Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

تمثل الطباعة 3D الدقيقة والقابلة للبرمجة لتركيبات الهيدروجيل المحملة بالخلايا التي تحاكي الأنسجة الرخوة في المختبر تحديا كبيرا. على سبيل المثال ، تعد المحاولات القائمة على البثق المباشر للهلاميات المائية اللينة مشكلة بطبيعتها ، حيث أن الخصائص الميكانيكية الضعيفة المطلوبة لتلخيص البيئة الدقيقة في الجسم الحي تؤدي إلى نقص السلامة الهيكلية ، أو تشوهات الميزات المحددة مسبقا ، أو الانهيار الكامل للهياكل المصنعة. يتمثل الحل التقليدي لهذه المشكلة في طباعة سقالة داعمة من مادة متوافقة حيويا أكثر صلابة تسمح للبنية النهائية بالحفاظ على شكلها. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يحد بشكل كبير من إمكانيات التصميم ويتطلب ضبطا ريولوجيا دقيقا للأحبار المجاورة.

للتغلب على قيود الطباعة ثلاثية الأبعاد التقليدية القائمة على البثق طبقة تلو الأخرى ، ظهرت الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة في السنوات الأخيرة كبديل قوي للمواد اللينة وتصنيع الأنسجة¹،²،³،^4،5،6. بدلا من بثق الحبر في الهواء المحيط أعلى السطح ، يتم ترسيب الحبر مباشرة من خلال إبرة حقنة داخل حمام دعم يشبه الصلابة أثناء الراحة ولكنه يميع بشكل عكسي حول طرف الإبرة المتحرك للسماح بالترسب الدقيق للمواد المحملة بالخلايا الناعمة. يتم الاحتفاظ بالمادة المترسبة في مكانها حيث يتماسك الدعم في أعقاب الإبرة. على هذا النحو ، تسمح الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة بتصنيع الأشكال الحرة عالية الدقة للهياكل المعقدة من المواد الحيوية اللينة مع إمكانيات تصميم موسعة ^7,8.

تم استكشاف المواد الهلامية الحبيبية على نطاق واسع كمواد حمام داعمة للطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ، حيث يمكن صياغتها لإظهار انتقالات سلسة وموضعية وقابلة للانعكاس من الصلب إلى السائل عند ضغوط منخفضة العائد⁹،^10،11. في حين أنها تظهر خصائص ريولوجية ممتازة للطباعة عالية الدقة ، فقد اقتصرت المواد الهلامية الحبيبية على حفنة من المواد الحيوية¹². إن الافتقار إلى التنوع في تركيبات الجل الحبيبي ، والذي يتضح بشكل خاص إذا أخذنا في الاعتبار المجموعة الواسعة من المواد الحيوية المتاحة لتركيبات الهيدروجيل السائبة ، ناتج عن الحاجة إلى توليد فعال من حيث التكلفة لعدد كبير من الهلاميات الدقيقة باستخدام مواد كيميائية بسيطة. نظرا لمحدودية مشهد المواد الحيوية لدعامات الهلام الحبيبي ، فإن ضبط البيئة المكروية خارج الخلية التي يوفرها دعم الطباعة يمثل تحديا في هذا المجال.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج معياري لتوليد دعامات الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ، والتي يطلق عليها مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء (SHAPE)¹³. يجمع هذا النهج بين الخصائص الريولوجية المميزة للمواد الهلامية الحبيبية مع التنوع الوظيفي الحيوي لتركيبات الهيدروجيل السائبة. يتكون دعم مركب SHAPE المقدم من جسيمات الجينات الدقيقة المعبأة (المرحلة الحبيبية ، ~ 70٪ جزء حجمي) مع مساحة خلالية متزايدة مملوءة بمحلول pregel ECM اللزج القائم على الكولاجين (المرحلة المستمرة ، ~ 30٪ جزء الحجم). وقد تبين كذلك أن دعم SHAPE يسهل ترسب الخلايا الجذعية العصبية البشرية (hNSCs) عالية الدقة والتي ، بعد تلدين حمام الدعم ، يمكن تمييزها إلى خلايا عصبية والحفاظ عليها لأسابيع للوصول إلى النضج الوظيفي. تتغلب الطباعة 3D المضمنة داخل حمام دعم SHAPE على بعض القيود الرئيسية المتعلقة بالتقنيات التقليدية للتصنيع الحيوي للأنسجة العصبية مع توفير منصة متعددة الاستخدامات.

يفصل هذا العمل خطوات الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ل hNSCs داخل دعم SHAPE وتمايزها اللاحق إلى خلايا عصبية وظيفية (الشكل 1). أولا ، يتم إنشاء الجسيمات الدقيقة للجينات عن طريق القص أثناء الهلام الداخلي. يسمح هذا النهج بتوليد كميات كبيرة من الجسيمات الدقيقة بسهولة دون الحاجة إلى معدات متخصصة وكواشف سامة للخلايا. علاوة على ذلك ، فإن الجينات هي مصدر مواد اقتصادي ومتاح على نطاق واسع لتشكيل ركائز هيدروجيل متوافقة حيويا لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. يتم دمج الجسيمات الدقيقة للجينات المتولدة مع محلول الكولاجين لتشكيل مادة دعم مركبة SHAPE. بعد ذلك ، يتم حصاد hNSCs وتحميلها في حقنة كحبر حيوي خلوي للطباعة 3D. يتم استخدام طابعة حيوية 3D للطباعة المضمنة القائمة على البثق ل hNSCs داخل مركب SHAPE. يتم تمييز الخلايا المطبوعة 3D إلى خلايا عصبية لتؤدي إلى بنى عصبية بشرية محددة مكانيا ووظيفية. أخيرا ، يصف البروتوكول كيف يمكن وصف تركيبات الأنسجة المتولدة باستخدام تصوير الخلايا الحية والكيمياء المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير نصائح للتحسين واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. والجدير بالذكر أنه يمكن تبادل كل من مكونات المرحلتين الحبيبية والمستمرة مع تركيبات هيدروجيل أخرى لاستيعاب مختلف الأجزاء الوظيفية الحيوية ، والخواص الميكانيكية ، وآليات التشابك ، كما هو مطلوب من قبل أنواع الخلايا والأنسجة الأخرى خارج التطبيقات العصبية.

1. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف

1. تحضير وسط نمو الخلايا عن طريق إضافة المكملات التالية إلى DMEM / F12 مع ثنائي ببتيد L-alanyl-L-glutamine: 30 mM الجلوكوز ، 5 μM HEPES ، 0.5٪ w / v ألبومين مصل الأبقار الغني بالدهون ، 40 ميكرومتر L- ألانين ، 40 ميكرومتر L- أسباراجين أحادي الهيدرات ، 40 ميكرومتر L- حمض الأسبارتيك ، 40 ميكرومتر L- حمض الجلوتاميك ، 40 ميكرومتر L- البرولين ، 1٪ N2 الملحق ، 1٪ البنسلين الستربتومايسين ، و 20 نانوغرام / لتر لكل من عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF). نفذ هذه الخطوات على مقعد تدفق الهواء الرقائقي (LAF).
2. قم بإعداد محلول ألجينات 1٪ وزن / وزن في ماء عالي النقاء عن طريق التقليب بقوة لمدة 4 ساعات عند 60 درجة مئوية. قم بتصفية محلول الجينات الساخن المذاب المعقم باستخدام مرشح بحجم المسام 0.45 ميكرومتر في مقعد LAF. احفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: إذا كانت درجة حرارة محلول الجينات أقل من 60 درجة مئوية ، فلن يكون من الممكن تمريره عبر الفلتر.
3. قم بإعداد محلول NaHCO₃₇ جم / لتر في ماء عالي النقاء. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 9.5 باستخدام NaOH ، وقم بتعقيمه بالفلتر في مقعد LAF. يخزن المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. شكل إعداد المواد المركبة

1. توليد الجسيمات الدقيقة الجينات
   1. تحضير محلول CaCO₃ سعة 2 ملغ/مل في ماء فائق النقاء في دورق معقم. امزجه 1: 1 مع محلول الجينات ، وحركه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام محرك مغناطيسي.
   2. أضف حمض الأسيتيك بنسبة 1: 500 ، واتركه مع التحريك طوال الليل عند 650 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: سيبدأ محلول الجينات في التبلور على الفور. تأكد من استخدام مغناطيس تحريك بنفس طول قطر الأواني الزجاجية المستخدمة لضمان التقليب الأمثل والمتجانس لجل التشكيل. في اليوم التالي ، سيظهر المحلول الناتج عن التحريك أثناء الهلام لزجا (الشكل 2 أ).
   3. قم بتجزئة محلول الجينات الهلامي ميكانيكيا إلى جسيمات دقيقة عن طريق تجانسه عند 15000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق باستخدام خالط يوضع في مقعد LAF (الشكل 2 ب).
   4. أجهزة الطرد المركزي الجسيمات الدقيقة عند 18500 × جم لمدة 20 دقيقة (الشكل 2C) في درجة حرارة الغرفة.
   5. تخلص بعناية من المادة الطافية داخل مقعد LAF ، وأعد تعليق الجسيمات في DMEM التي تحتوي على 2 mM NaOH و 1٪ P / S ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية (الشكل 2D).
      ملاحظة: يجب أن يعود لون التعليق إلى اللون الأحمر. إذا ظل التعليق أصفر ، أضف NaOH بالتنقيط ، واخلطه حتى يتحول إلى اللون الأحمر (الشكل 2E).
   6. تجانس الجسيمات عند 15000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 18500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   7. راقب الحبيبات (الشكل 2F) ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية.
      ملاحظة: يمكن تخزين حبيبات الجسيمات الدقيقة من الجينات المعبأة بإحكام عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. إذا لم يتم تعقيم محلول الجينات بالفلتر ، فيجب استخدام الجسيمات الدقيقة في غضون 1 أسبوع.
2. صياغة مركب الشكل
   1. في اليوم السابق للطباعة، أعد تعليق حبيبات الجسيمات الدقيقة للجينات في ضعف حجم وسط النمو الذي يحتوي على 4٪ HEPES (مخزون 1 M) ومحلول NaHCO₃ بنسبة 4٪ في مقعد LAF، واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
   2. قم بطرد مركزي لتعليق الميكروجيل عند 18500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
   3. قم بتحييد الكولاجين المراد مزجه مع جزيئات الجينات الدقيقة في مقعد LAF. قم بتخفيف محلول مخزون الكولاجين للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل ، وقم بتحييده بإضافة 4٪ HEPES و 4٪ NaHCO₃. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 3 مل من مركب SHAPE ، امزج 2 مل من جزيئات الجينات الدقيقة مع 1 مل من الكولاجين المحايد (0.12 مل من HEPES ، 0.12 مل من NaHCO₃ ، 0.16 مل من وسط النمو ، و 0.6 مل من الكولاجين).
      ملاحظة: يجب التعامل مع جميع المواد التي يتم خلطها مع الكولاجين على الثلج لتجنب بلمرة الكولاجين. بمجرد تحييد الكولاجين ، ستبدأ البلمرة ببطء.
   4. قم بتوليد مركب SHAPE عن طريق خلط حبيبات الجسيمات الدقيقة للجينات مع الكولاجين المخفف والمحايد بنسبة 2: 1. امزج الجل جيدا عن طريق سحب الثلج ببطء لأعلى ولأسفل في مقعد LAF.
      ملاحظة: لا دوامة ، لأن هذا سيؤدي إلى إدخال فقاعات في مادة الدعم.
   5. في مقعد LAF ، انقل المادة المركبة المتولدة إلى لوحة microwell مبردة أو أي حاوية طباعة مناسبة ، واستخدمها في غضون 30 دقيقة (الشكل 3E ، F).

3. ثقافة hNSC وإعداد الحبر الحيوي

1. استزراع الخلايا في قارورة T75 المغلفة بمستخلص الغشاء القاعدي في وسط النمو. قم بتمرير الخلايا مرتين على الأقل بعد الذوبان قبل استخدامها لتجربة الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D.
2. قبل الطباعة ، قم بفصل الخلايا إنزيميا باستخدام محلول التربسين 0.025٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وقم بتحييد التربسين بوسط النمو ، وقم بالطرد المركزي تعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، استنشاق المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات في 2-3 مل من وسط النمو.
3. قم بإجراء تعداد الخلايا ، وطرد الخلايا عند 400 × جم ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط نمو مكمل بصمغ الزانثان بنسبة 0.1٪ (لمنع الخلايا من الترسيب) بتركيز نهائي قدره 9 × 10⁶ خلايا / مل.
4. استخدم إبرة معدنية حادة 21 جراما لتحميل 100 ميكرولتر من جزيئات الجينات الدقيقة المعبأة بإحكام في حقنة (الشكل 3 أ).
   ملاحظة: يخدم إنشاء قابس باستخدام الجسيمات الدقيقة للجينات غرضين: فهو يساعد في الحفاظ على ثبات البثق أثناء الطباعة ويسمح بالبثق الكامل للحبر الخلوي المحمل (بدون حجم ميت).
5. باستخدام نفس الإبرة ، قم بتحميل تعليق الخلية المحضر في المحقنة (الشكل 3 ب).
   ملاحظة: احرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء أثناء خطوات تحميل المحقنة. سوف تتسبب فقاعات الهواء في عدم الاستقرار أثناء الطباعة.
6. استبدل إبرة التحميل بإبرة معدنية حادة 27 جم ، والتي سيتم استخدامها للطباعة (الشكل 3C).

4. الطباعة 3D جزءا لا يتجزأ من

1. تصميم هيكل للطباعة باستخدام البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: تأكد من ضبط الارتفاع الأولي للهيكل المطبوع إلى داخل عمق دعامة SHAPE المركبة. يمكن العثور على اقتراحات التصميم في الشكل 4 أ (التصاميم الحلزونية والخشبية).
2. قم بإنشاء رمز G بالنقر فوق إنشاء.
3. أدخل المحقنة الزجاجية المحملة بالخلايا في رأس بثق حجمي على طابعة حيوية قائمة على البثق (الشكل 3D).
4. قم بقياس طول إبرة المحقنة الزجاجية المحملة بالخلايا بالنقر فوق قياس طول الإبرة.
5. ضع لوحة أو حاوية microwell المحملة بمركب SHAPE على الطابعة.
   ملاحظة: احتفظ بلوحة الخلية أو الحاوية عند 4 درجات مئوية حتى الطباعة لمنع التشابك المبكر للدعامة.
6. قم بقياس ارتفاع سطح بئر فارغة داخل نفس لوحة أو حاوية microwell التي يتم فيها تحميل هلام SHAPE بالنقر فوق SHM (قياس ارتفاع السطح).
   ملاحظة: بدلا من ذلك ، حدد ارتفاع السطح يدويا عن طريق قياس ارتفاع البئر بالإبرة.
7. اضبط معدل البثق على 3.6 ميكرولتر / دقيقة ومعدل التغذية على 0.3 مم / ثانية.
   ملاحظة: تأكد من اختبار البثق قبل الطباعة. يمكن أن يتسبب ترسيب الخلايا في انسداد الفوهة ويمكن تجنبه عن طريق بثق حجم صغير مسبقا قبل الطباعة المضمنة الفعلية أو عن طريق إضافة حجم سحب إلى المحقنة الحجمية. في بعض الحالات ، يجب الحفاظ على معدل التغذية أقل من 0.5 مم / ثانية عند إدخال الإبرة في جل SHAPE أو الخروج منه لتجنب سحب الحبر.
8. قم بتحميل G-Code في واجهة المستخدم الخاصة بالطابعة.
   ملاحظة: يجب إنشاء رمز G جديد في كل مرة يتم فيها إجراء تغييرات على الهيكل المصمم.
9. ابدأ إجراء الطباعة بالنقر فوق تشغيل (الشكل 3G).
10. بعد الطباعة مباشرة، ضع جل SHAPE على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة للصلب.
11. أضف وسط النمو برفق فوق دعامة جل SHAPE الملدن.
12. في اليوم التالي ، استبدل وسط النمو بوسط تمايز تمت صياغته على النحو التالي: DMEM / F12 مع ثنائي ببتيد L-alanyl-L-glutamine مع 30 mM الجلوكوز ، 5 μM HEPES ، 0.5٪ w / v ألبومين مصل الأبقار الغني بالدهون ، 40 ميكرومتر L- ألانين ، 40 ميكرومتر L- أسباراجين مونوهيدرات ، 40 ميكرومتر L- حمض الأسبارتيك ، 40 ميكرومتر L- حمض الجلوتاميك ، 40 ميكرومتر L- برولين ، 1٪ N2 ملحق ، 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين ، 100 ميكرومتر ثنائي بوتيريل دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (dibutyryl-cAMP) ، و 2 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF).
    ملاحظة: تأكد من عدم إتلاف الهيدروجيل أثناء التغييرات المتوسطة. قم بإمالة اللوحة وإزالة الوسط القديم برفق. أضف وسطا جديدا بالتنقيط إلى جدار البئر الذي يحتوي على الجل بدلا من وضعه مباشرة فوق الجل. لا تستخدم شفاطا لإزالة الوسيط.
13. قم بتحديث وسيط التمايز كل 2 أيام حتى نقطة النهاية التجريبية.

5. التصوير الفلوري للخلايا الحية

1. إزالة المتوسطة الزائدة من الجل.
2. أضف حجما متساويا من 20 ميكرومتر Calcein AM (مخفف في وسط التمايز من محلول المخزون) إلى حجم هلام الدعم.
3. احتضان لمدة 40 دقيقة على 37 درجة مئوية.
4. قم بإزالة محلول Calcein AM ، وأضف حجما مناسبا من وسط التمايز الجديد.
5. نقل اللوحة إلى المجهر للتصوير.

6. الكيمياء المناعية

1. إزالة المتوسطة الزائدة من الجل.
2. باستخدام ملعقة صغيرة ، انقل الجل إلى حاوية أكبر تحتوي على DPBS.
3. اغسل ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في كل مرة باستخدام DPBS ، وانقل اللوحة إلى غطاء الدخان.
4. إزالة DPBS ، إضافة ما يكفي من محلول الفورمالديهايد 4 ٪ لتغطية هلام ، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 20 دقيقة في كل مرة.
6. تحضير محلول مانع يتكون من 5٪ مصل حمار ، 0.25٪ منظف ، و 0.02٪ أزيد صوديوم في DPBS.
   ملاحظة: تحضير ثلاثة أضعاف الحجم اللازم لتغطية الجل ؛ سيتم استخدامه لاحقا كأساس لحلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية.
7. بعد الغسيل باستخدام DPBS ، أضف محلول الحجب إلى الجل ، واحتضنه لمدة 6 ساعات في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد. هز الطبق برفق.
8. قم بإعداد محلول الجسم المضاد الأساسي عن طريق تخفيف الجسم المضاد TUBB3 في محلول مانع بنسبة 1: 1,000.
9. قم بإزالة محلول الحجب من الجل ، وأضف محلول الأجسام المضادة الأساسي ، واحتضن لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية. هز الطبق برفق.
10. اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 20 دقيقة في كل مرة.
11. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوي عن طريق تخفيف 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI ، 1: 1,000) والجسم المضاد الثانوي (1: 200) في محلول الحظر.
12. بعد الغسيل باستخدام DPBS ، احتضان الجل في محلول الأجسام المضادة الثانوي لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. هز الطبق برفق.
13. اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 20 دقيقة في كل مرة ، واحفظه على حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
14. قبل التصوير ، انقل الجل الملون باستخدام ملعقة إلى طبق أو صفيحة جيدة ذات قاع تصوير رفيع.

ينتج عن تحضير ميكروجيل الجينات عن طريق ترقق القص أثناء الهلام الداخلي متبوعا بالتفتيت الميكانيكي هلاميات ألجينات دقيقة متعددة التشتت في الحجم وتشبه التقشر في الشكل كما هو موضح في الشكل 2G. يتراوح حجم هذه الجسيمات غير المنتظمة من أقل من 1 ميكرومتر إلى حوالي 40 ميكرومتر في القطر. عندما تكون الجسيمات الدقيقة معبأة بإحكام ، فإنها تشكل مادة سائبة شفافة تكون أكثر عتامة قليلا من وسط زراعة الخلايا المقابل (الشكل 2F). تعد شفافية المواد الداعمة جانبا مهما من جوانب المنصة لأنها تسمح بتصور الهياكل المطبوعة خلال فترة الاستزراع ، وكذلك للفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة للتركيبات الموسومة بأصباغ الخلايا الحية وعبر الكيمياء المناعية. عند نقعها في وسط زراعة الخلايا المخزنة ، يجب أن يكون للهلام الناتج المعدل بالأس الهيدروجيني لون أحمر ، مما يشير إلى الظروف الفسيولوجية (الشكل 2F). من المهم تحييد الرقم الهيدروجيني للجسيمات الدقيقة للجينات لسببين. الجسيمات الدقيقة الحمضية يمكن أن تضر الخلايا مباشرة. علاوة على ذلك ، ستمنع البيئة الحمضية التلدين الناجح للدعم المركب SHAPE ، لأنه سيتداخل مع بلمرة الكولاجين.

تنتج طباعة حبر hNSC باستخدام المعلمات الموضحة أعلاه خيوط من الخلايا يبلغ قطرها ~ 200 ميكرومتر (الشكل 4A). يتم الحفاظ على الهندسة المبرمجة عند الطباعة في مستوى واحد وعند طباعة الهياكل فوق بعضها البعض. في حالة الطباعة متعددة الطبقات ، تظل الهياكل المطبوعة سليمة ، مع مسافة لا تقل عن طبقة إلى طبقة تبلغ 200 ميكرومتر13. يجب ألا تتأثر صلاحية الخلايا بشكل كبير أثناء تحضير الحبر وقذفه. الخيوط المطبوعة غنية بالخلايا الحية التي لها مورفولوجيا مستديرة (الشكل 4 ب ، يسار). يمكن أن تظهر الفجوات في الخيوط المطبوعة في اليوم التالي للطباعة ، حتى إذا لم تظهر البنية المصنعة أي تشوهات بعد الطباعة مباشرة. هذا على الأرجح نتيجة الخلط غير المتجانس للدعم. نظرا لأن الخلايا لا تتفاعل مع الجسيمات الدقيقة للجينات ، فإنها تهاجر بعيدا عن المناطق الغنية بالجينات نحو المناطق الغنية بالكولاجين والخلايا ، مما يتسبب في حدوث فواصل في الخيوط المطبوعة. علاوة على ذلك ، يجب أن يكون دعم SHAPE خاليا من الفقاعات ، لأن الجيوب الهوائية يمكن أن تتداخل مع دقة الطباعة.

يجب أن ينتج عن التمايز الناجح ل hNSCs هياكل غنية بالخلايا العصبية بعد 30 يوما من الطباعة ، حيث تظهر الخلايا مورفولوجيا عصبية بأجسام خلايا صغيرة وعمليات رفيعة طويلة (الشكل 4B ، يمين). علاوة على ذلك ، إذا تمت طباعة أنماط كثيفة ، مثل ورقة مستطيلة من الخلايا ، فلا ينبغي أن تكون هناك أي فجوات أو مجاميع مرئية تتشكل أثناء التمايز ، ولكن يجب أن تظل طبقة مستمرة من الخلايا سليمة (الشكل 4C). في هذا البروتوكول ، يتم وصف إجراء للكيمياء المناعية الفلورية للعينات المطبوعة 3D. يسمح تلطيخ TUBB3 ، وهو علامة عصبية سيتوبلازمية ، بالتصور المباشر للشبكات العصبية المتولدة. يجب أن يكشف الفحص المجهري الفلوري للمطبوعات المتمايزة عن هياكل غنية ب TUBB3 وذات هندسة محفوظة (الشكل 4D ، يسار). أثناء عملية التمايز ، لا تهاجر الخلايا من الخيوط المطبوعة ، كما يمكن ملاحظته عن طريق تلطيخ نوى الخلية باستخدام DAPI (الشكل 4D ، الوسط). نتيجة لذلك ، يتم ملاحظة الأجسام العصبية داخل حدود الهندسة المطبوعة ، مع الإسقاطات المحورية التي تنبعث منها مئات الميكرومترات في دعم SHAPE المحيط بالبناء. يشير الاستكشاف المحوري للحجم المحيط إلى أن دعم SHAPE يوفر إشارات وظيفية حيوية تسمح بإيجاد المسار المحوري. يمكن استخدام علامات عصبية أكثر نضجا أو علامات خاصة بالنوع الفرعي في الكيمياء الخلوية المناعية لزيادة توصيف المجموعات العصبية المتولدة. علاوة على ذلك ، يمكن توصيف البنية العصبية المطبوعة باستخدام RT-qPCR أو الفيزيولوجيا الكهربية13. ومع ذلك ، فإن كلا النهجين يتطلبان إزالة الكولاجين باستخدام الكولاجين ، حيث تعيق طبقة الهيدروجيل استخراج الحمض النووي الريبي والوصول المادي إلى الخلايا باستخدام ماصة دقيقة.

الشكل 1: رسم توضيحي مفاهيمي لنهج الطباعة المضمنة SHAPE. يتم خلط محلول الكولاجين مع جزيئات الجينات الدقيقة لتشكيل مركب SHAPE. يستخدم مركب SHAPE كمادة دعم للطباعة 3D المضمنة ل hNSCs ، والتي يتم تمييزها إلى خلايا عصبية داخل الدعم الملدن. تسمح الخصائص الوظيفية الحيوية لمركب SHAPE للخلايا العصبية بتمديد الإسقاطات وملء الجزء الفارغ من الدعم بإسقاطاتها المحورية. تم تعديل هذا الرقم من Kajtez et al.13. الاختصارات: SHAPE = مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء ؛ hNSCs = الخلايا الجذعية العصبية البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحضير جسيمات الجينات الدقيقة. أ: محلول الجينات بعد الهلام طوال الليل. ب: الجسيمات الدقيقة الألجيناتية الناتجة عن التجانس. (ج) حبيبات الجسيمات بعد الطرد المركزي. (د) الحبيبات المعاد تعليقها في DMEM (E) قبل ضبط الأس الهيدروجيني وبعد ضبط الأس الهيدروجيني. (F) الجسيمات الدقيقة بعد الحضانة في وسط الليل والطرد المركزي. (ز) صورة برايت فيلد لجسيمات الجينات الدقيقة المصنعة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التحضير لعملية الطباعة ثلاثية الأبعاد. (أ) يتم تحميل سدادة ملاط (~ 100 ميكرولتر) في المحقنة متبوعة ب (ب) تحميل الحبر الحيوي الخلوي (هنا مكمل بخرز ملون لأغراض التصور). (ج) يتم استبدال الطرف البلاستيكي المخروطي (21 جم) المستخدم لتحميل الحبر بطرف إبرة معدني غير حاد 27 جم. (د) يتم إدخال المحقنة في رأس الطباعة 3D. (ه، و) يتم سحب مركب SHAPE في بئر من صفيحة 48 بئرا. يتم الاحتفاظ بالأنبوب الذي يحتوي على مركب SHAPE على الجليد عندما لا يتم التعامل معه. (G) يتم إدخال طرف إبرة الطباعة في دعامة SHAPE ، وتبدأ طباعة المسار المحدد بواسطة تصميم الكمبيوتر (هنا ، يتم تصوير طباعة اللولب). الاختصار: SHAPE = مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التركيبات العصبية المطبوعة 3D داخل الدعم المركب SHAPE . (أ) صور برايتفيلد ل hNSCs المطبوعة داخل هيدروجيل الدعم. يتم عرض تصميمات الإنشاءات الحلزونية (يسار) والخشب (يمين). (ب) تصوير الخلايا الحية لبناء مطبوع 3D في اليوم التالي للطباعة (يسار) وبعد التمايز العصبي (يمين). (ج) بناء مربع مطبوع 3D تمت إزالته من بئر استزراع مع ملعقة يعرض السلامة الهيكلية. (د) صور متحدة البؤر مضان لنفس البنية المربعة الموسومة مناعيا لعلامة عصبية (TUBB3) ومع نوى متقابلة (DAPI) تؤكد التمايز الناجح ل hNSCs داخل التركيبات المطبوعة ثلاثية الأبعاد. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر (أ ، يمين) ؛ 100 ميكرومتر (ب ، د). () عدلت اللوحتان جيم ودال في هذا الشكل من Kajtez et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.