يصف هذا العمل بروتوكولا للطباعة الحرة المضمنة 3D للخلايا الجذعية العصبية داخل مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء. يتيح البروتوكول الزخرفة القابلة للبرمجة لتركيبات الأنسجة العصبية البشرية المترابطة بدقة عالية.
مقالة منهجية
Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs
يفتح في علامة تبويب جديدة
في هذه المقالة
ملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ظهرت الطباعة 3D المضمنة للخلايا داخل وسيط دعم حبيبي في العقد الماضي كنهج قوي للتصنيع الحيوي الحر لتركيبات الأنسجة الرخوة. ومع ذلك ، فقد اقتصرت تركيبات الجل الحبيبية على عدد محدود من المواد الحيوية التي تسمح بتوليد كميات كبيرة من جزيئات الهيدروجيل الدقيقة بشكل فعال من حيث التكلفة. لذلك ، تفتقر وسائط دعم الهلام الحبيبي بشكل عام إلى الوظائف اللاصقة للخلايا والوظائف الإرشادية للخلايا الموجودة في المصفوفة الأصلية خارج الخلية (ECM).
لمعالجة هذا ، تم تطوير منهجية لتوليد مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء (SHAPE). تتكون مركبات SHAPE من طور حبيبي (هلاميات دقيقة) وطور مستمر (محلول ECM لزج) يسمحان معا بطباعة عالية الدقة قابلة للبرمجة وبيئة خارج الخلية وظيفية حيوية قابلة للتعديل. يصف هذا العمل كيف يمكن استخدام المنهجية المطورة للتصنيع الحيوي الدقيق للبنى العصبية البشرية.
أولا ، يتم تصنيع الجسيمات الدقيقة للجينات ، والتي تعمل كمكون حبيبي في مركبات SHAPE ، ودمجها مع مكون مستمر قائم على الكولاجين. بعد ذلك ، تتم طباعة الخلايا الجذعية العصبية البشرية داخل مادة الدعم ، متبوعة بتلدين الدعم. يمكن الحفاظ على التركيبات المطبوعة لأسابيع للسماح بتمايز الخلايا المطبوعة إلى خلايا عصبية. في الوقت نفسه ، تسمح المرحلة المستمرة للكولاجين بنمو المحور العصبي والترابط بين المناطق. أخيرا ، يوفر هذا العمل معلومات حول كيفية إجراء التصوير الفلوري للخلايا الحية والكيمياء المناعية لتوصيف التركيبات العصبية البشرية المطبوعة 3D.
المقدمة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمثل الطباعة 3D الدقيقة والقابلة للبرمجة لتركيبات الهيدروجيل المحملة بالخلايا التي تحاكي الأنسجة الرخوة في المختبر تحديا كبيرا. على سبيل المثال ، تعد المحاولات القائمة على البثق المباشر للهلاميات المائية اللينة مشكلة بطبيعتها ، حيث أن الخصائص الميكانيكية الضعيفة المطلوبة لتلخيص البيئة الدقيقة في الجسم الحي تؤدي إلى نقص السلامة الهيكلية ، أو تشوهات الميزات المحددة مسبقا ، أو الانهيار الكامل للهياكل المصنعة. يتمثل الحل التقليدي لهذه المشكلة في طباعة سقالة داعمة من مادة متوافقة حيويا أكثر صلابة تسمح للبنية النهائية بالحفاظ على شكلها. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يحد بشكل كبير من إمكانيات التصميم ويتطلب ضبطا ريولوجيا دقيقا للأحبار المجاورة.
للتغلب على قيود الطباعة ثلاثية الأبعاد التقليدية القائمة على البثق طبقة تلو الأخرى ، ظهرت الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة في السنوات الأخيرة كبديل قوي للمواد اللينة وتصنيع الأنسجة1،2،3،4،5،6. بدلا من بثق الحبر في الهواء المحيط أعلى السطح ، يتم ترسيب الحبر مباشرة من خلال إبرة حقنة داخل حمام دعم يشبه الصلابة أثناء الراحة ولكنه يميع بشكل عكسي حول طرف الإبرة المتحرك للسماح بالترسب الدقيق للمواد المحملة بالخلايا الناعمة. يتم الاحتفاظ بالمادة المترسبة في مكانها حيث يتماسك الدعم في أعقاب الإبرة. على هذا النحو ، تسمح الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة بتصنيع الأشكال الحرة عالية الدقة للهياكل المعقدة من المواد الحيوية اللينة مع إمكانيات تصميم موسعة 7,8.
تم استكشاف المواد الهلامية الحبيبية على نطاق واسع كمواد حمام داعمة للطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ، حيث يمكن صياغتها لإظهار انتقالات سلسة وموضعية وقابلة للانعكاس من الصلب إلى السائل عند ضغوط منخفضة العائد9،10،11. في حين أنها تظهر خصائص ريولوجية ممتازة للطباعة عالية الدقة ، فقد اقتصرت المواد الهلامية الحبيبية على حفنة من المواد الحيوية12. إن الافتقار إلى التنوع في تركيبات الجل الحبيبي ، والذي يتضح بشكل خاص إذا أخذنا في الاعتبار المجموعة الواسعة من المواد الحيوية المتاحة لتركيبات الهيدروجيل السائبة ، ناتج عن الحاجة إلى توليد فعال من حيث التكلفة لعدد كبير من الهلاميات الدقيقة باستخدام مواد كيميائية بسيطة. نظرا لمحدودية مشهد المواد الحيوية لدعامات الهلام الحبيبي ، فإن ضبط البيئة المكروية خارج الخلية التي يوفرها دعم الطباعة يمثل تحديا في هذا المجال.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج معياري لتوليد دعامات الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ، والتي يطلق عليها مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء (SHAPE)13. يجمع هذا النهج بين الخصائص الريولوجية المميزة للمواد الهلامية الحبيبية مع التنوع الوظيفي الحيوي لتركيبات الهيدروجيل السائبة. يتكون دعم مركب SHAPE المقدم من جسيمات الجينات الدقيقة المعبأة (المرحلة الحبيبية ، ~ 70٪ جزء حجمي) مع مساحة خلالية متزايدة مملوءة بمحلول pregel ECM اللزج القائم على الكولاجين (المرحلة المستمرة ، ~ 30٪ جزء الحجم). وقد تبين كذلك أن دعم SHAPE يسهل ترسب الخلايا الجذعية العصبية البشرية (hNSCs) عالية الدقة والتي ، بعد تلدين حمام الدعم ، يمكن تمييزها إلى خلايا عصبية والحفاظ عليها لأسابيع للوصول إلى النضج الوظيفي. تتغلب الطباعة 3D المضمنة داخل حمام دعم SHAPE على بعض القيود الرئيسية المتعلقة بالتقنيات التقليدية للتصنيع الحيوي للأنسجة العصبية مع توفير منصة متعددة الاستخدامات.
يفصل هذا العمل خطوات الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ل hNSCs داخل دعم SHAPE وتمايزها اللاحق إلى خلايا عصبية وظيفية (الشكل 1). أولا ، يتم إنشاء الجسيمات الدقيقة للجينات عن طريق القص أثناء الهلام الداخلي. يسمح هذا النهج بتوليد كميات كبيرة من الجسيمات الدقيقة بسهولة دون الحاجة إلى معدات متخصصة وكواشف سامة للخلايا. علاوة على ذلك ، فإن الجينات هي مصدر مواد اقتصادي ومتاح على نطاق واسع لتشكيل ركائز هيدروجيل متوافقة حيويا لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. يتم دمج الجسيمات الدقيقة للجينات المتولدة مع محلول الكولاجين لتشكيل مادة دعم مركبة SHAPE. بعد ذلك ، يتم حصاد hNSCs وتحميلها في حقنة كحبر حيوي خلوي للطباعة 3D. يتم استخدام طابعة حيوية 3D للطباعة المضمنة القائمة على البثق ل hNSCs داخل مركب SHAPE. يتم تمييز الخلايا المطبوعة 3D إلى خلايا عصبية لتؤدي إلى بنى عصبية بشرية محددة مكانيا ووظيفية. أخيرا ، يصف البروتوكول كيف يمكن وصف تركيبات الأنسجة المتولدة باستخدام تصوير الخلايا الحية والكيمياء المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير نصائح للتحسين واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. والجدير بالذكر أنه يمكن تبادل كل من مكونات المرحلتين الحبيبية والمستمرة مع تركيبات هيدروجيل أخرى لاستيعاب مختلف الأجزاء الوظيفية الحيوية ، والخواص الميكانيكية ، وآليات التشابك ، كما هو مطلوب من قبل أنواع الخلايا والأنسجة الأخرى خارج التطبيقات العصبية.
البروتوكول
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف
- تحضير وسط نمو الخلايا عن طريق إضافة المكملات التالية إلى DMEM / F12 مع ثنائي ببتيد L-alanyl-L-glutamine: 30 mM الجلوكوز ، 5 μM HEPES ، 0.5٪ w / v ألبومين مصل الأبقار الغني بالدهون ، 40 ميكرومتر L- ألانين ، 40 ميكرومتر L- أسباراجين أحادي الهيدرات ، 40 ميكرومتر L- حمض الأسبارتيك ، 40 ميكرومتر L- حمض الجلوتاميك ، 40 ميكرومتر L- البرولين ، 1٪ N2 الملحق ، 1٪ البنسلين الستربتومايسين ، و 20 نانوغرام / لتر لكل من عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF). نفذ هذه الخطوات على مقعد تدفق الهواء الرقائقي (LAF).
- قم بإعداد محلول ألجينات 1٪ وزن / وزن في ماء عالي النقاء عن طريق التقليب بقوة لمدة 4 ساعات عند 60 درجة مئوية. قم بتصفية محلول الجينات الساخن المذاب المعقم باستخدام مرشح بحجم المسام 0.45 ميكرومتر في مقعد LAF. احفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: إذا كانت درجة حرارة محلول الجينات أقل من 60 درجة مئوية ، فلن يكون من الممكن تمريره عبر الفلتر. - قم بإعداد محلول NaHCO37 جم / لتر في ماء عالي النقاء. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 9.5 باستخدام NaOH ، وقم بتعقيمه بالفلتر في مقعد LAF. يخزن المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. شكل إعداد المواد المركبة
- توليد الجسيمات الدقيقة الجينات
- تحضير محلول CaCO3 سعة 2 ملغ/مل في ماء فائق النقاء في دورق معقم. امزجه 1: 1 مع محلول الجينات ، وحركه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام محرك مغناطيسي.
- أضف حمض الأسيتيك بنسبة 1: 500 ، واتركه مع التحريك طوال الليل عند 650 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: سيبدأ محلول الجينات في التبلور على الفور. تأكد من استخدام مغناطيس تحريك بنفس طول قطر الأواني الزجاجية المستخدمة لضمان التقليب الأمثل والمتجانس لجل التشكيل. في اليوم التالي ، سيظهر المحلول الناتج عن التحريك أثناء الهلام لزجا (الشكل 2 أ). - قم بتجزئة محلول الجينات الهلامي ميكانيكيا إلى جسيمات دقيقة عن طريق تجانسه عند 15000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق باستخدام خالط يوضع في مقعد LAF (الشكل 2 ب).
- أجهزة الطرد المركزي الجسيمات الدقيقة عند 18500 × جم لمدة 20 دقيقة (الشكل 2C) في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص بعناية من المادة الطافية داخل مقعد LAF ، وأعد تعليق الجسيمات في DMEM التي تحتوي على 2 mM NaOH و 1٪ P / S ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية (الشكل 2D).
ملاحظة: يجب أن يعود لون التعليق إلى اللون الأحمر. إذا ظل التعليق أصفر ، أضف NaOH بالتنقيط ، واخلطه حتى يتحول إلى اللون الأحمر (الشكل 2E). - تجانس الجسيمات عند 15000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 18500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- راقب الحبيبات (الشكل 2F) ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية.
ملاحظة: يمكن تخزين حبيبات الجسيمات الدقيقة من الجينات المعبأة بإحكام عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. إذا لم يتم تعقيم محلول الجينات بالفلتر ، فيجب استخدام الجسيمات الدقيقة في غضون 1 أسبوع.
- صياغة مركب الشكل
- في اليوم السابق للطباعة، أعد تعليق حبيبات الجسيمات الدقيقة للجينات في ضعف حجم وسط النمو الذي يحتوي على 4٪ HEPES (مخزون 1 M) ومحلول NaHCO3 بنسبة 4٪ في مقعد LAF، واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
- قم بطرد مركزي لتعليق الميكروجيل عند 18500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
- قم بتحييد الكولاجين المراد مزجه مع جزيئات الجينات الدقيقة في مقعد LAF. قم بتخفيف محلول مخزون الكولاجين للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل ، وقم بتحييده بإضافة 4٪ HEPES و 4٪ NaHCO3. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 3 مل من مركب SHAPE ، امزج 2 مل من جزيئات الجينات الدقيقة مع 1 مل من الكولاجين المحايد (0.12 مل من HEPES ، 0.12 مل من NaHCO3 ، 0.16 مل من وسط النمو ، و 0.6 مل من الكولاجين).
ملاحظة: يجب التعامل مع جميع المواد التي يتم خلطها مع الكولاجين على الثلج لتجنب بلمرة الكولاجين. بمجرد تحييد الكولاجين ، ستبدأ البلمرة ببطء. - قم بتوليد مركب SHAPE عن طريق خلط حبيبات الجسيمات الدقيقة للجينات مع الكولاجين المخفف والمحايد بنسبة 2: 1. امزج الجل جيدا عن طريق سحب الثلج ببطء لأعلى ولأسفل في مقعد LAF.
ملاحظة: لا دوامة ، لأن هذا سيؤدي إلى إدخال فقاعات في مادة الدعم. - في مقعد LAF ، انقل المادة المركبة المتولدة إلى لوحة microwell مبردة أو أي حاوية طباعة مناسبة ، واستخدمها في غضون 30 دقيقة (الشكل 3E ، F).
3. ثقافة hNSC وإعداد الحبر الحيوي
- استزراع الخلايا في قارورة T75 المغلفة بمستخلص الغشاء القاعدي في وسط النمو. قم بتمرير الخلايا مرتين على الأقل بعد الذوبان قبل استخدامها لتجربة الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D.
- قبل الطباعة ، قم بفصل الخلايا إنزيميا باستخدام محلول التربسين 0.025٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وقم بتحييد التربسين بوسط النمو ، وقم بالطرد المركزي تعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، استنشاق المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات في 2-3 مل من وسط النمو.
- قم بإجراء تعداد الخلايا ، وطرد الخلايا عند 400 × جم ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط نمو مكمل بصمغ الزانثان بنسبة 0.1٪ (لمنع الخلايا من الترسيب) بتركيز نهائي قدره 9 × 106 خلايا / مل.
- استخدم إبرة معدنية حادة 21 جراما لتحميل 100 ميكرولتر من جزيئات الجينات الدقيقة المعبأة بإحكام في حقنة (الشكل 3 أ).
ملاحظة: يخدم إنشاء قابس باستخدام الجسيمات الدقيقة للجينات غرضين: فهو يساعد في الحفاظ على ثبات البثق أثناء الطباعة ويسمح بالبثق الكامل للحبر الخلوي المحمل (بدون حجم ميت). - باستخدام نفس الإبرة ، قم بتحميل تعليق الخلية المحضر في المحقنة (الشكل 3 ب).
ملاحظة: احرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء أثناء خطوات تحميل المحقنة. سوف تتسبب فقاعات الهواء في عدم الاستقرار أثناء الطباعة. - استبدل إبرة التحميل بإبرة معدنية حادة 27 جم ، والتي سيتم استخدامها للطباعة (الشكل 3C).
4. الطباعة 3D جزءا لا يتجزأ من
- تصميم هيكل للطباعة باستخدام البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تأكد من ضبط الارتفاع الأولي للهيكل المطبوع إلى داخل عمق دعامة SHAPE المركبة. يمكن العثور على اقتراحات التصميم في الشكل 4 أ (التصاميم الحلزونية والخشبية). - قم بإنشاء رمز G بالنقر فوق إنشاء.
- أدخل المحقنة الزجاجية المحملة بالخلايا في رأس بثق حجمي على طابعة حيوية قائمة على البثق (الشكل 3D).
- قم بقياس طول إبرة المحقنة الزجاجية المحملة بالخلايا بالنقر فوق قياس طول الإبرة.
- ضع لوحة أو حاوية microwell المحملة بمركب SHAPE على الطابعة.
ملاحظة: احتفظ بلوحة الخلية أو الحاوية عند 4 درجات مئوية حتى الطباعة لمنع التشابك المبكر للدعامة. - قم بقياس ارتفاع سطح بئر فارغة داخل نفس لوحة أو حاوية microwell التي يتم فيها تحميل هلام SHAPE بالنقر فوق SHM (قياس ارتفاع السطح).
ملاحظة: بدلا من ذلك ، حدد ارتفاع السطح يدويا عن طريق قياس ارتفاع البئر بالإبرة. - اضبط معدل البثق على 3.6 ميكرولتر / دقيقة ومعدل التغذية على 0.3 مم / ثانية.
ملاحظة: تأكد من اختبار البثق قبل الطباعة. يمكن أن يتسبب ترسيب الخلايا في انسداد الفوهة ويمكن تجنبه عن طريق بثق حجم صغير مسبقا قبل الطباعة المضمنة الفعلية أو عن طريق إضافة حجم سحب إلى المحقنة الحجمية. في بعض الحالات ، يجب الحفاظ على معدل التغذية أقل من 0.5 مم / ثانية عند إدخال الإبرة في جل SHAPE أو الخروج منه لتجنب سحب الحبر. - قم بتحميل G-Code في واجهة المستخدم الخاصة بالطابعة.
ملاحظة: يجب إنشاء رمز G جديد في كل مرة يتم فيها إجراء تغييرات على الهيكل المصمم. - ابدأ إجراء الطباعة بالنقر فوق تشغيل (الشكل 3G).
- بعد الطباعة مباشرة، ضع جل SHAPE على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة للصلب.
- أضف وسط النمو برفق فوق دعامة جل SHAPE الملدن.
- في اليوم التالي ، استبدل وسط النمو بوسط تمايز تمت صياغته على النحو التالي: DMEM / F12 مع ثنائي ببتيد L-alanyl-L-glutamine مع 30 mM الجلوكوز ، 5 μM HEPES ، 0.5٪ w / v ألبومين مصل الأبقار الغني بالدهون ، 40 ميكرومتر L- ألانين ، 40 ميكرومتر L- أسباراجين مونوهيدرات ، 40 ميكرومتر L- حمض الأسبارتيك ، 40 ميكرومتر L- حمض الجلوتاميك ، 40 ميكرومتر L- برولين ، 1٪ N2 ملحق ، 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين ، 100 ميكرومتر ثنائي بوتيريل دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (dibutyryl-cAMP) ، و 2 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF).
ملاحظة: تأكد من عدم إتلاف الهيدروجيل أثناء التغييرات المتوسطة. قم بإمالة اللوحة وإزالة الوسط القديم برفق. أضف وسطا جديدا بالتنقيط إلى جدار البئر الذي يحتوي على الجل بدلا من وضعه مباشرة فوق الجل. لا تستخدم شفاطا لإزالة الوسيط. - قم بتحديث وسيط التمايز كل 2 أيام حتى نقطة النهاية التجريبية.
5. التصوير الفلوري للخلايا الحية
- إزالة المتوسطة الزائدة من الجل.
- أضف حجما متساويا من 20 ميكرومتر Calcein AM (مخفف في وسط التمايز من محلول المخزون) إلى حجم هلام الدعم.
- احتضان لمدة 40 دقيقة على 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة محلول Calcein AM ، وأضف حجما مناسبا من وسط التمايز الجديد.
- نقل اللوحة إلى المجهر للتصوير.
6. الكيمياء المناعية
- إزالة المتوسطة الزائدة من الجل.
- باستخدام ملعقة صغيرة ، انقل الجل إلى حاوية أكبر تحتوي على DPBS.
- اغسل ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في كل مرة باستخدام DPBS ، وانقل اللوحة إلى غطاء الدخان.
- إزالة DPBS ، إضافة ما يكفي من محلول الفورمالديهايد 4 ٪ لتغطية هلام ، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 20 دقيقة في كل مرة.
- تحضير محلول مانع يتكون من 5٪ مصل حمار ، 0.25٪ منظف ، و 0.02٪ أزيد صوديوم في DPBS.
ملاحظة: تحضير ثلاثة أضعاف الحجم اللازم لتغطية الجل ؛ سيتم استخدامه لاحقا كأساس لحلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية. - بعد الغسيل باستخدام DPBS ، أضف محلول الحجب إلى الجل ، واحتضنه لمدة 6 ساعات في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد. هز الطبق برفق.
- قم بإعداد محلول الجسم المضاد الأساسي عن طريق تخفيف الجسم المضاد TUBB3 في محلول مانع بنسبة 1: 1,000.
- قم بإزالة محلول الحجب من الجل ، وأضف محلول الأجسام المضادة الأساسي ، واحتضن لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية. هز الطبق برفق.
- اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 20 دقيقة في كل مرة.
- قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوي عن طريق تخفيف 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI ، 1: 1,000) والجسم المضاد الثانوي (1: 200) في محلول الحظر.
- بعد الغسيل باستخدام DPBS ، احتضان الجل في محلول الأجسام المضادة الثانوي لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. هز الطبق برفق.
- اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 20 دقيقة في كل مرة ، واحفظه على حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
- قبل التصوير ، انقل الجل الملون باستخدام ملعقة إلى طبق أو صفيحة جيدة ذات قاع تصوير رفيع.
النتائج
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ينتج عن تحضير ميكروجيل الجينات عن طريق ترقق القص أثناء الهلام الداخلي متبوعا بالتفتيت الميكانيكي هلاميات ألجينات دقيقة متعددة التشتت في الحجم وتشبه التقشر في الشكل كما هو موضح في الشكل 2G. يتراوح حجم هذه الجسيمات غير المنتظمة من أقل من 1 ميكرومتر إلى حوالي 40 ميكرومتر في القطر. عندما تكون الجسيمات الدقيقة معبأة بإحكام ، فإنها تشكل مادة سائبة شفافة تكون أكثر عتامة قليلا من وسط زراعة الخلايا المقابل (الشكل 2F). تعد شفافية المواد الداعمة جانبا مهما من جوانب المنصة لأنها تسمح بتصور الهياكل المطبوعة خلال فترة الاستزراع ، وكذلك للفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة للتركيبات الموسومة بأصباغ الخلايا الحية وعبر الكيمياء المناعية. عند نقعها في وسط زراعة الخلايا المخزنة ، يجب أن يكون للهلام الناتج المعدل بالأس الهيدروجيني لون أحمر ، مما يشير إلى الظروف الفسيولوجية (الشكل 2F). من المهم تحييد الرقم الهيدروجيني للجسيمات الدقيقة للجينات لسببين. الجسيمات الدقيقة الحمضية يمكن أن تضر الخلايا مباشرة. علاوة على ذلك ، ستمنع البيئة الحمضية التلدين الناجح للدعم المركب SHAPE ، لأنه سيتداخل مع بلمرة الكولاجين.
تنتج طباعة حبر hNSC باستخدام المعلمات الموضحة أعلاه خيوط من الخلايا يبلغ قطرها ~ 200 ميكرومتر (الشكل 4A). يتم الحفاظ على الهندسة المبرمجة عند الطباعة في مستوى واحد وعند طباعة الهياكل فوق بعضها البعض. في حالة الطباعة متعددة الطبقات ، تظل الهياكل المطبوعة سليمة ، مع مسافة لا تقل عن طبقة إلى طبقة تبلغ 200 ميكرومتر13. يجب ألا تتأثر صلاحية الخلايا بشكل كبير أثناء تحضير الحبر وقذفه. الخيوط المطبوعة غنية بالخلايا الحية التي لها مورفولوجيا مستديرة (الشكل 4 ب ، يسار). يمكن أن تظهر الفجوات في الخيوط المطبوعة في اليوم التالي للطباعة ، حتى إذا لم تظهر البنية المصنعة أي تشوهات بعد الطباعة مباشرة. هذا على الأرجح نتيجة الخلط غير المتجانس للدعم. نظرا لأن الخلايا لا تتفاعل مع الجسيمات الدقيقة للجينات ، فإنها تهاجر بعيدا عن المناطق الغنية بالجينات نحو المناطق الغنية بالكولاجين والخلايا ، مما يتسبب في حدوث فواصل في الخيوط المطبوعة. علاوة على ذلك ، يجب أن يكون دعم SHAPE خاليا من الفقاعات ، لأن الجيوب الهوائية يمكن أن تتداخل مع دقة الطباعة.
يجب أن ينتج عن التمايز الناجح ل hNSCs هياكل غنية بالخلايا العصبية بعد 30 يوما من الطباعة ، حيث تظهر الخلايا مورفولوجيا عصبية بأجسام خلايا صغيرة وعمليات رفيعة طويلة (الشكل 4B ، يمين). علاوة على ذلك ، إذا تمت طباعة أنماط كثيفة ، مثل ورقة مستطيلة من الخلايا ، فلا ينبغي أن تكون هناك أي فجوات أو مجاميع مرئية تتشكل أثناء التمايز ، ولكن يجب أن تظل طبقة مستمرة من الخلايا سليمة (الشكل 4C). في هذا البروتوكول ، يتم وصف إجراء للكيمياء المناعية الفلورية للعينات المطبوعة 3D. يسمح تلطيخ TUBB3 ، وهو علامة عصبية سيتوبلازمية ، بالتصور المباشر للشبكات العصبية المتولدة. يجب أن يكشف الفحص المجهري الفلوري للمطبوعات المتمايزة عن هياكل غنية ب TUBB3 وذات هندسة محفوظة (الشكل 4D ، يسار). أثناء عملية التمايز ، لا تهاجر الخلايا من الخيوط المطبوعة ، كما يمكن ملاحظته عن طريق تلطيخ نوى الخلية باستخدام DAPI (الشكل 4D ، الوسط). نتيجة لذلك ، يتم ملاحظة الأجسام العصبية داخل حدود الهندسة المطبوعة ، مع الإسقاطات المحورية التي تنبعث منها مئات الميكرومترات في دعم SHAPE المحيط بالبناء. يشير الاستكشاف المحوري للحجم المحيط إلى أن دعم SHAPE يوفر إشارات وظيفية حيوية تسمح بإيجاد المسار المحوري. يمكن استخدام علامات عصبية أكثر نضجا أو علامات خاصة بالنوع الفرعي في الكيمياء الخلوية المناعية لزيادة توصيف المجموعات العصبية المتولدة. علاوة على ذلك ، يمكن توصيف البنية العصبية المطبوعة باستخدام RT-qPCR أو الفيزيولوجيا الكهربية13. ومع ذلك ، فإن كلا النهجين يتطلبان إزالة الكولاجين باستخدام الكولاجين ، حيث تعيق طبقة الهيدروجيل استخراج الحمض النووي الريبي والوصول المادي إلى الخلايا باستخدام ماصة دقيقة.
الشكل 1: رسم توضيحي مفاهيمي لنهج الطباعة المضمنة SHAPE. يتم خلط محلول الكولاجين مع جزيئات الجينات الدقيقة لتشكيل مركب SHAPE. يستخدم مركب SHAPE كمادة دعم للطباعة 3D المضمنة ل hNSCs ، والتي يتم تمييزها إلى خلايا عصبية داخل الدعم الملدن. تسمح الخصائص الوظيفية الحيوية لمركب SHAPE للخلايا العصبية بتمديد الإسقاطات وملء الجزء الفارغ من الدعم بإسقاطاتها المحورية. تم تعديل هذا الرقم من Kajtez et al.13. الاختصارات: SHAPE = مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء ؛ hNSCs = الخلايا الجذعية العصبية البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحضير جسيمات الجينات الدقيقة. أ: محلول الجينات بعد الهلام طوال الليل. ب: الجسيمات الدقيقة الألجيناتية الناتجة عن التجانس. (ج) حبيبات الجسيمات بعد الطرد المركزي. (د) الحبيبات المعاد تعليقها في DMEM (E) قبل ضبط الأس الهيدروجيني وبعد ضبط الأس الهيدروجيني. (F) الجسيمات الدقيقة بعد الحضانة في وسط الليل والطرد المركزي. (ز) صورة برايت فيلد لجسيمات الجينات الدقيقة المصنعة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: التحضير لعملية الطباعة ثلاثية الأبعاد. (أ) يتم تحميل سدادة ملاط (~ 100 ميكرولتر) في المحقنة متبوعة ب (ب) تحميل الحبر الحيوي الخلوي (هنا مكمل بخرز ملون لأغراض التصور). (ج) يتم استبدال الطرف البلاستيكي المخروطي (21 جم) المستخدم لتحميل الحبر بطرف إبرة معدني غير حاد 27 جم. (د) يتم إدخال المحقنة في رأس الطباعة 3D. (ه، و) يتم سحب مركب SHAPE في بئر من صفيحة 48 بئرا. يتم الاحتفاظ بالأنبوب الذي يحتوي على مركب SHAPE على الجليد عندما لا يتم التعامل معه. (G) يتم إدخال طرف إبرة الطباعة في دعامة SHAPE ، وتبدأ طباعة المسار المحدد بواسطة تصميم الكمبيوتر (هنا ، يتم تصوير طباعة اللولب). الاختصار: SHAPE = مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التركيبات العصبية المطبوعة 3D داخل الدعم المركب SHAPE . (أ) صور برايتفيلد ل hNSCs المطبوعة داخل هيدروجيل الدعم. يتم عرض تصميمات الإنشاءات الحلزونية (يسار) والخشب (يمين). (ب) تصوير الخلايا الحية لبناء مطبوع 3D في اليوم التالي للطباعة (يسار) وبعد التمايز العصبي (يمين). (ج) بناء مربع مطبوع 3D تمت إزالته من بئر استزراع مع ملعقة يعرض السلامة الهيكلية. (د) صور متحدة البؤر مضان لنفس البنية المربعة الموسومة مناعيا لعلامة عصبية (TUBB3) ومع نوى متقابلة (DAPI) تؤكد التمايز الناجح ل hNSCs داخل التركيبات المطبوعة ثلاثية الأبعاد. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر (أ ، يمين) ؛ 100 ميكرومتر (ب ، د). () عدلت اللوحتان جيم ودال في هذا الشكل من Kajtez et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المناقشة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يوفر نهج المواد المركبة SHAPE طريقا متعدد الاستخدامات لصياغة حمامات الدعم القابلة للصلب والوظيفية الحيوية للطباعة 3D المضمنة للأحبار الخلوية. في حين أن هذا البروتوكول يوفر مثالا على الطباعة 3D للتركيبات العصبية ، يمكن بسهولة تكييف صندوق أدوات SHAPE مع التصنيع الحيوي مع مصادر الخلايا الأخرى للهندسة الدقيقة لمجموعة من أنواع الأنسجة المستهدفة. سيسمح نهج الطباعة أيضا بالتنميط الدقيق لأنواع متعددة من الخلايا لدراسة تفاعلها أو هندسة الأنسجة بترتيب مكاني محدد للحجرات الخلوية (مثل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية). على عكس المواد الهلامية الحبيبية التقليدية ، يحتوي مركب SHAPE على مساحة خلالية موسعة (~ 30٪ جزء حجم للصياغة المقدمة في هذا البروتوكول). يعمل المكون الحبيبي كمعدل ريولوجي يوفر للمركب خصائص مادية مواتية للطباعة المضمنة عالية الدقة. هذا يفتح طريقا نحو تصميم عقلاني للبيئة المكروية الخلوية عن طريق تغيير صياغة المكون المستمر مع الحفاظ على نفس المكون الحبيبي. على سبيل المثال ، يمكن إدخال جزيئات ECM وظيفية أخرى إلى حمام الدعم (على سبيل المثال ، حمض الهيالورونيك ، اللامينين ، الفبرونيكتين) ، أو يمكن الاستفادة من آليات التشابك المختلفة (على سبيل المثال ، الأنزيمية ، القائمة على الضوء)13. علاوة على ذلك ، يمكن استبدال الجينات الموجودة في المكون الحبيبي بجسيمات دقيقة من مواد هيدروجيل مختلفة (على سبيل المثال ، الجيلاتين8 ، البولي إيثيلين جلايكول 14،15 ، الأغاروز16) أو صنعها بأحجام وأشكال مختلفة بما يتماشى مع احتياجات هندسة الأنسجة المختلفة أو تطبيقات نمذجة الأمراض. يمكن ضبط النسبة بين المرحلة الحبيبية والمستمرة وفقا لاحتياجات مشاريع الطباعة ثلاثية الأبعاد الفردية ، ولكن زيادة المرحلة المستمرة إلى ما بعد 30٪ قد يضر بدقة الطباعة ودقتها.
أثناء خطوات إنتاج الميكروجيل ، من الأهمية بمكان أن يكون تقليب محلول الجينات بعد إضافة حمض الأسيتيك فعالا في جميع أنحاء حجم محلول التبلور. إذا كانت سرعة التحريك منخفضة جدا أو كان المحرك المغناطيسي صغيرا جدا ، فقد لا يصل التحريك إلى الطبقات العليا من المحلول ، والتي ستتحول إلى حجم كبير من هيدروجيل سائب متشابك ، بينما سيتم قص الطبقات السفلية. سيؤدي تجانس هيدروجيل الجينات المنفصم بشكل غير متسق إلى توليد جسيمات الجينات الدقيقة التي تكون دون المستوى الأمثل لتطبيقات الطباعة ثلاثية الأبعاد. علاوة على ذلك ، يجب خلط الجسيمات الدقيقة للجينات تماما مع محلول الكولاجين ، لأن الخليط غير المتجانس سيؤدي إلى بقع من مادة الدعم تفتقر إلى الكولاجين ؛ لن يتم تلدين هذه البقع ، وبالتالي ، ستفتقر إلى ميزات تفاعلية للخلية. يمكن أن تكون هناك أيضا بقع تفتقر إلى الجسيمات الدقيقة للجينات وبالتالي لن تدعم الطباعة. وبالتالي ، فإن دعم الطباعة المختلط بشكل غير متجانس لن يكون قادرا على دعم الطباعة عالية الدقة وسيتم اختراقه هيكليا ، حيث لن يتم تلدينه طوال حجمه. يجب أيضا تجنب الفقاعات ، ليس لأنها قد تكون ضارة للخلايا ، ولكن لأن الجيوب الهوائية يمكن أن تسبب تشوهات أثناء الطباعة وتتداخل مع تصوير البنيات. هناك مصدران شائعان للفقاعات هما الدوامة (الفقاعات الدقيقة في الدعامة الباردة التي تتوسع أثناء التلدين الداعم عند 37 درجة مئوية) والامتصاص القوي.
لم تتم صياغة دعم SHAPE المركب في هذا العمل كمادة قربانية يجب إزالتها بعد الطباعة ، بل كدعم وظيفي حيوي طويل الأجل لكل من تمايز الخلايا الجذعية ونمو الخلايا العصبية والنضج الوظيفي. بالمقارنة مع المواد الهلامية الحبيبية التي لم يتم تلدينها بعد الطباعة ، فإن الاستقرار الهيكلي والشفافية للمادة المركبة SHAPE الملدنة يوفران بيئة واقية للميزات العصبية الحساسة أثناء عملية التثبيت ووضع العلامات المناعية ، وعلى هذا النحو ، تسهل هذه المادة التوصيف المورفولوجي عبر تصور المستضدات. يمكن أيضا استخدام مراسلات التألق لتتبع التغيرات في التشكل الخلوي بمرور الوقت ، وكذلك لمراقبة الانتشار الخلوي والهجرة داخل دعم الطباعة الملدن. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام مناهج تصوير الكالسيوم لتوفير معلومات عن النشاط الخلوي التلقائي (على سبيل المثال ، إطلاق إمكانات الفعل في الخلايا العصبية أو حتى نشاط الشبكة العصبية المتزامنة). ومع ذلك ، قد يكون التحفيز الكيميائي للتركيبات الخلوية المهندسة (على سبيل المثال ، التحفيز العصبي باستخدام KCl) صعبا بسبب طبقة الهيدروجيل المحيطة بالخلايا ، والتي تبطئ الانتشار وتمنع التعديل الفوري للبيئة الدقيقة الخلوية. يقدم التحفيز البصري الوراثي خيارا أفضل للتحكم في النشاط الخلوي ، حيث أن الهلاميات المائية SHAPE لا تعيق الوصول البصري إلى الخلايا.
يمكن دمج الخرزات الحساسة للأكسجين في الحبر الحيوي أو في مادة الدعم (عن طريق الطباعة المباشرة أو التشتت أثناء التحضير المركب) للسماح برسم خرائط مكانية وزمانية حية لمستويات توتر الأكسجين داخل وحول التركيبات المطبوعة ذات الحساسيةالعالية 13. يوفر نهج رسم خرائط الأكسجين 3D غير الجراحي هذا المستند إلى قياسات عمر الفسفرة طريقا نحو هندسة تركيبات الأنسجة مع تحسين الأوكسجين ، ومن المحتمل أيضا تحسين إمدادات المغذيات. يمكن أن يؤدي ضعف الأوكسجين إلى تكوين مناطق نخرية داخل التركيبات المطبوعة ، ويتداخل مع تمايز الخلايا الجذعية ، ويؤثر على التمثيل الغذائي للخلايا العصبية. يوفر رسم خرائط الأكسجين قراءة يمكن على أساسها تغيير تصميم الطباعة 3D لتسهيل الأوكسجين الموحد في جميع أنحاء البناء ، أو ضبط مستويات الأكسجين لتتناسب مع الظروف الفسيولوجية ، أو توليد تدرجات الأكسجين.
يمكن أيضا دمج القنوات الهندسية داخل دعامة الطباعة القابلة للتلدين عن طريق طباعة حبر قرباني ، مثل الجيلاتين ، الذي يتصلب داخل حمام الدعم البارد ولكن يمكن إخلاؤه بسهولة عند 37 درجة مئوية 4,13. ستكون هناك حاجة إلى قنوات لتوفير المغذيات والأكسجين لتركيبات الأنسجة ذات الكثافة العالية للخلايا أو الأبعاد التي تتجاوز قدرات نهج معالجة توتر الأكسجين القائم على التصميم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الاستفادة من القنوات الشبيهة بالأوعية الدموية لإنشاء تدرجات من الجزيئات الصغيرة التي تدفع نمط الهوية الخلوية ، أو تعديل النشاط الخلوي ، أو توجيه الانجذاب الكيميائي.
باختصار ، توفر الطباعة 3D المضمنة داخل مركب SHAPE منصة مواد معيارية قابلة للتكيف بسهولة ولديها إمكانات متعددة الاستخدامات للنمذجة الوظيفية للأنسجة الحساسة ميكانيكيا. يقدم البروتوكول المقدم هنا شرحا مفصلا للخطوات اللازمة والمبادئ الأساسية اللازمة لتوليد مادة الدعم وطباعة الحبر الخلوي بدقة عالية. يستفيد النهج من المواد ذات الأسعار المعقولة والمعدات التي يمكن الوصول إليها مع توفير مساحة لتخصيص النهج لاحتياجات الباحثين الفرديين وتطبيقاتهم.
الإفصاحات
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تمويل البحث بشكل أساسي من قبل برنامج BrainMatTrain للاتحاد الأوروبي Horizon 2020 (رقم H2020-MSCA-ITN-2015) بموجب شبكة ماري سكودوفسكا - كوري للتدريب الأولي واتفاقية المنحة رقم 676408. يود كل من CR و JUL أن يعربا عن امتنانهما لمؤسسة Lundbeck (R250-2017-1425) وصندوق الأبحاث المستقل الدنماركي (8048-00050) لدعمهما. نحن نقدر بامتنان تمويل مشروع HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 مل حقنة غاستيد 1001 TLL | هاميلتون | 81320 | |
| طابعة 3DDiscovery ثلاثية الأبعاد | ريجنهيو | ||
| حمض الخليك | سيغما-ألدرتش | A6283 | |
| ألبوماكس | ثيرموفيشر | 11020021 | |
| الجسم المضاد الثانوي أليكسا فلور 488 | ثيرموفيشر | A-11001 | ماعز مضاد للفأر |
| بلنت نيدل، ستيريكان (21 جرم) | براون | 9180109 | |
| الإبرة القوية (27 ج) | سيلينك | NZ5270505001 | |
| برنامج BioCAD | سوليد ووركس | ||
| كالسين AM | ثيرموفيشر | 65-0853-39 | |
| كربونات الكالسيوم | سيغما-ألدرتش | C5929 | |
| ملح الصوديوم Dibutyryl-cAMP | سيغما-ألدرتش | D0627 | |
| كولاجين كولتريكس رات I (5 ملغ/مل) | R& دي سيستمز | 3440-100-01 | |
| DAPI | ثيرموفيشر | 62248 | |
| DMEM/F-12، غلوتاماكس | ثيرموفيشر | 10565018 | |
| مصل الحمار | سيغما-ألدرتش | D9663 | |
| DPBS | ثيرموفيشر | 14190094 | |
| EGF | R& دي سيستمز | 236-EG | |
| FGF | R& دي سيستمز | 3718-FB | |
| محلول الفورمالديهايد 4٪، مخزن، pH 6.9 | سيغما-ألدرتش | 100496 | |
| GDNF | R& دي سيستمز | 212-GD | |
| جيلتريكس | ثيرموفيشر | A1569601 | |
| الجلوكوز | سيغما-ألدرتش | G7021 | |
| مخزن HEPES (1 متر) | ثيرموفيشر | 15630080 | |
| إل-ألانين | سيغما-ألدرتش | 5129 | |
| إل-أسباريجين مونوهيدرات | سيغما-ألدرتش | A4284 | |
| حمض L-أسبارتيك | سيغما-ألدرتش | A9256 | |
| حمض إل-جلوتاميك | سيغما-ألدرتش | G1251 | |
| إل-برولين | سيغما-ألدرتش | P0380 | |
| الأساس المغناطيسي RET | إيكا | 3622000 | |
| ملحق N-2 | ثيرموفيشر | 17502048 | |
| البنسلين-ستريبتوميسين | ثيرموفيشر | 15140122 | |
| أداة التشتت S25N-10G | إيكا | 4447100 | |
| ألجينات الصوديوم (80-120 كوب مكعب) | فوجي فيلم واكو | 194-13321 | |
| أزيد الصوديوم | سيغما-ألدرتش | S2002 | |
| بيكربونات الصوديوم | سيغما-ألدرتش | S5761 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيغما-ألدرتش | S5881 | |
| متجانس T18 Digital ULTRA-TURAX | إيكا | 3720000 | |
| ترايتون X-100 | سيغما-ألدرتش | X100 | |
| حل تريبسين/إيدتا | ثيرموفيشر | R001100 | |
| الأجسام المضادة TUBB3 | بيو ليجند | 801213 | فأر |
| علكة زانثان | سيغما-ألدرتش | G1253 |
المراجع
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), e1500655(2015).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758(2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216(2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344(2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679(2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018(2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392(2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010(2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن