Method Article

القياس الكمي عالي الإنتاجية القائم على الصور لتخليق وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا

DOI:

10.3791/65236

⸱

May 5th, 2023

 ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Institute of Genetics and Biotechnology, University of Warsaw, 2Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 3International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف إجراء لدراسة ديناميكيات استقلاب الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في الخلايا باستخدام تنسيق لوحة متعددة الآبار والتصوير المناعي الآلي للكشف عن تخليق وتوزيع mtDNA وتحديده. يمكن استخدام هذا أيضا للتحقيق في آثار مثبطات مختلفة ، والضغوط الخلوية ، وإسكات الجينات على استقلاب mtDNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب الغالبية العظمى من العمليات الخلوية إمدادا مستمرا بالطاقة ، والناقل الأكثر شيوعا هو جزيء ATP. تنتج الخلايا الحقيقية النواة معظم جزيئات ATP في الميتوكوندريا عن طريق الفسفرة التأكسدية. الميتوكوندريا عضيات فريدة من نوعها لأن لها جينوم خاص بها يتضاعف وينتقل إلى الجيل التالي من الخلايا. على عكس الجينوم النووي ، هناك نسخ متعددة من جينوم الميتوكوندريا في الخلية. تعد الدراسة التفصيلية للآليات المسؤولة عن تكرار وإصلاح وصيانة جينوم الميتوكوندريا ضرورية لفهم الأداء السليم للميتوكوندريا والخلايا بأكملها في ظل الظروف العادية والمرضية. هنا ، يتم تقديم طريقة تسمح بالقياس الكمي عالي الإنتاجية لتوليف وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في الخلايا البشرية المزروعة في المختبر . يعتمد هذا النهج على الكشف المناعي لجزيئات الحمض النووي المركبة بنشاط والتي تم تصنيفها بواسطة دمج 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) والكشف المتزامن عن جميع جزيئات mtDNA مع الأجسام المضادة للحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصور الميتوكوندريا بأصباغ أو أجسام مضادة محددة. إن زراعة الخلايا في شكل متعدد الآبار واستخدام مجهر مضان آلي يجعل من السهل دراسة ديناميكيات mtDNA ومورفولوجيا الميتوكوندريا في ظل مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية في وقت قصير نسبيا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لمعظم الخلايا حقيقية النواة، تعتبر الميتوكوندريا عضيات أساسية؛ لأنها تلعب دورا مهما في العديد من العمليات الخلوية. أولا وقبل كل شيء ، الميتوكوندريا هي موردي الطاقة الرئيسيين للخلايا1. تشارك الميتوكوندريا أيضا في تنظيم التوازن الخلوي (على سبيل المثال ، الأكسدة والاختزال داخل الخلايا2 وتوازن الكالسيوم3) ، وإشارات الخلية4,5 ، وموت الخلايا المبرمج6 ، وتوليف المركبات الكيميائية الحيوية المختلفة 7,8 ، والاستجابة المناعية الفطرية9. يرتبط ضعف الميتوكوندريا بحالات مرضية مختلفة وأمراض بشرية10.

يعتمد عمل الميتوكوندريا على المعلومات الوراثية الموجودة في جينومين منفصلين: الجينوم النووي والميتوكوندريا. يشفر جينوم الميتوكوندريا عددا صغيرا من الجينات مقارنة بالجينوم النووي ، لكن جميع الجينات المشفرة بالحمض النووي mtDNA ضرورية لحياة الإنسان. يتم ترميز آلية بروتين الميتوكوندريا اللازمة للحفاظ على mtDNA بواسطة nDNA. تم بالفعل تحديد المكونات الأساسية لرد الميتوكوندريا ، وكذلك بعض عوامل التكوين الحيوي للميتوكوندريا (تمت مراجعتها في البحث السابق11،12). ومع ذلك ، لا تزال آليات تكرار الحمض النووي للميتوكوندريا وصيانتها بعيدة عن الفهم. على عكس nDNA ، يوجد جينوم الميتوكوندريا في نسخ متعددة ، مما يوفر طبقة إضافية لتنظيم التعبير الجيني للميتوكوندريا. لا يعرف الكثير حاليا عن توزيع وفصل mtDNA داخل العضيات ، إلى أي مدى يتم تنظيم هذه العمليات ، وإذا كانت كذلك ، فما هي البروتينات المشاركة13. يعد نمط الفصل أمرا بالغ الأهمية عندما تحتوي الخلايا على مجموعة مختلطة من الحمض النووي mtDNA من النوع البري والمتحول. قد يؤدي توزيعها غير المتكافئ إلى توليد خلايا تحتوي على كمية ضارة من mtDNA المتحور.

حتى الآن ، تم تحديد عوامل البروتين اللازمة لصيانة mtDNA بشكل أساسي عن طريق الطرق الكيميائية الحيوية أو التحليلات المعلوماتية الحيوية أو من خلال الدراسات المرتبطة بالمرض. في هذا العمل ، من أجل ضمان فرصة كبيرة لتحديد العوامل التي نجت من تحديد الهوية سابقا ، يتم وصف استراتيجية مختلفة. تعتمد الطريقة على وضع العلامات على mtDNA أثناء النسخ المتماثل أو الإصلاح باستخدام 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) ، وهو نظير نيوكليوزيد للثيميدين. يتم دمج BrdU بسهولة في خيوط الحمض النووي الوليدة أثناء تخليق الحمض النووي ، وبشكل عام ، يستخدم لمراقبة تكرار الحمض النوويالنووي 14. ومع ذلك ، فقد تم تحسين الإجراء الذي تم تطويره هنا للكشف عن BrdU المدمج في mtDNA باستخدام التألق المناعي للأجسام المضادة ل BrdU.

يسمح هذا النهج بالقياس الكمي عالي الإنتاجية لتخليق mtDNA وتوزيعه في الخلايا البشرية المزروعة في المختبر. من الضروري وجود استراتيجية عالية الإنتاجية لإجراء الاختبارات في ظل ظروف تجريبية مختلفة في وقت قصير نسبيا ؛ لذلك ، يقترح في البروتوكول استخدام تنسيق متعدد الآبار لزراعة الخلايا والمجهر الفلوري الآلي للتصوير. يتضمن البروتوكول نقل خلايا هيلا البشرية مع مكتبة siRNA والمراقبة اللاحقة لتكرار mtDNA أو إصلاحه باستخدام وضع العلامات الأيضية للحمض النووي المركب حديثا مع BrdU. يتم الجمع بين هذا النهج مع التلوين المناعي للحمض النووي بمساعدة الأجسام المضادة للحمض النووي. يتم تحليل كلتا المعلمتين باستخدام المجهر الفلوري الكمي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصور الميتوكوندريا بصبغة معينة. لإثبات خصوصية البروتوكول ، تم اختبار تلطيخ BrdU على خلايا خالية من mtDNA (خلايا rho0) ، وعلى خلايا HeLa عند إسكات عوامل صيانة mtDNA المعروفة ، وعلى خلايا HeLa بعد العلاج بمثبط تكرار mtDNA. تم قياس مستويات mtDNA أيضا بطريقة مستقلة ، وهي qPCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير خليط siRNA

  1. قبل يوم واحد من بدء التجربة ، خلايا البذور (على سبيل المثال ، HeLa) على طبق 100 مم بحيث تصل إلى التقاء 70٪ -90٪ في اليوم التالي.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع العمليات في ظل ظروف معقمة في غرفة التدفق الصفحي.
  2. تحضير الكمية المناسبة من siRNA المخفف إلى تركيز 140 نانومتر في وسط Opti-MEM (انظر جدول المواد). يمكن استخدام صفيحة 96 بئرا كخزان.
  3. أضف 5 ميكرولتر من محلول siRNA (أو وسيط Opti-MEM لعينات التحكم) إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا السوداء ذات 384 بئرا.
    ملاحظة: اعتمادا على عدد عينات siRNA التي تم اختبارها ، يمكن استخدام ماصة إلكترونية أو متعددة القنوات.
  4. قم بإعداد الكمية المناسبة من محلول كاشف نقل RNAiMAX (انظر جدول المواد) في وسط Opti-MEM. أضف 1 ميكرولتر من RNAiMAX لكل 100 ميكرولتر من الوسط.
  5. أضف 10 ميكرولتر من محلول كاشف النقل إلى كل بئر من لوحة 384 بئرا. الطريقة الأكثر ملاءمة وأسرع للقيام بذلك هي باستخدام موزع الكاشف.
  6. احتضان siRNA مع كاشف النقل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

2. تحضير الخلايا للنقل

  1. أثناء الحضانة (الخطوة 1.6) ، قم بنضح الوسط باستخدام جهاز شفط (انظر جدول المواد) ، واغسل الخلايا ب 3 مل من PBS.
  2. أضف 1.5 مل من التربسين المخفف 1: 2 في برنامج تلفزيوني ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. تحقق مما إذا كانت الخلايا قد انفصلت ؛ إذا كان الأمر كذلك ، أضف 3 مل من وسط DMEM مع 10٪ FBS. الخلايا جيدا ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. خذ ما لا يقل عن 150 ميكرولتر من التعليق ، وعد الخلايا في غرفة عد الخلايا (انظر جدول المواد).
  4. تحضير معلق الخلية بتركيز مناسب (35000 / مل لخط هيلا) في وسط DMEM مع 10٪ FBS والبنسلين والستربتومايسين.

3. نقل الخلايا

  1. أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 384 بئرا باستخدام موزع الكاشف. سيؤدي ذلك إلى زرع 700 خلية لكل بئر.
  2. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم وضعها في الحاضنة لمدة 72 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).

4. تأسيس BrdU

  1. قم بإعداد محلول 90 ميكرومتر من BrdU (انظر جدول المواد) في وسط DMEM مع 10٪ FBS.
  2. عند 56 ساعة بعد نقل siRNA (16 ساعة قبل تثبيت الخلية) ، أضف 10 ميكرولتر من محلول BrdU 90 ميكرومتر إلى كل بئر من لوحة 384 بئر (تركيز BrdU النهائي هو 20 ميكرومتر).
    ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء في أسرع وقت ممكن ؛ لذلك ، من الأفضل استخدام موزع الكاشف أو الماصة الإلكترونية أو ماصة متعددة الموزعات. تذكر تحضير آبار التحكم دون إضافة BrdU.
  3. احتضان الخلايا لمدة 16 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).

5. وضع العلامات على الميتوكوندريا

  1. قم بإعداد محلول 20 ميكرومتر من BrdU في DMEM مع 10٪ FBS ، وأضف إليه محلول صبغة تتبع الميتوكوندريا (انظر جدول المواد) بتركيز 1.1 ميكرومتر.
  2. في 15 ساعة بعد بدء دمج BrdU (1 ساعة قبل تثبيت الخلية) ، أضف 10 ميكرولتر من محلول صبغة تتبع الميتوكوندريا (انظر جدول المواد) إلى كل بئر من لوحة 384 بئر (تركيز الصبغة النهائي هو 200 نانومتر).
    ملاحظة: استخدم موزع كاشف أو ماصة إلكترونية أو ماصة متعددة الموزعات. تذكر الاحتفاظ بآبار التحكم دون إضافة BrdU ولكن مع إضافة صبغة تتبع الميتوكوندريا.
  3. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2).

6. تثبيت الخلية

ملاحظة: يتم إجراء جميع عمليات الغسيل بشكل أكثر ملاءمة باستخدام غسالة الصفائح الدقيقة ، بينما تتم إضافة الكواشف بسرعة أكبر باستخدام موزع الكاشف.

  1. باستخدام غسالة الألواح الدقيقة (انظر جدول المواد) ، اشطف كل بئر مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من PBS. بعد الغسيل الثاني ، اترك 25 ميكرولتر من PBS في البئر.
    ملاحظة: ترك برنامج تلفزيوني في البئر يقلل من احتمال انفصال الخلايا أثناء إضافة السائل في الخطوة التالية. يتم الانتهاء من جميع عمليات الغسيل مع ترك برنامج تلفزيوني ؛ لذلك ، يجب دائما تحضير المحلول المضاف في الخطوة التالية بتركيز 2x حيث ستتم إضافته بحجم متساو مع PBS المتبقي.
  2. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد 8٪ في PBS مع 0.4٪ Triton X-100 و Hoechst 33342 بتركيز 4 ميكروغرام / مل (التركيزات النهائية للكواشف الفردية هي 4٪ و 0.2٪ و 2 ميكروغرام / مل على التوالي) (انظر جدول المواد).
  3. احتضان اللوحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

7. الحجب

  1. شطف كل بئر أربع مرات مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير ، اترك 25 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في البئر.
  2. أضف 25 ميكرولتر من 6٪ BSA في PBS (تركيز BSA النهائي هو 3٪) لكل بئر.
  3. احتضان اللوحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

8. إضافة الأجسام المضادة الأولية

  1. قم بنضح BSA باستخدام غسالة microplate ، واترك 10 ميكرولتر من المحلول في البئر.
  2. أضف 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي المحضر في 3٪ BSA في PBS. استخدم مضاد BrdU عند 0.8 ميكروغرام / مل ومضاد الحمض النووي عند 0.4 ميكروغرام / مل (التركيزات النهائية للأجسام المضادة هي 0.4 ميكروغرام / مل و 0.2 ميكروغرام / مل ، على التوالي) (انظر جدول المواد).
  3. احتضان الطبق في الظلام عند 4 درجات مئوية طوال الليل.

9. إضافة الأجسام المضادة الثانوية

  1. شطف كل بئر أربع مرات مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير ، اترك 10 ميكرولتر من PBS في البئر.
  2. أضف 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية 4 ميكروغرام / مل المحضر في 6٪ BSA في PBS (التركيز النهائي هو 2 ميكروغرام / مل). استخدم الأجسام المضادة الخاصة بالنمط المتماثل (IgG1 المضاد للفأر و IgM المضاد للفأر) المترافقة مع الفلوروكرومات مثل Alexa Fluor 488 و Alexa Fluor 555 (انظر جدول المواد).
  3. احتضان اللوحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  4. شطف كل بئر أربع مرات مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير ، اترك 50 ميكرولتر من PBS في البئر.
  5. أغلق اللوحة بغشاء لاصق مانع للتسرب (انظر جدول المواد) ، وقم بتخزينها في الظلام عند 4 درجات مئوية. يجب إجراء التصوير في غضون 2 أسابيع.

10. التصوير

ملاحظة: يجب إجراء التصوير باستخدام مجهر آلي واسع المجال ؛ يجب أن يكون المجهر مزودا بمرحلة حركية مزودة بعناصر تحكم لتصوير المناطق الفردية من اللوحة تلقائيا.

  1. تحقق من إعدادات التركيز البؤري التلقائي في مناطق الزاوية من اللوحة (الآبار A1 ، A24 ، P24 ، P1) وفي المنتصف.
    ملاحظة: للتصوير ، يوصى باستخدام هدف مسافة عمل قصيرة 20x (انظر جدول المواد) بأعلى فتحة رقمية ممكنة.
  2. استنادا إلى الرسوم البيانية للكثافة التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج التصوير في وضع العرض المباشر ، حدد وقت تعريض طويل بما فيه الكفاية لقنوات التألق الفردية بحيث لا تكون الصورة الناتجة مفرطة التشبع.
  3. اضبط العدد المناسب من الطائرات للتصوير على المحور z.
    ملاحظة: مجال الرؤية عند التكبير 20x كبير بما يكفي بحيث لا تكون جميع الخلايا في نفس مستوى التركيز ، لذلك يجب إجراء المقطع z لعرض جميع الخلايا في مستوى التركيز الصحيح. عادة ، خمس طائرات كافية. اعتمادا على توفر مساحة القرص ، يمكن حفظ مكدسات z الفردية أو توقعات الكثافة القصوى فقط. يعتمد تحليل الصورة الموضح في قسم النتائج التمثيلية على توقعات الكثافة القصوى.
  4. حدد العدد المناسب من حقول العرض لعرضها لكل بئر.
    ملاحظة: اعتمادا على الالتقاء ، يمكن تصوير ما يقرب من 60-300 خلية في مجال رؤية واحد. عادة ، بالنسبة لخلايا HeLa ذات التقاء 60٪ -90٪ ، فإن تصوير خمسة مجالات رؤية سيسمح للمرء بالتحليل من 500 خلية إلى أكثر من 1000 خلية.
  5. حدد الآبار المراد تصويرها ، وابدأ التصوير.

11. التحليل الكمي للصور

ملاحظة: يمكن إجراء التحليل الكمي للصور المكتسبة باستخدام برنامج مفتوح المصدر مثل Cell Profiler15. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم إجراء التحليل باستخدام برنامج ScanR 3.0.0 (انظر جدول المواد).

  1. ابدأ التحليل عن طريق إجراء تصحيح الخلفية لجميع الصور من جميع القنوات الفلورية. اعتمادا على حجم الكائنات التي تم تحليلها ، حدد حجم المرشح المناسب: 80 بكسل لنوى الخلية و 4 بكسل لبقع BrdU و mtDNA.
  2. ابدأ في تقسيم الصورة عن طريق إنشاء قناع للكائن الرئيسي بناء على نسبة شدة إشارة التألق إلى خلفية القناة المقابلة لنواة الخلية.
  3. قم بإنشاء أقنعة للكائنات الفرعية التي تمثل بقع BrdU و mtDNA ، على التوالي ، باستخدام قنوات التألق المناسبة للهياكل المحددة.
    ملاحظة: يتم تعيين كل كائن فرعي لأقرب كائن رئيسي (نواة الخلية).
  4. اضبط المعلمات المراد قياسها أثناء التحليل ، وقم بقياس شدة وحدات البكسل الفردية داخل كل قناع لجميع قنوات التألق.
    ملاحظة: من الضروري أيضا حساب عدد الكائنات الفرعية المخصصة لنواة خلية معينة ومساحة كل كائن فرعي.
  5. تحديد المعلمات المشتقة المراد حسابها بناء على البيانات التي تم الحصول عليها. للحصول على شدة التألق الكلية لقناة BrdU أو mtDNA ، قم بتلخيص شدة جميع الكائنات الفرعية المخصصة لنواة خلية معينة. للحصول على متوسط شدة التألق ، قسم إجمالي شدة التألق على مجموع مساحة الكائنات الفرعية المخصصة لنواة خلية معينة.
    ملاحظة: للتأكد من أن الكائن الفرعي الذي تم إنشاؤه (BrdU أو mtDNA spot) موجود بالفعل في الميتوكوندريا ، من الضروري بوابتها بناء على شدة التألق من صبغة تتبع الميتوكوندريا.
  6. قم بإجراء مزيد من التحليل للبيانات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج ScanR باستخدام البرنامج الإحصائي R 4.2.216 جنبا إلى جنب مع الحزم التالية: dplyr 17 و data.table 18 و ggplot219 و ggpubr20. هذه الخطوة اختيارية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر مخطط لإجراء الدراسة عالية الإنتاجية لديناميكيات تخليق وتوزيع mtDNA في الشكل 1. يتيح استخدام تنسيق لوحة متعددة الآبار التحليل المتزامن للعديد من الظروف التجريبية المختلفة ، مثل إسكات الجينات المختلفة باستخدام مكتبة siRNA. تسمح الظروف المستخدمة لوضع العلامات على جزيئات الحمض النووي المركبة حديثا باستخدام BrdU بالكشف عن الحمض النووي المسمى BrdU في الميتوكوندريا لخلايا HeLa (الشكل 2A) ولكن يمكن استخدامها أيضا كشروط انطلاق لإعداد الفحص لأنواع الخلايا الأخرى. يجب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تاريخيا ، تم استخدام وضع علامات الحمض النووي عن طريق دمج BrdU والكشف عن الأجسام المضادة في تكرار الحمض النووي النووي وأبحاث دورة الخلية14،27،28. حتى الآن ، تضمنت جميع بروتوكولات الكشف عن الحمض النووي المسمى BrdU خطوة تمسخ الحمض النووي (حمضي أو حراري) أو هضم الإنزيم (DNase أو البروتيناز) لتمكين التعرض للحواتم وتسهيل اختراق الأجسام المضادة. تم تطوير هذه البروتوكولات للحمض النووي المعبأ بإحكام. ومع ذلك ، فإن التنظيم المختلف ل mtDNA...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا (رقم المنحة / الجائزة: 2018/31 / D / NZ2 / 03901).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)Sigma-AldrichD5782
384  صفائح دقيقة لثقافة خلايا الآبار ، أسودGreiner Bio-One# 781946
5-Bromo-2 & prime ؛ -deoxyuridine (BrdU)Sigma-AldrichB5002-1Gقم بإذابة مسحوق BrdU في الماء إلى محلول مخزون 20 ملي مولار وكمية كبيرة. استخدم 20 ميكرو ؛ حل M BrdU لوضع العلامات.
فيلم مانع للتسربلاصق Nerbe Plus04-095-0060
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG1 الجسم المضاد الثانويThermo Fisher ScientificA-21121
Alexa Fluor 555 الماعز المضاد للفأر IgM الجسم المضاد الثانويThermo Fisher ScientificA-21426
BioTek 405 LS غسالة ميكروبليتAgilent
Bovine Serum Albumin (BSA)غرفة عد الخلايا Sigma-AldrichA4503
ThomaHeinz HerenzREF: 1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)CytivaSH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965-062
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Thermo Fisher Scientific10270-106
محلول الفورمالديهايدSigma-AldrichF1635الفورمالديهايد سام ؛ يرجى قراءة ورقة بيانات السلامة بعناية.
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
IgG1 الفأر أحادي النسيلة المضاد ل BrdU (IIB5) الجسم المضاد الأساسيسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-32323
IgM الفأر أحادي النسيلة مضاد للحمض النووي (AC-30-10) الجسم المضاد الأساسيProgen# 61014
LightCycler 480 SystemRoche
Lipofectamine RNAiMAX كاشف التعداءالحراري فيشر العلمي# 13778150
MitoTracker ديب ريد FMثيرمو فيشر العلميM22426تتبع الميتوكوندريا   ؛
موزع كاشف كومبي متعددالقطرات Thermo Fisher Scientific
Opti-MEMThermo Fisher Scientific51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD CameraHamamatsu
Penicillin-Streptomycin Sigma-AldrichP0781-100ML
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Sigma-AldrichP4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
qPCR التمهيدي Fw B2M (مرجع)CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR التمهيدي Fw GPI (الجين المرجعي)GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR التمهيدي Fw MT-ND1   ؛TAGCAGAGACCAACCGAACC 
qPCR التمهيدي Fw POLGTGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR التمهيدي Fw TFAMGATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR التمهيدي Fw TWNKGCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR التمهيدي Rev B2M (مرجع)GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR التمهيدي Rev GPI (الجين المرجعي)AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR التمهيدي Rev MT-ND1   ؛ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 
qPCR التمهيدي Rev POLGGGAGTCAACACCTGGCTTTGG
qPCR التمهيدي Rev TFAMGGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR التمهيدي Rev TWNKAACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR المجهرأوليمبوس
siRNA CtrlدارماكونD-001810-10-5
siRNA POLGInvitrogenPOLGHSS108223
siRNA TFAMInvitrogenTFAMHSS144252
siRNA TWNKInvitrogenC10orf2HSS125597
جهاز شفطNeoLab2-9335جهاز شفط لزراعة الخلايا
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500ML
TrypsinBiowestL0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA الهدفأوليمبوس
صبغة محلول   ؛ 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
  2. Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284(2019).
  3. Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102(2020).
  6. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  7. Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
  8. Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579(2020).
  9. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  10. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  11. Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
  12. Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
  13. Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
  14. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  15. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  16. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
  17. Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
  18. Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
  19. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
  20. Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
  21. Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
  22. Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
  23. Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
  24. Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
  25. Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
  26. Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
  27. Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
  28. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
  29. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
  30. Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial DNADNA SynthesisHigh Throughput ImagingImage QuantificationImmunofluorescence DetectionBrdU IncorporationMitochondrial DistributionAutomated MicroscopysiRNA TransfectionFluorescence Microscopy

Related Articles