Method Article

طريقة دقيقة وقابلة للقياس الكمي لجمع الدملمف من المفصليات الصغيرة

DOI:

10.3791/65250

⸱

April 28th, 2023

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, University of Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا طريقة لجمع الهيموليمف القابل للقياس الكمي بكفاءة من المفصليات الصغيرة للتحليل اللاحق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المعروف أن مفصليات الأرجل تنقل مجموعة متنوعة من الفيروسات ذات الأهمية الطبية والزراعية من خلال الدملمف الدموي ، وهو أمر ضروري لانتقال الفيروس. جمع الهيموليمف هو التكنولوجيا الأساسية لدراسة تفاعلات ناقلات الفيروسات. هنا ، نصف طريقة جديدة وبسيطة للجمع الكمي للهيموليمف من المفصليات الصغيرة باستخدام Laodelphax striatellus (نطاط النبات البني الصغير ، SBPH) كنموذج بحثي ، حيث أن هذه المفصليات هي الناقل الرئيسي لفيروس شريط الأرز (RSV). في هذا البروتوكول ، تبدأ العملية بالضغط بلطف على ساق واحدة من المفصليات المجمدة بملاقط ذات رؤوس دقيقة والضغط على الدملمف خارج الجرح. بعد ذلك ، يتم استخدام ماصة صغيرة بسيطة تتكون من لمبة شعرية وماصة لجمع الدملمف المتعدي من الجرح وفقا لمبدأ القوى الشعرية. أخيرا ، يمكن إذابة الدملمف الذي تم جمعه في مخزن مؤقت محدد لمزيد من الدراسة. هذه الطريقة الجديدة لجمع الهيموليمف من المفصليات الصغيرة هي أداة مفيدة وفعالة لمزيد من البحوث حول الفيروسات المنقولة بالمفصليات والتفاعلات بين الفيروسات والفيروسات الناقلة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تنتقل كل من الفيروسات الحيوانية والنباتية عن طريق المفصليات ، وتشكل هذه الفيروسات تهديدا خطيرا لصحة الإنسان وتسبب خسائر اقتصادية هائلة في الزراعة1،2،3. الأهم من ذلك ، أن اللمف المفصلي ، الذي يعمل كجهاز الدورة الدموية وعنصر حيوي في الجهاز المناعي في المفصليات ، يلعب دورا مهما في تنظيم انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات. يتم نقل الفيروسات المكتسبة من خلال أمعاء المفصليات إلى الأنسجة الأخرى فقط بعد الهروب بنجاح من البيئة الليمفاوية الضارة4،5،6،7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تربية الحشرات

  1. رفع SBPHs المستخدمة في هذه التجربة في شتلات الأرز (Oryza sativa cv. Nipponbare). ازرع 20 شتلة أرز في حاضنة (65 مم × 200 مم) ، وتنمو عند 25 درجة مئوية تحت فترة ضوئية فاتحة / 8 ساعات مظلمة.

2. تشريح SBPHs لجمع الدملمف

  1. ضع SBPHs في أنبوب طرد مركزي ، وضعها في حمام جليدي لمدة 10-30 دقيقة.
    ملاحظة: لا تضع SBPHs في حمام الجليد لمدة تقل عن 10 دقائق ، وإلا فقد تنتعش الحشرات.
  2. ضع SBPH مجمدا على شريحة زجاجية (انظر جدول المواد) تحت مجهر مجسم (انظر جدول المواد) مع توجيه بطنه لأعلى. ضبط التركيز على الأرجل الستة للحشرة.
    3. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نموذج Micropipette وجمع الهيموليمف
لقد طورنا ماصة صغيرة بسيطة يعتمد عملها على القوى الشعرية للأنبوب الشعري. تتكون الماصة الدقيقة من أنبوب شعري ومصباح ماصة (الشكل 1 أ). تتوفر الأنابيب الشعرية بأحجام مختلفة تتراوح من 1 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر ، ويتم اختيار أحجام الأنبوب الشعري وفقا للمتطلبات. لا يقترح استخدام الأنابيب الشعرية ذات الأحجام الأصغر لأن الفتحات الدقيقة الإضافية للأنابيب ذات الحجم الأصغر يمكن أن تجعل من الصعب امتصاص السائل مثل الدملمف. تحتوي لمبة الماصة على فتحة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهيموليمف هو وسط الجهاز الدوري في المفصليات ، ولا يمكن للفيروسات المنقولة بالمفصليات أن تغزو أنسجة المفصليات الأخرى إلا إذا كانت قادرة على البقاء على قيد الحياة في بيئة الهيموليمف المعادية. يعد جمع عينة عالية الجودة من الدملمف الخطوة الأولى في دراسة تفاعلات الفيروس الناقل التي تحدث في الدملمف. تم الإبلاغ عن أنه يمكن الحصول على دملمف الحشرات من عدة مواقع على جسم الحشرة ، بما في ذلك جرح في الساق الأمامية ، أو شق بسيط في منطقة الرأس ، أو جرح مسيل للدموع في البطن26،27،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2022YFD1401700) ومن قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (رقم 32090013 ورقم 32072385).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10٪ جل البروتين SDS-PAGEBio-rad4561035فصل البروتين والكشف
عنه 4٪ بارافورمالدهيدSolarbioP1110لتثبيت الخلايا أو الأنسجة ؛
كاشف صبغة برادفوردBio-rad5000205الكشف عن تركيز البروتين
الشعيرات الدمويةHirschmann9000101لجمع غرفة عد الخلايا الهيموليمف
ACMECAYA0810عد الخلايا الدموية شريحة
زجاجيةGitoglas10127105Aلحمل الحشرات
شريحة زجاجية مطلية ب silaneSigmaS4651-72EAلعقد عينات المجهر
كاشف الذهب المضاد للبهتان مع DAPIInvitrogenP36935تلطيخ النواة
زجاجGitoglas10212424Cللمراقبة المجهرية
لمبة الماصةHirschmann9000101لجمع برنامج hemolymph
Prism 8.0برنامج GraphPad/التحليلات الإحصائية
المجهر المجسم MoticSMZ-168لتشريح الحشرات
ملاقطTianldP5622لتشريح الحشرات
مجهر Zeiss المقلوبZeissObserver Z1مراقبة الخلايا الدموية
غطاء مجهر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemolymph CollectionSmall ArthropodsVirus Vector InteractionsArbovirus TransmissionCapillary MicropipetteSmall Brown PlanthopperStereo MicroscopeProtein QuantificationHemocyte AnalysisSDS PAGE

Related Articles