزيد من التوصيف المتعمق لمركب محدد. يمكن أيضا تعديل أجهزة الاستشعار الحيوية CEI عن طريق شل حركة بعض عناصر التعرف البيولوجي ، مثل الأجسام المضادة الخاصة بالفيروسات ، للكشف عن الفيروسات18. إجمالا ، يسلط هذا الضوء على الاستخدام المتنوع ل CEI في بيئة علم الفيروسات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤكد المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون كليمان هيمان وغوريت لوتسما على التدقيق اللغوي للمخطوطة. تم دعم الدراسة من خلال المنح الداخلية لمختبر علم الفيروسات والعلاج الكيميائي (معهد ريغا ، جامعة لوفين).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
A549 خلايامجموعة الثقافة من النوع الأمريكي (ATCC)CCL-185يتم زراعة هذه الخلايا في MEM Rega-3 مكملة بنسبة 10٪ FBS ، 2 ملي مولار L-glutamine ، 0.075٪ بيكربونات الصوديوم.
Acridine Orange / Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001وصمة عار حية / ميتة
أنابيب البولي بروبلين Cellstar ، 15 ملGreiner bio-one1،88،271
أنابيب البولي بروبيلين Cellstar ، 50 ملGreiner bio-one2،27،261
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM)Gibco ، Thermo Fisher Scientific41965-039وسط زراعة الخلايا ل U87 و HEL 299 خلية
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco ، Thermo Fisher Scientific14190-094
ECIS cultureware 96W20idfApplied BioPhysics96W20idfلوحة فحص PET لجهاز CEI
استشعار مقاومة الركيزة الخلية الكهربائية (ECIS) محطة صفيف Zالفيزياءالحيوية التطبيقيةجهاز CEI ، بما في ذلك محطة 96 بئر ووحدة تحكم خارجية وكمبيوتر محمول مع برنامج التحكم والاستحواذ والعرض. يتم تثبيت البرنامج اللازم قبل الشحن. ملاحظة: هذا الجهاز خارج الإنتاج حاليا وتم استبداله بجهاز ECIS Z-Theta الأكثر تقدما
البوليسترين فالكون ، 5 ملكورنينج352054
مصل الأبقار الجنينية (FBS)CytivaSV30160.03مضافة متوسطة لزراعة الخلايا لجميع الخلايا المستخدمة
HEL 299 خليةATCCCCL-137يتم زراعة هذه الخلايا في DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS و 0.01 M HEPES.
عازلة HEPES ، 1 MGibco ، Thermo Fisher Scientific15630-056مضافة متوسطة لثقافة الخلايا لخلايا U87
Labyrinthopeptin A1هدية من البروفيسور الدكتور رودريش إس & uuml. ssmuth ، جامعة Technische ä. برلين ، ألمانيامركب مضاد للفيروسات يستخدم كمثال في هذا البروتوكول. يتم إذابته في DMSO.
L-Glutamine ، 200 mMGibco ، Thermo Fisher Scientific25030-024مضافة متوسطة لزراعة الخلايا A549
عد الخلايا LunaLogos BiosystemsL12001
Luna-FL عداد خلايا الفلور المزدوجLogos BiosystemsL20001عداد بقاء الخلية
الحد الأدنى من المتوسط الأساسي Rega-3 (MEM Rega-3)Gibco ، Thermo Fisher Scientific19993013وسط زراعة الخلية لخلايا A549
بيكربونات الصوديوم ، 7.5٪جيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي25080-060مادة مضافة متوسطة لزراعة الخلايا لخلايا A549
قارورة زراعة الأنسجة T75TPPY9076
Trypsin-EDTA ، 0.25٪Gibco ، Thermo Fisher Scientific25200-056كاشف التفكك
U87 خلاياATCCHTB-14يتم زراعة هذه الخلايا في DMEM مع 10٪ FBS و 0.01 M HEPES.
  Virkon Rely + On tabletsLanxess115-0020مذاب مطهر
فيروس زيكا (ZIKV) MR766ATCCVR-84سلالة ZIKV النموذجية ، معزولة من Rhesus الحارس في أوغندا في عام 1968
ZIKV PRVABC59ATCCVR-1843سلالة ZIKV معزولة من مريض في بورتوريكو في عام 2015
أنابيب مادة مادة مادة شرائح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  2. Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  3. Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
  4. Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
  5. Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725(2018).
  6. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  7. Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  9. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  10. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792(2011).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309(2018).
  13. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  14. Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
  15. Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039(2017).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
  18. Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922(2022).
  19. Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122(2022).
  20. Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471(2020).
  21. Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
  22. Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
  23. Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503(2020).
  24. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  25. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  26. Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133(2021).
  27. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  28. Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
  29. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IC50

مقالات ذات صلة