وصفنا طريقة لجمع الهيموليمف القابل للقياس الكمي بكفاءة من المفصليات الصغيرة للتحليل اللاحق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة دقيقة وقابلة للقياس الكمي لجمع الدملمف من المفصليات الصغيرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
من المعروف أن مفصليات الأرجل تنقل مجموعة متنوعة من الفيروسات ذات الأهمية الطبية والزراعية من خلال الدملمف الدموي ، وهو أمر ضروري لانتقال الفيروس. جمع الهيموليمف هو التكنولوجيا الأساسية لدراسة تفاعلات ناقلات الفيروسات. هنا ، نصف طريقة جديدة وبسيطة للجمع الكمي للهيموليمف من المفصليات الصغيرة باستخدام Laodelphax striatellus (نطاط النبات البني الصغير ، SBPH) كنموذج بحثي ، حيث أن هذه المفصليات هي الناقل الرئيسي لفيروس شريط الأرز (RSV). في هذا البروتوكول ، تبدأ العملية بالضغط بلطف على ساق واحدة من المفصليات المجمدة بملاقط ذات رؤوس دقيقة والضغط على الدملمف خارج الجرح. بعد ذلك ، يتم استخدام ماصة صغيرة بسيطة تتكون من لمبة شعرية وماصة لجمع الدملمف المتعدي من الجرح وفقا لمبدأ القوى الشعرية. أخيرا ، يمكن إذابة الدملمف الذي تم جمعه في مخزن مؤقت محدد لمزيد من الدراسة. هذه الطريقة الجديدة لجمع الهيموليمف من المفصليات الصغيرة هي أداة مفيدة وفعالة لمزيد من البحوث حول الفيروسات المنقولة بالمفصليات والتفاعلات بين الفيروسات والفيروسات الناقلة.
المقدمة
يمكن أن تنتقل كل من الفيروسات الحيوانية والنباتية عن طريق المفصليات ، وتشكل هذه الفيروسات تهديدا خطيرا لصحة الإنسان وتسبب خسائر اقتصادية هائلة في الزراعة1،2،3. الأهم من ذلك ، أن اللمف المفصلي ، الذي يعمل كجهاز الدورة الدموية وعنصر حيوي في الجهاز المناعي في المفصليات ، يلعب دورا مهما في تنظيم انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات. يتم نقل الفيروسات المكتسبة من خلال أمعاء المفصليات إلى الأنسجة الأخرى فقط بعد الهروب بنجاح من البيئة الليمفاوية الضارة4،5،6،7.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تربية الحشرات
- رفع SBPHs المستخدمة في هذه التجربة في شتلات الأرز (Oryza sativa cv. Nipponbare). ازرع 20 شتلة أرز في حاضنة (65 مم × 200 مم) ، وتنمو عند 25 درجة مئوية تحت فترة ضوئية فاتحة / 8 ساعات مظلمة.
2. تشريح SBPHs لجمع الدملمف
- ضع SBPHs في أنبوب طرد مركزي ، وضعها في حمام جليدي لمدة 10-30 دقيقة.
ملاحظة: لا تضع SBPHs في حمام الجليد لمدة تقل عن 10 دقائق ، وإلا فقد تنتعش الحشرات. - ضع SBPH مجمدا على شريحة زجاجية (انظر جدول المواد) تحت مجهر مجسم (انظر جدول المواد) مع توجيه بطنه لأعلى. ضبط التركيز على الأرجل الستة للحشرة. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نموذج Micropipette وجمع الهيموليمف
لقد طورنا ماصة صغيرة بسيطة يعتمد عملها على القوى الشعرية للأنبوب الشعري. تتكون الماصة الدقيقة من أنبوب شعري ومصباح ماصة (الشكل 1 أ). تتوفر الأنابيب الشعرية بأحجام مختلفة تتراوح من 1 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر ، ويتم اختيار أحجام الأنبوب الشعري وفقا للمتطلبات. لا يقترح استخدام الأنابيب الشعرية ذات الأحجام الأصغر لأن الفتحات الدقيقة الإضافية للأنابيب ذات الحجم الأصغر يمكن أن تجعل من الصعب امتصاص السائل مثل الدملمف. تحتوي لمبة الماصة على فتحة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الهيموليمف هو وسط الجهاز الدوري في المفصليات ، ولا يمكن للفيروسات المنقولة بالمفصليات أن تغزو أنسجة المفصليات الأخرى إلا إذا كانت قادرة على البقاء على قيد الحياة في بيئة الهيموليمف المعادية. يعد جمع عينة عالية الجودة من الدملمف الخطوة الأولى في دراسة تفاعلات الفيروس الناقل التي تحدث في الدملمف. تم الإبلاغ عن أنه يمكن الحصول على دملمف الحشرات من عدة مواقع على جسم الحشرة ، بما في ذلك جرح في الساق الأمامية ، أو شق بسيط في منطقة الرأس ، أو جرح مسيل للدموع في البطن26،27،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2022YFD1401700) ومن قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (رقم 32090013 ورقم 32072385).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10٪ جل البروتين SDS-PAGE | Bio-rad | 4561035 | فصل البروتين والكشف |
| عنه 4٪ بارافورمالدهيد | Solarbio | P1110 | لتثبيت الخلايا أو الأنسجة ؛ |
| كاشف صبغة برادفورد | Bio-rad | 5000205 | الكشف عن تركيز البروتين |
| الشعيرات الدموية | Hirschmann | 9000101 | لجمع غرفة عد الخلايا الهيموليمف |
| ACMEC | AYA0810 | عد الخلايا الدموية شريحة | |
| زجاجية | Gitoglas | 10127105A | لحمل الحشرات |
| شريحة زجاجية مطلية ب silane | Sigma | S4651-72EA | لعقد عينات المجهر |
| كاشف الذهب المضاد للبهتان مع DAPI | Invitrogen | P36935 | تلطيخ النواة |
| زجاج | Gitoglas | 10212424C | للمراقبة المجهرية |
| لمبة الماصة | Hirschmann | 9000101 | لجمع برنامج hemolymph |
| Prism 8.0 | برنامج GraphPad | / | التحليلات الإحصائية |
| المجهر المجسم | Motic | SMZ-168 | لتشريح الحشرات |
| ملاقط | Tianld | P5622 | لتشريح الحشرات |
| مجهر Zeiss المقلوب | Zeiss | Observer Z1 | مراقبة الخلايا الدموية |
المراجع
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
