مقالة منهجية

عزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية لفئران Sprague Dawley

DOI:

10.3791/65172

⸱

أبريل 7, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول منهجية لعزل وتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الدهنية (MSCs) من فئران Sprague Dawley.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحدثت خلايا اللحمة المتوسطة البالغة ثورة في البيولوجيا الجزيئية والخلوية في العقود الأخيرة. يمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا المتخصصة ، بالإضافة إلى قدرتها الكبيرة على التجديد الذاتي والهجرة والانتشار. الأنسجة الدهنية هي واحدة من أقل المصادر الغازية والأكثر سهولة للخلايا الوسيطة. كما تم الإبلاغ عن أن لها غلات أعلى مقارنة بالمصادر الأخرى ، فضلا عن خصائص مناعية فائقة. في الآونة الأخيرة ، تم نشر إجراءات مختلفة للحصول على خلايا اللحمة المتوسطة البالغة من مصادر الأنسجة المختلفة والأنواع الحيوانية. بعد تقييم معايير بعض المؤلفين ، قمنا بتوحيد منهجية قابلة للتطبيق لأغراض مختلفة ويمكن استنساخها بسهولة. سمحت لنا مجموعة من الأجزاء الوعائية اللحمية (SVF) من الأنسجة الدهنية حول الكلى والبربخ بتطوير ثقافات أولية مع مورفولوجيا ووظائف مثالية. لوحظت الخلايا ملتصقة بالسطح البلاستيكي لمدة 24 ساعة ، وأظهرت مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية ، مع إطالة وميل لتشكيل مستعمرات. تم استخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي (FC) والتألق المناعي (IF) لتقييم التعبير عن علامات الغشاء CD105 و CD9 و CD63 و CD31 و CD34. كما تم تقييم قدرة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) على التمايز في السلالة الشحمية باستخدام مزيج من العوامل (4 ميكرومتر أنسولين ، 0.5 مللي متر 3-ميثيل أيزو بوتيل زانثين ، و 1 ميكرومتر ديكساميثازون). بعد 48 ساعة ، لوحظ فقدان تدريجي لمورفولوجيا الخلايا الليفية ، وفي 12 يوما ، تم تأكيد وجود قطرات دهنية إيجابية لتلطيخ الزيت الأحمر. باختصار ، يقترح إجراء للحصول على ثقافات ASC المثلى والوظيفية للتطبيق في الطب التجديدي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثرت الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بشدة على الطب التجديدي بسبب قدرتها العالية على التجديد الذاتي والانتشار والهجرة والتمايز إلى سلالات خلايا مختلفة 1,2. حاليا ، يركز قدر كبير من الأبحاث على إمكاناتها لعلاج وتشخيص الأمراض المختلفة.

هناك مصادر مختلفة لخلايا اللحمة المتوسطة: نخاع العظام ، والعضلات الهيكلية ، والسائل الأمنيوسي ، وبصيلات الشعر ، والمشيمة ، والأنسجة الدهنية ، من بين أمور أخرى. يتم الحصول عليها من أنواع مختلفة ، بما في ذلك البشر والفئران والجرذان والكلاب والخيول3. تم استخدام MSCs المشتقة من نخاع العظام (BMSCs) لسنوات عديدة كمصدر رئيسي للخلايا الجذعية في الطب التجديدي وكبديل لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية4. ومع ذلك ، فإن MSCs المشتقة من الدهون ، أو الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) ، هي بديل مهم يتمتع بمزايا كبيرة نظرا لسهولة جمعها وعزلها ، فضلا عن إنتاجية الخلايا التي تم الحصول عليها لكل جرام من الأنسجة الدهنية 5,6. وقد أفيد بأن معدل حصاد ASCs أعلى بشكل عام من معدل حصادBMSCs 7. اقترح في البداية أن القدرة التعويضية / التجديدية ل ASCs كانت بسبب قدرتها على التمايز إلى سلالات الخلاياالأخرى 8. ومع ذلك ، فقد عززت الأبحاث في السنوات الأخيرة الدور الأساسي لعوامل paracrine التي أطلقتها ASCs في إمكاناتها التعويضية 9,10.

الأنسجة الدهنية (AT) ، بالإضافة إلى كونها احتياطي للطاقة ، تتفاعل مع الغدد الصماء والجهاز العصبي والقلب والأوعية الدموية. كما أنها تشارك في النمو والتطور بعد الولادة ، والحفاظ على توازن الأنسجة ، وإصلاح الأنسجة ، وتجديدها. يتكون AT من الخلايا الشحمية ، وخلايا العضلات الملساء الوعائية ، والخلايا البطانية ، والخلايا الليفية ، والوحيدات ، والبلاعم ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا preadipocytes ، و ASCs. هذا الأخير يمتلك دورا مهما في الطب التجديدي بسبب انخفاض مناعته11,12. يمكن الحصول على ASCs عن طريق الهضم الأنزيمي والمعالجة الميكانيكية أو عن طريق زراعة الأنسجة الدهنية. من السهل الحفاظ على الثقافات الأساسية ل ASCs وتنميتها وتوسيعها. يعد توصيف النمط الظاهري ل ASCs ضروريا للتحقق من هوية الخلايا من خلال تقييم التعبير عن علامات غشائية محددة باستخدام طرق مثل التألق المناعي وقياس التدفق الخلوي13. حدد الاتحاد الدولي للعلاجات والعلوم الدهنية (IFATS) والجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT) أن ASCs تعبر عن CD73 و CD90 و CD105 ، بينما تفتقر إلى التعبير عن CD11b و CD14 و CD19 و CD45 و HLA-DR14. لذلك تعتبر هذه العلامات ، الإيجابية والسلبية على حد سواء ، موثوقة لتوصيف ASCs.

ركز هذا المشروع على وصف إجراء لعزل وتحديد خلايا اللحمة المتوسطة البالغة المستخرجة من ATللفئران ، لأن مصدر الخلايا هذا لا يمثل تحديات أخلاقية ، على عكس الخلايا الجذعية الجنينية. هذا يعزز الإجراء كخيار قابل للتطبيق بسبب سهولة الوصول وطريقة الحد الأدنى من التدخل الجراحي مقارنة بالخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام.

تلعب خلايا اللحمة المتوسطة من مصدر الأنسجة هذا دورا مهما في الطب التجديدي بسبب قدراتها المناعية وانخفاض الرفض المناعي. لذلك ، تعد الدراسة الحالية جزءا أساسيا من الأبحاث المستقبلية في إفرازها وتطبيقها كعلاج تجديدي في أمراض مختلفة ، بما في ذلك أمراض التمثيل الغذائي مثل مرض السكري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية المكسيكية لرعاية الحيوان ، بناء على توصيات جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999 ، المكسيك). تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه وتسجيله من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الصحية التابعة للمعهد المكسيكي للبحوث الاجتماعية (R-2021-785-092).

1. إزالة الأنسجة الدهنية من الفئران عن طريق الاستئصال الجراحي

  1. تحضير أنبوبين مخروطيين مع 20 مل من محلول مضاد حيوي ملحي معقم 1x فوسفات (PBS-AA) (1x PBS ، جنتاميسين [20 ميكروغرام / مل] ، وأمفوتريسين [0.5 ميكروغرام / مل]) والحفاظ على الجليد.
  2. حدد اثنين من ذكور الفئران Sprague Dawley (R. norvegicus) في حالة صحية جيدة. تأكد من أن عمر الفئران يتراوح بين 3-4 أشهر ولها وزن مشترك يتراوح بين 350-450 جم.
  3. يجب إجراء التخدير بجرعة 20 ملغ/ كغ من زيلازين هيدروكلوريد، وبعد 5 دقائق يتم تطبيق مخدر بجرعة 120 ملغ/كغ من الكيتامين هيدروكلوريد داخل الصفاق. تليين كلتا العينين مع مرهم العيون لمنع الجفاف. ثم تأكد من عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس الدواسة.
  4. حلق وتطهير منطقة البطن والأربية بمحلول اليود. ضع الستائر الجراحية للحفاظ على العقم. ثم قم بعمل شق طولي متوسط من القص إلى منطقة الخصية.
  5. قم بإزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بكل من البربخ والكلى بالملقط المعقم وضعها في محلول 1x PBS-AA. احتفظ بالعينات على الجليد.
  6. خياطة الشق المغلق إذا لزم الأمر وفقا للإرشادات المؤسسية والقتل الرحيم للحيوانات بجرعة داخل القلب تبلغ 40 مجم / كجم بنتوباربيتال الصوديوم. بمجرد تأكيد الوفاة ، تخلص من الذبيحة باتباع الإجراء (الإجراءات) المؤسسية.
    ملاحظة: يثير الموت آليات الإشارات التي تؤثر على النمط المناعي ، وقدرة التمايز ، وتأثير paracrine لخلايا اللحمة المتوسطة. وبالتالي ، يتم إجراء جمع الأنسجة قبل القتل الرحيم. 

2. عزل خلايا اللحمة المتوسطة من الأنسجة الدهنية

  1. قم بإزالة الأنسجة الدهنية بالملقط المعقم داخل خزانة السلامة البيولوجية وضعها على ورق ترشيح معقم في طبق بتري قطره 100 مم لامتصاص PBS الزائد.
  2. انقل الأنسجة الدهنية إلى طبق بتري آخر وقم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 5 دقائق لكل منها 10 مل من محلول 1x PBS-AA باستخدام ماصة سعة 10 مل.
  3. قم بتقسيم الأنسجة ميكانيكيا إلى شظايا يبلغ طولها حوالي 1 سم2 باستخدام مقص ومشرط.
  4. تحضير كولاجيناز من النوع الرابع (0.075٪) في 20 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) غير المكمل غذائيا. قم بالتصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر واحفظه عند 37 درجة مئوية.
  5. أضف محلول كولاجيناز (20 مل) المحضر في الخطوة 2.4 إلى دورق بلوري مع منديل مجزأ وقضيب مغناطيسي. أغلق الحاوية واحتضانها تحت التحريك البطيء والمستمر عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يستغرق الهضم الأنزيمي حوالي 90 دقيقة (الحفاظ على التحريك البطيء للحفاظ على سلامة أغشية الخلايا).
  6. قم بتصفية التجانس من خلال مرشح من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 40 شبكة ، فتحة 0.38 مم على طبق بتري 100 مم وجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
  7. أضف 20 مل من DMEM الدافئ والمكمل (10٪ مصل بقري جنيني [FBS] ، 2 مللي مول جلوتامين ، 2 مللي مول بيروفات الصوديوم ، 100x محلول حمض أميني غير أساسي ، و 100x محلول مضاد حيوي [AA]). تعليق بعناية جزء الأوعية الدموية اللحمية (SVE).
  8. قم بطرد مركزي تعليق الخلية عند 290 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية بماصة 25 مل ، واغسل الخلايا برفق باستخدام 40 مل من وسط DMEM غير المكمل.
  9. كرر هذه الخطوة. استخدم أنبوبا مخروطيا معقم جديدا بين الخطوات لسحب أقل كمية من المخلفات الخلوية والدهون.
  10. الحبيبات في 5 مل من DMEM المكمل بماصة 5 مل وانقلها إلى زجاجة T-25 سم2 . احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  11. في اليوم التالي ، قم بإجراء ثلاث غسلات مع 5 مل من 1x PBS-AA الدافئ وغسلتين مع DMEM غير المكمل لإزالة حطام الخلايا والخلايا غير الملتصقة. أضف 5 مل من DMEM الطازج والدافئ والمكمل مع ماصة 5 مل وقم بتغيير الوسط كل 3-4 أيام.

3. الحفاظ على الثقافات الأولية ASC وتوسيعها

  1. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ -100٪ (8 ± 2 أيام) ، اغسل مرتين باستخدام 5 مل من DMEM غير المكمل. أضف 1 مل من التربسين -2 mM الدافئ 0.025٪ حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) واحتضانه لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  2. عندما يتم فصل الطبقة الأحادية للخلية ، أضف 4 مل من DMEM المكمل وقم بتقسيم تعليق الخلية برفق.
  3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وأضف 5 مل من DMEM الدافئ والمكمل ، ثم برفق للتجانس.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 290 × ز لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية واخلط الحبيبات برفق في 1 مل من DMEM المكمل. عد الخلايا في غرفة نيوباور بعد تلطيخها بتريبان الأزرق.
  5. أخيرا ، البذور 2.5 × 103 خلايا / سم2 بنسبة انقسام 1: 4 في قوارير T-75. تضمن هذه الخطوة تكوين مستعمرة ومعدل انتشار مرتفع.

4. التوصيف المورفولوجي للثقافات الأولية ASC

  1. مراقبة مورفولوجيا ASCs تحت المجهر المقلوب.
    ملاحظة: قبل التركيب لتحديد الأنسجة و ASC ، عالج أغطية الغطاء بمحلول جيلاتيني 1٪. يشع بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
    1. قم بإزالة أغطية الغطاء من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ واتركها تجف لمدة 5 دقائق.
    2. اغمر أغطية الغطاء في محلول جيلاتيني معقم بنسبة 1٪ ، وصفيها وجففها في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. ضع كل غطاء في كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار وقم بإشعاع الألواح بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
    4. بذر قطرة تحتوي على 25 × 103 خلايا في وسط البئر ، وانتظر 1 دقيقة ، وأضف 1 مل من وسط DMEM المضاف. احتضان لمدة 96 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    5. قم بإزالة الوسط وقم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 1x PBS-AA باستخدام ماصة نقل.
    6. أضف 1 مل من الفورمالين المحايد بنسبة 3.5٪ إلى كل بئر واحتضانه لمدة 1 ساعة في RT. قم بإزالة الفورمالين بعناية وأضف 1 مل من الإيثانول البارد بنسبة 70٪ إلى كل بئر.
    7. ختم اللوحة مع parafilm حتى الاستخدام ، لمنع الجفاف.
      ملاحظة: يتم أيضا تقييم التشكل الخلوي ل ASCs عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين خلال الممرات المختلفة.
    8. قم بإزالة 70٪ من الإيثانول من كل بئر ورطب الخلايا لمدة 5 دقائق بالماء المقطر. وفي الوقت نفسه ، قم بتصفية حلول تلطيخ.
    9. قم بإزالة الماء وبقع الخلايا تحت التحريك البطيء لمدة 15 دقيقة بمحلول الهيماتوكسيلين هاريس.
    10. قم بإزالة محلول التلوين وقم بإجراء غسلتين باستخدام 1x PBS.
    11. تلطيخ الخلايا بمحلول eosin تحت التحريض البطيء لمدة 1 دقيقة. ثم ، قم بإزالة المحلول وإجراء غسلتين باستخدام 1x PBS.
    12. قم بإزالة أغطية الغطاء بعناية من كل بئر وقم بتركيب الشرائح على قطرة من محلول تركيب PBS-glycerol (1: 1 فولت / حجم).
    13. ضع خطا من طلاء الأظافر حول غطاء الغطاء ولاحظ الشرائح النسيجية تحت المجهر الضوئي.

5. علامات التعبير عن ASCs عن طريق التألق المناعي

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل الذي يحتوي على 1x PBS-0.05٪ Tween 20. أداء يغسل في RT ومع اهتزاز بطيء. اغسل الأطباق ثلاث مرات ب 2 مل من المخزن المؤقت / البئر (احتضانها لمدة 3 دقائق لكل غسلة).
  2. ضع 1 مل من الكاشف المانع (1:10) واحتضنه مع التقليب البطيء لمدة 20 دقيقة.
  3. أضف 200 ميكرولتر (تخفيف 1:50) من الأجسام المضادة الأولية التالية إلى كل بئر: CD9 (فأر وحيد النسيلة) ، CD34 (أرنب متعدد النسيلة) ، ومضاد CD63 (ماعز متعدد النسيلة). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  4. اغسل الألواح ثلاث مرات مرة أخرى واحتضانها ب 200 ميكرولتر (1:50 تخفيف) من الأجسام المضادة الثانوية التالية: الماعز المترافق IgG FITC المضاد للفأر ، والحمير المضاد للماعز IgG DyeLight 550 ، والماعز المضاد للأرانب IgG Cy3.
  5. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS-0.05٪ Tween 20 وقم بتلطيخ نوى الخلية ب 100 ميكرولتر من DRAQ-7 (التخفيف: 17 ميكرولتر في 1 مل من الماء المقطر المزدوج) لمدة 20 دقيقة.
  6. اغسل ثلاث مرات أخرى وقم بتركيب الشرائح وفقا للخطوات 4.1.12-4.1.13. قم بتخزين العينات المحمية من الضوء والمجمدة حتى الاستخدام.
  7. تصور العينات تحت المجهر متحد البؤر epifluorescence باستخدام الإعدادات المناسبة والبرامج الموصى بها لهذا الجهاز.

6. علامات التعبير عن ASCs عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. اضبط معلق خلية واحدة من الخلايا المذابة أو المذابة (الممرات الفرعية 3 أو 4) بتركيز 1 × 106 خلايا / مل من 1x PBS-5٪ FBS. القسمة 100 ميكرولتر مع 100000 خلية في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل. استخدم قسمة واحدة بدون وضع علامات للتحكم التلقائي في التألق.
  2. أضف إلى الراحة جميع الكميات المناسبة من Anti-CD105 AF-594 و Anti-CD31 AF-680 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتضان في الظلام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. اغسل البقعة الزائدة ب 1 مل من 1x PBS-5٪ FBS عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق وعلقها في 300 ميكرولتر من 1٪ فورمالين.
  4. إجراء الحصول على عينة على مقياس التدفق الخلوي. تعتمد استراتيجية البوابات للخلايا على بوابات FSC-A مقابل SSC-A ، والخلايا المفردة ذات البوابات باستخدام SSC-H مقابل SSC-A متبوعة ب FSC-A مقابل FSC-H.
  5. استخدم كاشف Y610-mCherry-A لكاشف CD105 AF-594 و R660-APC-A ل CD31 AF-680.

7. تمايز ASCs إلى النسب الدهني

  1. في صفيحة ذات 6 آبار ، البذور 1 × 10 4 خلايا (P-4) لكل سم 2 وتحضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، حتى التقاء 60-80٪ (~ 72-96 ساعة). تحفيز التمايز ، وتطبيقه مباشرة على وسط الثقافة: 4 ميكرومتر أنسولين ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون 21-أسيتات (Dxa) ، و 0.5 مللي متر من 3-إيزوبوتيل-1-ميثيل زانثين (MIX). تغيير وسيط التمايز كل 2-3 أيام.
  2. قم بإعداد محلول مخزون من الأنسولين 800 ميكرومتر في 2 مل من الماء المعقم عالي النقاء (أضف 20 ميكرولتر من 1 N HCl لضمان الذوبان الكامل) وتخزينه في -20 درجة مئوية. أضف 10 ميكرولتر من مخزون الأنسولين ، المخفف مسبقا 1: 100 ، وقم بتطبيق 10 ميكرولتر بحجم نهائي قدره 2 مل لكل بئر.
  3. قم بإعداد محلول مخزون يبلغ 1 mM Dxa في 5 مل من الماء المعقم عالي النقاء (لاحظ أن الذوبان الكامل لا يحدث). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. أضف 40 ميكرولتر / بئر من تخفيف 1: 4 من مخزون Dxa.
  4. قم بإعداد مخزون 100 mM من MIX في 2.5 مل من 0.1 N NaOH ، دوامة ، وأضف 40 ميكرولتر من 1 N NaOH للذوبان الكامل. يحفظ في درجة حرارة -70 درجة مئوية. أضف 10 ميكرولتر / بئر من مخزون MIX.
  5. قم بتصفية محاليل المخزون من خلال مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرومتر قبل التخزين.
  6. في اليوم 12 ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS واحتضانها ب 500 ميكرولتر من 4٪ فورمالين لمدة 1 ساعة في RT. اغسل كل بئر مرتين بالماء المقطر متبوعا بنسبة 60٪ من الأيزوبروبانول لمدة 5 دقائق واتركه حتى يجف.
  7. أضف 0.5٪ زيت أحمر O مخفف في 60٪ إيزوبروبانول (500 ميكرولتر / بئر) واحتضانه لمدة 20 دقيقة في RT. يغسل ب 1 مل من الماء المقطر ثلاث مرات ويلاحظ تحت المجهر المقلوب.
    ملاحظة: بالنسبة للكواشف والمعدات والمواد المطلوبة، راجع جدول المواد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على الأنسجة الدهنية من فئران Sprague Dawley البالغة من العمر 3-4 أشهر ويبلغ وزن جسمها 401 ± 41 جم (المتوسط الهندسي ± SD). تتوافق القيمة المتوسطة البالغة 3.8 جم من الأنسجة الدهنية البربخية وحول الكلى مع تحليل 15 عملية استخراج تجريبية. بعد 24 ساعة من الثقافة ، ظلت مجموعات الخلايا ملتصقة بالسطح البلاستيكي وأظهرت مورفولوجيا غير متجانسة. تم تحقيق المقطع الأول في 8 ± 2 أيام ، مع عائد 1.4 ± 0.6 × 106 خلايا في ما مجموعه ثماني تجارب. سهلت الملاحظة الميدانية الساطعة المباشرة (الشكل 1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقود الأربعة الماضية منذ اكتشاف MSCs ، وصفت عدة مجموعات من الباحثين إجراءات الحصول على MSCs من الأنسجة والأنواع المختلفة. واحدة من مزايا استخدام الفئران كنموذج حيواني هي سهولة صيانتها وتطورها السريع ، فضلا عن سهولة الحصول على MSCs من الأنسجة الدهنية. تم وصف مصادر الأنسجة المختلفة للحصول على ASCs ، مثل الدهون الحشوية وحول الكلى والبربخ وتحت الجلد12،13،14،15،16.<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للمعهد المكسيكي للضمان الاجتماعي (IMSS) ومستشفى الأطفال في المكسيك ، فيديريكو غوميز (HIMFG) وموظفي Bioterio في تنسيق أبحاث IMSS ، للدعم المقدم لتنفيذ هذا المشروع. نشكر المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا على منحة AOC (815290) وأنطونيو دوارتي رييس على الدعم الفني في المواد السمعية والبصرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأمفوتريسين بHyCloneSV30078.01
الميزان التحليليSartoriusAX224
الأجسام المضادة المضادة CD9 (C-4)سانتا كروزSC-13118
الجسم المضاد المضاد CD34 (C-18)سانتا كروزSC-7045
الأجسام المضادة المضادة C63سانتا كروزSC-5275
الأجسام المضادة للإندولين / CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
الأجسام المضادة المضادة CD31 / PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
الأجسام المضادة للماعز المضادة IgG (H + L) Cy3 NovusNB 120-6939
الأجسام المضادة الحمار المضادة للماعز IgG (H + L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
الأجسام المضادة للفأر IgG FITC الماعز المترافق F (ab & حاد؛)أنظمة RD.رقم F103B
مرشح علوي للزجاجة معقمقواريرالخلايا والأنسجة 10718003
BIOFIL170718-312B
مقياس الدم ذو الخط اللامع مع شرائح غرفة عدالخلايا SIGMA Aldrich Z359629
آبار الخلية: 6 بئر مع غطاءCORNING25810
أنابيب مخروطية للطرد المركزيHeTTICHROTANA460R
أجهزة الطرد المركزي أنابيب eppendorf فيشرM0018242_44797العلمية
الكولاجين الرابع ورثينجتونLS004186
CryovialSPL Life Science43112
أنابيب الثقافةGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman Coulterنسخة
الخلوي CytoFlex LXبيكمان كولترفلو-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 صبغحراري Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosin Hycel300
Ethanol 96٪Baker64-17-5
Falcon Tubes 15 ملGreiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 ملGreiner Bio-One 227261
مصل الأبقار الجنيني CORNING35-010-CV
الجيلاتينSIGMA Aldrich128111163
GentamicinGIBCO15750045
الجلسرين عاليHerschi Trading 56-81-5
HematoxylinAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2< / sub> حاضنة Thermo Sc.50116047
كيتامين الأليفة (كيتامين كلورهيدرات) أرانداSV057430
L-Glutamine GIBCO / Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5نسخة
مجانية خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانيةNuAire12082100801
مجهر epifluorescent Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
مجهر مقلوب أوليمبوس CK40CK40-G100
الأحماض الأمينية غير الأساسية 100XGIBCO11140050
أنابيب صغيرة 2 مل Sarstedt 72695400
أنابيب دقيقة 1,5 ملSarstedt 72706400
ماصات دقيقة 0.2-2 & LFinnpipetteE97743
ماصات دقيقة 2-20 مو ؛ LFinnpipetteF54167
ماصات دقيقة 20-200 مو ؛ LFinnpipetteG32419
ماصات دقيقة 100-1000 مو ؛ LFinnpipetteFJ39895
سائل خزان النيتروجينتايلور وارتون681-021-06
بارافورمالدهيدSIGMA AldrichSLBC3029V
البنسلين / Streptomycin GIBCO / Thermo Sc. 15140122
صحن بتري ثقافة الخلاياCORNING Inc480167
Pipet TipsAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (بنتوباربيتال الصوديوم)PISA AgropecuariaQ-7833-215
كلوريد البوتاسيوم JTBaker7447-40-7
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةJT Baker2139900
S1 حشوات الماصةالحرارية SC9531
ماصة مصلية 5 ملماصةمصلية L010005
10 ملالصوديوم L010010
PYREX جي تي بيكر144-55-8
كلوريد الصوديوم JTBaker15368426
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائيJT Baker7558-79-4
بيروفات الصوديومGIBCO BRL11840-048
فلتر حقنة معقمCORNING431222
مقياس الطيف الضوئيPerkinElmer Lambda 25L6020060
شاكر لوحة عيارLAB-LINE1250
نقل ماصاتSamco / Thermo Sc728NL
Trypan Blue وصمة عارGIBCO1198566
التربسين من الخنازير البنكرياسSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
كاشف حجب عالمي 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2٪ (زيلازين هيدروكلوريد) Pet& # 39; س فارماQ-7972-025
زراعة مجانيةمقياس النقاء PYREX بيكربونات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
  3. González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
  4. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  5. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).
  6. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  7. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68(2019).
  8. Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221(2013).
  9. Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
  10. Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
  11. Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
  12. Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
  13. Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
  14. Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765(2019).
  15. Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126(2021).
  16. Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
  17. Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
  18. Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615(2011).
  19. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  20. Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
  21. Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
  22. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
  23. Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
  24. Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
  25. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  26. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  27. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  28. Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
  29. He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة