مقالة منهجية

إجراء للتشريح بالتبريد لجذر الجذر الظهري للفأر

8.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65232

⸱

يونيو 9, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco, 3Department of Anesthesiology, Sun Yat-Sen University, 4University of Washington

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يظهر هنا التطوير للحصول باستمرار على أقسام تبريد العقدة الجذرية الظهرية عالية الجودة.

الملخص

تعد أقسام العقدة الجذرية الظهرية للفأر (DRG) عالية الجودة ضرورية لتلطيخ الكيمياء المناعية المناسبة ودراسات RNAscope في البحث عن الألم الالتهابي والاعتلال العصبي والحكة بالإضافة إلى الحالات العصبية الطرفية الأخرى. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب الحصول باستمرار على أقسام كريوستات عالية الجودة وسليمة ومسطحة على شرائح زجاجية بسبب حجم العينة الصغير لأنسجة DRG. حتى الآن ، لا توجد مقالة تصف البروتوكول الأمثل للتشريح بالتبريد DRG. يقدم هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لحل الصعوبات التي تواجهها بشكل متكرر والمرتبطة بالتقسيم بالتبريد DRG. تشرح المقالة المقدمة كيفية إزالة السائل المحيط من عينات أنسجة DRG ، ووضع أقسام DRG على الشريحة التي تواجه نفس الاتجاه ، وتسطيح الأقسام الموجودة على الشريحة الزجاجية دون التقويس. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تطويره للتشريح بالتبريد لعينات DRG ، إلا أنه يمكن تطبيقه على التشريح بالتبريد للعديد من الأنسجة الأخرى ذات حجم العينة الصغير.

المقدمة

تحتوي العقدة الجذرية الظهرية (DRG) على الخلايا العصبية الحسية الأولية ، والبلاعم النسيجية ، والخلايا الساتلية التي تحيط بالخلايا العصبية الحسية الأولية1،2،3،4. إنه هيكل تشريحي رئيسي في معالجة الإشارات غير الضارة والضارة ، ويلعب أدوارا حاسمة في الألم والحكة واضطرابات الأعصاب الطرفية المختلفة5،6،7،8،9،10،11،12،13. على الرغم من تطوير عدة طرق لتشريح أنسجة DRG من الحبل الشوكي للفأر14،15،16 ، إلا أن التشريح بالتبريد لأنسجة DRG لا يزال يمثل تحديا لأن أنسجة DRG صغيرة جدا ، وتميل أقسام cryostat من عينات DRG إلى الانحناء إلى لفات ، مما يجعل من الصعب نقل أقسام cryostat بشكل صحيح إلى شرائح زجاجية. ومع ذلك ، فإن التشريح بالتبريد المناسب لأنسجة DRG أمر بالغ الأهمية لدراسات الكيمياء الهيستولوجية المناعية وهيكل الخلايا العصبية الحسية DRG17،18،19،20،21،22،23. علاوة على ذلك ، نظرا لأن نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية قد كشفت عن عدم التجانس الملحوظ للخلايا العصبية الحسية DRG في كل من البشر24 والفئران25 ، فإن التقسيم بالتبريد المناسب لأنسجة DRG أمر بالغ الأهمية للتحقيق في الدور الوظيفي لخلايا DRG المختلفة في مختلف الحالات الفسيولوجية والمرضية.

على الرغم من أن تقنية إزالة الأنسجة قد تم تطبيقها للتحقيق في إعادة بناء 3D ل DRG26 كتقنية بديلة للتشريح بالتبريد DRG ، فإن تقنية إزالة الأنسجة تستغرق وقتا طويلا وعمالة. وبالمقارنة ، فإن التقسيم بالتبريد ل DRG سريع وسهل الأداء نسبيا ، وبالتالي يظل تقنية رئيسية للكيمياء المناعية ودراسات بنية DRG ومناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن الحصول على أقسام كريوستات عالية الجودة وسليمة ومسطحة على شرائح زجاجية لا يزال يمثل تحديا في أبحاث علم الأعصاب بسبب حجم العينة الصغير للأنسجة ، مثل DRG وبعض مناطق الدماغ ، ولا توجد مقالة تصف البروتوكول الأمثل في هذه المرحلة للتشريح بالتبريد لعينات الأنسجة صغيرة الحجم ، مثل DRGs الفأر.

يوفر هذا البروتوكول تقنية سهلة خطوة بخطوة لتقسيم cryostat للماوس DRG للحصول بشكل موثوق على أكبر عدد ممكن من أقسام DRG عالية الجودة على الشرائح لدراسات DRG اللاحقة. في حين أن هذه التقنية مصممة خصيصا للتشريح بالتبريد لعينات DRG ، إلا أنه يمكن استخدامها للتشريح بالتبريد لمختلف الأنسجة الأخرى ذات حجم العينة الصغير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بالنسبة للدراسة الحالية ، تمت الموافقة على التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام الفئران البالغة من العمر 8-12 أسبوعا C57BL / 6 من الذكور والإناث (المرباة في المنزل) هنا.

1. إعداد عينة DRG

  1. تخدير الفئران بنسبة 2.5٪ Avertin (انظر جدول المواد). ضمان التخدير الكافي من خلال عدم الاستجابة للتحفيز المؤلم. قم بتغذية عبر القلب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) متبوعا ب 4٪ فورمالديهايد ، كما هو موضح سابقا14،15،16.
  2. تشريح أنسجة DRG من الحبل الشوكي ، كما هو موضح سابقا14،15،16.
  3. بعد إصلاح DRGs تشريح في 4 ٪ الفورمالديهايد لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  4. ضع DRGs في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  5. تحضير درجة حرارة القطع المثلى للقاعدة (OCT)
    1. أضف مركب OCT (انظر جدول المواد) لتغطية السطح العلوي لكتلة الألومنيوم وقم بتجميده عند -20 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق (الشكل 1 أ).
    2. اقطع الجزء العلوي من OCT باستخدام cryostat (انظر جدول المواد) بسمك 30 ميكرومتر حتى يصبح سطحه مسطحا مثل OCT الأساسي (الشكل 1B).
    3. ضع علامة في الجزء السفلي (موضع الساعة السادسة) من OCT الأساسي لتحديد اتجاهه ، قبل إزالة كتلة الألومنيوم من cryostat (الشكل 1C).
    4. في الخطوات التالية ، احتفظ بالعلامة عند موضع الساعة السادسة للحفاظ على نفس الاتجاه ، مما قد يؤدي إلى الحصول على المزيد من أقسام عينة DRG.
      ملاحظة: إذا فقد الاتجاه وتم قطع عينة DRG بزاوية مختلفة ، فلا يمكن قطع عينة DRG بالكامل من أعلى إلى أسفل ، مما سيترك بعض العينات متروكة على قاعدة OCT وتضيع ، حيث سيتم مواجهة OCT الأساسي أثناء محاولة قطع عينة DRG (الشكل 1C).
  6. إجراء تضمين OCT ل DRGs
    1. جفف أنسجة DRG قبل وضعها على OCT.
      1. قبل إضافة DRG إلى الكتلة ، تأكد من إزالة محلول السكروز / PBS بنسبة 30٪ حول العينة.
      2. جفف عينة DRG عن طريق وضعها على طبق بتري جاف (الشكل 2 أ) ونقلها من مكان إلى آخر مرتين أو ثلاث مرات باستخدام ملاقط جافة (الشكل 2 ب).
      3. جفف الملقط بمنديل خال من النسالة قبل نقل عينة DRG أخرى (الشكل 2C).
    2. ضع DRG الجاف على القاعدة OCT.
      1. باستخدام الملقط الجاف ، ضع DRG الجاف على قاعدة OCT عند موضع الساعة 12 (الشكل 1 د).
      2. احتفظ بما لا يقل عن 5 مم بين الحافة العلوية ل DRG والحافة العلوية للقاعدة OCT.
      3. ضع الجزء الظهري من DRG في موضع الساعة 12 والجزء البطني في موضع الساعة السادسة (الشكل 1D).
    3. قم بتضمين أنسجة DRG مع OCT.
      1. أضف المزيد من OCT لتغطية عينة DRG بأكملها في شكل دائري أو بيضاوي ، مع وجود DRG في المنتصف (الشكل 1E).
      2. تأكد من أن الحافة العلوية ل OCT تغطي DRG عند الحافة العلوية للقاعدة OCT (الشكل 1F) ، لأن هذا يسهل نقل القسم إلى الشريحة الزجاجية (الشكل 3 أ).
        ملاحظة: إذا كان غطاء OCT في منتصف OCT الأساسي ، فإن الحافة العلوية للقاعدة OCT ستسد الشريحة الزجاجية لتجميع القسم (الشكل 3B).
      3. قم بتجميد عينة الغطاء OCT و DRG عند -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أخرى (الشكل 1G). لا تقم بقص OCT حول عينة DRG.
      4. اقطع الجزء العلوي من الغطاء OCT بسمك 30 ميكرومتر حتى يصبح DRG مرئيا.

2. التقسيم بالتبريد ل DRG

  1. قم بتغيير سمك مقطع cryostat إلى 12 ميكرومتر لقطع أقسام DRG على الشريحة (الشكل 1H).
  2. أمسك قسم OCT في الأسفل بفرشاة رسم صغيرة مبردة إلى -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المهم عدم قطع القسم بأكمله تماما ، ولكن ترك 1-3 مم غير مقطوع (الشكل 1I).
  3. استخدم نهاية الملقط بدرجة حرارة الغرفة للمس الجزء السفلي (موضع الساعة السادسة) برفق من القسم بحيث يلتصق بسطح المنصة (الشكل 1J). هذا يمنع القسم من التقويس مرة أخرى في لفة ، مما يجعل من الصعب جمع القسم على الشريحة.
    ملاحظة: عندما يلتصق الجزء السفلي من القسم بسطح المنصة ، ولا يزال الجزء العلوي من القسم متصلا بالغطاء OCT ، يكون القسم في شكل مسطح (الشكل 1K) ، مما يسهل جمع القسم على الشريحة.
  4. خذ شريحة زجاجية مشحونة (انظر جدول المواد) وضع الشريحة ببطء فوق القسم. بمجرد أن يبدأ القسم في الالتصاق بالشريحة ، اسحب الشريحة برفق للخلف (الشكل 1L).
  5. اتبع نفس العملية للحصول على المزيد من أقسام DRG على الشريحة دون تداخل الأقسام (الشكل 1M). تأكد من عدم وضع قسم DRG جديد فوق OCT لقسم DRG آخر (الشكل 4) ، لأن هذا القسم لا يمكن أن يبقى جيدا على الشريحة ويمكن غسله أثناء عملية تلطيخ الكيمياء المناعية.

3. تلطيخ نيسل لقسم DRG على الشريحة الزجاجية

  1. اغسل الأقسام لمدة 10 دقائق في PBS بالإضافة إلى 0.1٪ Triton X-10. ثم اغسل الأقسام مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.
  2. ضع بقعة 1: 300 Nissl (انظر جدول المواد) على الشريحة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. اغسل القسم باستخدام PBS بالإضافة إلى 0.1٪ Triton X-100. ثم ، اغسل الأقسام مرتين باستخدام PBS لمدة 5 دقائق ، ثم لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بتطبيق 4 ′،6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) فلوروماونت-G (انظر جدول المواد) لتغطية الأقسام بغطاء غطاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

جمعت الدراسة الحالية حوالي 16 قسما مستمرا وعالي الجودة DRG من ماوس واحد L4 DRG. كانت الأقسام التي تم الحصول عليها دون أي تشويه. يوضح الشكل 1 الإجراء خطوة بخطوة للتشريح بالتبريد. يوضح الشكل 2 إزالة السائل الزائد من أقسام الأنسجة. يتم تسليط الضوء على عملية تضمين OCT للأنسجة في الشكل 3. يوضح الشكل 4 الموضع المناسب لأقسام DRG على الشرائح الزجاجية. يوضح الشكل 5...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول إجراء سهلا خطوة بخطوة لتقسيم cryostat للماوس DRG للحصول على أقسام DRG عالية الجودة على الشرائح بشكل موثوق. هناك أربع خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. أولا ، يجب أن تكون عينة DRG والملاقط جافة قبل وضع عينة DRG على OCT الأساسي. أي سائل يحيط بعينة DRG سيشكل قشرة جليدية حولها ، مما يؤدي إلى فصل أقسام DRG عن OCT وانحناءها. ثانيا ، إذا لم يكن لكتلة الألومنيوم علامة ، أو إذا كانت قاعدة OCT تغطي العلامة ، فمن المهم وضع علامة في الجزء السفلي (موضع الساعة السادسة) من OCT الأساسي والحفاظ على هذه العلامة في موضع ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أفرتينسيجما ألدريتشT48402-25Gتخدير
Epredia   ؛ Cryotome Cryostat Cryocassettes ، قطر 25 مم. CrosshatchedFisherbrand1910عقد قسم OCT في الأسفل  
Ergo TweezersFisherbrandS95310استخدام نهاية الملقط للمس الجزء السفلي برفق (6 درجة مئوية ساعة) من القسم بحيث يلتصق بسطح المنصة لمنع القسم من الانحناء مرة أخرى في لفة & nbsp ؛
Fisherbrand  Superfrost Plus Microscope SlidesFisherbrand1255015لجمع قسم DRG  
أقلام الوسمFisherbrand133794  حدد اتجاه قاعدة OCT
Scigen   ؛ Tissue-Plus O.C.T. مركبFisherbrand  23730571وسط لعينات الأنسجة المجمدة لضمان درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.).
تضمين

المراجع

  1. Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
  2. Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264(2020).
  3. Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
  4. Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44(2022).
  5. Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
  6. Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
  7. Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052(2020).
  8. Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
  9. Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
  10. Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
  11. Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
  12. Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
  13. Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600(2022).
  14. Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302(2020).
  15. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82(2016).
  16. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
  17. Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184(2020).
  18. Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
  19. Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
  20. Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
  21. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612(2017).
  22. Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
  23. Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
  24. Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752(2021).
  25. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  26. Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

OCT RNAscope

مقالات ذات صلة