يظهر هنا بروتوكول فعال لعزل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفأر التي تم تكييفها لدراسة تنظيم النسخ في ألياف العضلات عن طريق الانقسام تحت الأهداف وإطلاقها باستخدام النيوكلياز (CUT &RUN).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بروتوكول فعال لتحليل CUT&RUN لخلايا الأقمار الصناعية للفأر المعزولة FACS
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تشكل التحليلات على مستوى الجينوم مع مجموعات الخلايا الصغيرة عائقا رئيسيا للدراسات ، لا سيما في مجال الخلايا الجذعية. يصف هذا العمل بروتوكولا فعالا لعزل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية من عضلة الأطراف ، وهي نسيج يحتوي على نسبة عالية من البروتينات الهيكلية. تم تعطيل عضلات الأطراف المشرحة من الفئران البالغة ميكانيكيا عن طريق الفرم في وسط مكمل بالكولاجين من النوع الأول. عند الهضم ، تم ترشيح التجانس من خلال مصافي الخلايا ، وتم تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS. تم تحديد الصلاحية مع صبغة قابلة للتثبيت ، وتم عزل الخلايا الساتلية الملطخة بالمناعة بواسطة FACS. تم تحليل الخلايا باستخدام Triton X-100 وكانت النوى المنبعثة مرتبطة بخرز كونكانافالين أ المغناطيسي. تم تحضين معقدات النواة / الخرز بأجسام مضادة ضد عامل النسخ أو تعديلات الهستون ذات الأهمية. بعد الغسلات ، تم تحضين معقدات النواة / الخرز ببروتين A-micrococcal nuclease ، وبدأ انقسام الكروماتين باستخدام CaCl2. بعد استخراج الحمض النووي ، تم إنشاء المكتبات وتسلسلها ، وتم الحصول على ملفات تعريف ارتباط عامل النسخ على مستوى الجينوم وتعديلات الهستون التساهمي عن طريق التحليل المعلوماتي الحيوي. أظهرت القمم التي تم الحصول عليها لمختلف علامات الهستون أن أحداث الارتباط كانت خاصة بالخلايا الساتلية. علاوة على ذلك ، كشف تحليل الزخارف المعروف أن عامل النسخ كان مرتبطا بالكروماتين عبر عنصر الاستجابة المماثل. لذلك تم تكييف هذا البروتوكول لدراسة التنظيم الجيني في الخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفئران البالغة.
المقدمة
تمثل العضلات المخططة الهيكلية في المتوسط 40٪ من وزن إجمالي جسم الإنسان1. تظهر ألياف العضلات قدرة ملحوظة على التجدد عند الإصابة ، والتي توصف باندماج الخلايا العضلية المشكلة حديثا وتوليد ألياف عضلية جديدة تحل محل الخلايا التالفة2. في عام 1961 ، أبلغ ألكسندر ماورو عن مجموعة من الخلايا أحادية النواة التي أطلق عليها اسم خلايا الأقمار الصناعية3. تعبر هذه الخلايا الجذعية عن عامل النسخ المقترن بالمربع 7 (PAX7) ، وتقع بين الصفيحة القاعدية وساركوليما الألياف العضلية4. تم الإبلاغ عن أنها تعبر عن مجموعة التمايز 34 (CD34 ؛ علامة الخلايا الجذعية المكونة للدم ، البطانية ، وعلامة الخلايا ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الاحتفاظ بالفئران في بيت معتمد ، وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية لرعاية (توجيه المفوضية الأوروبية 86/609 / CEE; المرسوم الفرنسي رقم 87-848) بشأن استخدام المختبر للبحث. تم تقديم التلاعبات المقصودة إلى اللجنة الأخلاقية (Com'Eth ، ستراسبورغ ، فرنسا) وإلى وزارة الأبحاث الفرنسية (MESR) للتقييم الأخلاقي والتفويض وفقا لتوجيه 2010/63 / EU بموجب رقم APAFIS # 22281.
1. تحضير معلق الخلية لعزل الخلايا الساتلية عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (الشكل 1)
- عزل الأنسجة العضلية
- قم بتطهير أدوات تشريح العضلات ، بما في ذلك الملقط والمشارط والمقص ، باستخدام عامل تنظيف (<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم عزل الخلايا الساتلية من عضلات الهيكل العظمي للفأر عن طريق الجمع بين بروتوكولات Gunther et al. (المشار إليها فيما يلي بالبروتوكول 1)12 و Liu et al.23 (المشار إليها فيما يلي بالبروتوكول 2). نظرا لملاحظة الألياف العضلية غير المهضومة بعد الهضم عند استخدام تركيز كولاجيناز وديباز المقترح في البروتوكول 1 ، فقد زادت كمية الإنزيمات لتحسين تفكك الألياف العضلية ، كما هو موضح في الخطوتين 1.2.1 و 1.2.3. كما هو مبين في البروتوكول 2 ، تعرضت العينات لإثارة لطيفة في حمام مائي للحفاظ على .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تشير الدراسة الحالية إلى طريقة موحدة وموثوقة وسهلة الأداء لعزل وثقافة خلايا الأقمار الصناعية للفأر ، بالإضافة إلى تقييم تنظيم النسخ بواسطة طريقة CUT &RUN.
يتضمن هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الأول هو اضطراب العضلات وهضم الألياف لضمان وجود عدد كبير من الخلايا المجمعة. على الرغم من زيادة تركيز الإنزيم ، تم الحصول على خلايا حية أكثر من استخدام البروتوكول 1. تعبر الخلايا الساتلية عن نمط محدد من البروتينات الغشائية المختلفة. لزيادة صرامة الفرز لدينا ، استخدمنا مزيجا من علامات الخلايا الساتلية الس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر أناستازيا بانوارث على تقديم المساعدة الفنية الممتازة. نشكر مرفق بيت IGBMC ، وثقافة الخلايا ، ومعهد الماوس السريري (ICS ، Illkirch ، فرنسا) ، والتصوير ، والمجهر الإلكتروني ، وقياس التدفق الخلوي ، ومنصة GenomEast ، وهي عضو في اتحاد "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).
تم دعم هذا العمل للمعهد المواضيعي متعدد التخصصات IMCBio ، كجزء من برنامج ITI 2021-2028 لجامعة ستراسبورغ و CNRS و Inserm ، من قبل IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ومشروع SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) و EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) في إطار برنامج الاستثمارات الفرنسية من أجل المستقبل. تم تقديم تمويل إضافي من قبل INSERM و CNRS و Unistra و IGBMC والوكالة الوطنية للبحوث (ANR....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل microtube | Eppendorf | 2080422 | |
| 2 مل microtube | Star Lab | S1620-2700 | |
| 5 مل أنابيب | CORNING-FALCON | 352063 | |
| 50 مل Falcon | 352098 | ||
| مضاد للAR | abcam | ab108341 | |
| anti-CD11b | eBioscience | 25-0112-82 | |
| مضاد CD31 | eBioscience | 12-0311-82 | |
| مضاد CD34 | eBioscience | 48-0341-82 | |
| مضاد CD45 | eBioscience | 12-0451-83 | |
| مضاد ل CXCR4 | eBioscience | 17-9991-82 | |
| مضاد ل DMD | abcam ab15277 | ||
| مضاد ل H3K27ac | عزر نشط | 39133 | |
| مضاد H3K4me2 | نشط فكرة | 39141 | |
| مضاد ITGA7 | MBL | k0046-4 | |
| مضاد PAX7 | DSHB | AB_528428 | |
| مضاد TER119 | BD Pharmingen TM< / sup> | 553673 | |
| الخرز | Polysciences | 86057-3 | BioMag & reg ؛ بالإضافة إلى مصفاة خلية كونكانافالين |
| 100 وميكرو ؛ م | كورنينج & ريج; | 431752 | |
| مصفاة خلوية 40 وميكرو ؛ م | كورنينج & ريج; | 431750 | |
| مصفاة الخلية 70 & م | كورنينج & ريج; | 431751 | |
| جهاز طرد مركزي 1 | Eppendorf | 521-0011 | طرد مركزي 5415 R |
| طرد مركزي 2 | Eppendorf | 5805000010 | طرد مركزي 5804 R |
| نظام شرائح الغرفة ؛ | ThermoFischer | 171080 | Systè أنا Nunc & trade; مختبر تيك & تجارة; عامل تنظيف شريحة الغرفة |
| Sigma | SLBQ7780V | RNaseZAPTM | |
| كولاجيناز ، النوع I ؛ | ثيرمو | فيشر 17100017 | 10 مجم / مل |
| Dispase | تقنيات STEMCELL | 7913 | 5 U / mL |
| DynaMag & trade ؛ -2 Aimant | Invitrogen | 12321D | |
| قابلية للإصلاح بقعة | BD Biosciences | 565388 | |
| مقياس التدفق الخلوي | BD FACSAria & trade ؛ مقياس التدفق الخلوي الانصهار | 23-14816-01 | |
| Fluoromount G مع DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| متصفح الجينوم | IGV | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | |
| Glycerol | سيجما ألدريتش | G9012 | |
| هيدروجيل | كورنينج & ريج ؛ | 354277 | Matrigel hESC مؤهل مصفوفة |
| برامج معالجة الصور | Image J & reg ؛ | V 1.8.0 | |
| فيلم مختبر | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | PARAFILM & reg ؛ M |
| Liberase LT | Roche | 5401020001 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Sequencer | Illumina Hiseq 4000 | SY-401-4001 | |
| اهتزاز حمام مائي | Bioblock Scientific polytest 20 | 18724 |
المراجع
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
