يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تشريح الأوعية الدموية للفأر البالغ من أجل تسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة

4.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65254

⸱

أبريل 21, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Auditory Development and Restoration Program, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

السطور الوعائية أمر حيوي لتوليد إمكانات القوقعة الداخلية. هنا ، نقدم تشريح الأوعية الدموية للفأر البالغ لتسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة.

الملخص

تعد إمكانات Endocochlear ، التي يتم إنشاؤها بواسطة السطور الوعائية ، ضرورية للحفاظ على بيئة مواتية للنقل الميكانيكي المناسب لخلايا الشعر والسمع في نهاية المطاف. يمكن أن تؤدي أمراض الأوعية الدموية السطورية إلى انخفاض السمع. يسمح تشريح الأوعية الدموية للخطوط البالغة بالتقاط نواة واحدة مركزة وتسلسل النواة المفردة اللاحقة والبقع المناعية. تستخدم هذه التقنيات لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للأوعية الدموية السعيرة على مستوى الخلية الواحدة.

يمكن استخدام تسلسل النواة المفردة في إعداد التحليل النسخي للأوعية الدموية السطورية. وفي الوقت نفسه، لا يزال التلوين المناعي مفيدا في تحديد مجموعات معينة من الخلايا. تتطلب كلتا الطريقتين تشريح الأوعية الدموية المناسب كشرط أساسي ، والذي يمكن أن يكون تحديا تقنيا.

المقدمة

تتكون القوقعة من ثلاث غرف مملوءة بالسوائل ، سكالا الدهليز ، سكالا ميديا ، وسكالا تيمباني . يحتوي كل من سكالا الدهليزي وسكالا تيمباني على perilymph ، الذي يحتوي على تركيز عال من الصوديوم (138 mM) وتركيز منخفض من البوتاسيوم (6.8 mM) 1. تحتوي وسائط سكالا على اللمف الداخلي ، الذي يحتوي على تركيز عال من البوتاسيوم (154 مللي مول) وتركيز منخفض من الصوديوم (0.91 مللي مول) 1،2،3. يمكن الإشارة إلى هذا الاختلاف في تركيز الأيونات باسم جهد القوقعة الداخلية (EP) ، ويتولد بشكل أساسي عن طريق حركة أيونات البوتاسيوم عبر قنوات أيونية مختلفة وتقاطعات الفجوة في الأوعية الدموية السطورية (SV) على طول الجدار الجانبي للقوقعة4،5،6،7،8،9،10،11. SV هو نسيج غير متجانس شديد الأوعية الدموية يبطن الجانب الإنسي للجدار الجانبي للقوقعة ويحتوي على ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا: الخلايا الهامشية والمتوسطة والقاعدية12 (الشكل 1).

ترتبط الخلايا الهامشية عن طريق تقاطعات ضيقة لتشكيل السطح الأكثر وسطية ل SV. يواجه الغشاء القمي اللمف الداخلي لوسط سكالا ويساهم في نقل أيونات البوتاسيوم إلى اللمف الداخلي باستخدام قنوات مختلفة ، بما في ذلك KCNE1 / KCNQ1 و SLC12A2 و Na + -K + -ATPase (NKA) 5،10،13،14. الخلايا الوسيطة هي خلايا مصطبغة تقع بين الخلايا الهامشية والقاعدية وتسهل نقل البوتاسيوم عبر SV باستخدام KCNJ10 (Kir 4.1) 15,16. تقع الخلايا القاعدية على مقربة من الجدار الجانبي للقوقعة وترتبط ارتباطا وثيقا بالخلايا الليفية في الرباط الحلزوني لتعزيز إعادة تدوير البوتاسيوم من perilymph12. وقد تورط علم الأمراض من SV في العديد من اضطرابات الأذن17،18. يمكن أن تسبب الطفرات في الجينات المعبر عنها في أنواع خلايا SV الرئيسية ، مثل Kcnq1 و Kcne1 و Kcnj10 و Cldn11 ، الصمم واختلال SV ، بما في ذلك فقدان EP19،20،21،22،23. بالإضافة إلى أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة ، هناك أنواع أخرى من الخلايا أقل دراسة في SV ، مثل خلايا المغزل 22 ، وخلايا الجذر12,24 ، والبلاعم 25 ، والخلايا المحيطة 26 ، والخلايا البطانية 27 ، التي لها أدوار غير محددة بشكل كامل تتضمن التوازن الأيوني وتوليد EP 28.

بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (sNuc-Seq) معلومات حول عدم تجانس الخلية ، بدلا من متوسط mRNA عبر مجموعة من الخلايا29 ، ويمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص عند دراسة SV30 غير المتجانس. على سبيل المثال ، أنتجت sNuc-Seq تحليلا نسخيا يشير إلى أنه قد يكون هناك دور لخلايا المغزل والجذر في توليد EP وفقدان السمع ومرض Meniere18. يمكن أن يزودنا التوصيف النسخي الإضافي لأنواع خلايا SV المختلفة بمعلومات لا تقدر بثمن حول الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء الآليات والأنواع الفرعية المختلفة لتقلب السمع وفقدان السمع المرتبط ب SV. إن حصاد هياكل الأذن الداخلية الحساسة هذه له أهمية قصوى لتحليل الأنسجة الأمثل.

في هذه الدراسة ، تم وصف نهج التشريح المجهري للوصول إلى السطور الوعائية وعزلها من قوقعة الفئران البالغة من أجل sNuc-Seq أو التلوين المناعي. مطلوب تشريح الفأر البالغ SV لفهم أنواع خلايا SV المختلفة وتوصيف دورها في السمع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب والإجراءات على الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى ، المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى ، المعاهد الوطنية للصحة. تم تنفيذ جميع الطرق وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة للجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى ، المعاهد الوطنية للصحة.

1. القتل الرحيم للحيوانات

  1. استخدم الفئران المعدلة وراثيا C57BL / 6J أو Kcnj10-ZsGreen ، يوم ما بعد الولادة 30+ (P30+) ، والتي يتراوح وزنها بين 15-20 جم.
  2. القتل الرحيم للفأر البالغ (العمر P30 أو أكبر) باستخدام بروتوكول معتمد (هنا CO2 الاختناق). أداء قطع الرأس كخطوة ثانوية.
    ملاحظة: في حالة التلوين المناعي ، قد يكون لبعض الأجسام المضادة إشارة خلفية بسبب الارتباط غير المحدد بالدم في الشعيرات الدموية في SV. يمكن أن يعالج التروية القلبية مع المثبت هذه المشكلة عن طريق إزالة الدم من الشعيرات الدموية في SV. ومع ذلك ، يمكن لمعظم الأجسام المضادة تحقيق نتائج جيدة بدون هذه الطريقة ، ولن يتم تغطيتها في هذا البروتوكول.

2. فضح المتاهة العظمية

  1. نظف الماوس عن طريق الرش بنسبة 70٪ من الإيثانول والمسح بمنشفة ورقية. إيلاء اهتمام خاص لمنطقة الرأس للحد من خطر التلوث. إزالة الجلد من الجمجمة عن طريق سحب الجلد نحو الأنف.
  2. باستخدام مقص حاد ، قم بتقسيم الجمجمة على طول المستوى السهمي لفصل الأجزاء اليمنى واليسرى.
  3. إزالة الدماغ من الجمجمة لكشف المتاهة العظمية.

3. استخراج الأذن الداخلية

  1. تحديد الأذن الداخلية داخل العظم الصدغي (الشكل 2 أ) وكشط الأعصاب القحفية باستخدام # 55 ملقط.
    ملاحظة: يجب على المستخدم تثبيت العينة بيده غير المهيمنة باستخدام مجموعة ثانية من ملقط # 55. يمكن إمساك مناطق مختلفة من العينة بالملقط المثبت في جميع أنحاء التشريح إذا تم تجنب المناطق الحرجة من العينة (على سبيل المثال ، لا تسحق القوقعة).
  2. باستخدام ملقط # 55 ، قم بتشريح الفقاعة والكبسولة ، وفصلها عن العظام المحيطة. قم بإزالة أي أنسجة رخوة متبقية من سطح الأذن الداخلية.
  3. انقل العينة إلى طبق زراعة الأنسجة الصافية الذي يحتوي على 1x PBS بارد (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، ودرجة الحموضة 7.4 ، وضعها تحت نطاق تشريح (الشكل 2 ب).

4. تشريح SV

ملاحظة: مع الممارسة ، من الممكن تشريح SV كقطعة واحدة طويلة تشبه الشريط. SV هش ، لذلك إذا انقسم إلى قطع ، فقد يتم تخزينها معا. بدلا من ذلك ، يمكن تخزينها في آبار مصنفة بشكل منفصل وفقا لدورها (على سبيل المثال ، القاعدية والمتوسطة والقمية).

  1. إذا كان من الممكن تحريك مصادر ضوء نطاق التشريح ، فضع ضوءا واحدا فوق الطبق ومصدر الضوء الثاني من الجانب ، بالتوازي مع سطح التشريح. هذا يسمح بتباين أفضل للأنسجة تحت عظم القوقعة.
  2. باستخدام ملقط # 55 ، أمسك العينة من الجزء الدهليزي مع توجيه القوقعة لأعلى.
  3. باستخدام ملقط # 55 ، اخترق عظم القوقعة في القمة.
    ملاحظة: # 5 ملقط أكثر سمكا من # 55 ويمكن استخدامه لكسر العظام ، لكن الزيادة في الحجم / القوة تضحي بصفاء الملقط والقدرة على التلاعب بالأنسجة الصغيرة. ضع في اعتبارك استخدام ملقط مصنوع من مادة مثل الإينو أو دوموستار لتجنب الضرر الذي قد يحدث للملقط الأكثر حساسية. تجنب دفع الملقط عميقا جدا تحت العظم لتجنب إتلاف SV.
  4. باستخدام ملقط # 55 ، اكشط على طول المنعطف القمي (الشكل 2C) ، مع تطبيق قوة لطيفة لكسر قطع صغيرة من طبقة العظام الخارجية. ارفع العظم برفق وافصله عن الجدار الجانبي.
    ملاحظة: قد يكون من المفيد التفكير في هذا التشريح على أنه "إزالة كل شيء بعيدا عن SV" ، بدلا من "تشريح SV خارج القوقعة".
  5. استمر في استخدام ملقط #55 لإزالة قطع عظم القوقعة من المنعطفات القمية والوسطى (الشكل 2D ، E). ادفع الجدار الجانبي برفق لأسفل ، وانزع قطع الجدار العظمي وأزلها باتجاه المنعطف الأوسط لكشف الجدار الجانبي للمنعطفات القمية والوسطى.
  6. الاستمرار في استخدام ملقط # 55 ، ادفع الجدار الجانبي القمي برفق جانبا لفضح العقدة الحلزونية. افصل الجدار الجانبي للمنعطفات القمية والمتوسطة عن العقدة الحلزونية على طول طبقة خلايا الشعر الخارجية. إزالة قطع من العقدة الحلزونية من داخل القوقعة.
    ملاحظة: # 55 ملقط أصغر وتوفر ميزة عند التعامل مع الأنسجة الصغيرة والحساسة. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب ثنيها أو إتلافها.
  7. للوصول بشكل أفضل إلى الجدار الجانبي للمنعطف القاعدي ، افصل القوقعة عن الجزء الدهليزي من العظم الصدغي باستخدام # 55 ملقط. ضع ملقط # 55 في النافذة المستديرة والبيضاوية وادفع لأسفل نحو الدهليز. سوف تنفصل القوقعة. قم بإزالة الجزء الدهليزي من الأذن الداخلية.
  8. الاستمرار في استخدام # 55 ملقط ، قم الآن بإزالة قطع من عظم القوقعة القاعدية ، بدءا من منطقة الانعطاف الأوسط. ادفع طبقة الجدار الجانبي برفق أسفل العظم لفصلها.
  9. قم بإزالة الجزء القاعدي الأبعد من الجدار الجانبي عن طريق التحديق وسحب الأنسجة برفق. قد يكون العظم في هذه المنطقة سميكا جدا بحيث لا يمكن إزالته دون إتلاف الأنسجة الرخوة أدناه.
  10. الآن ، مع فصل الجزء القاعدي من الجدار الجانبي ، افصل أكبر قدر ممكن من الجدار الجانبي عن القوقعة. يمكن القيام بذلك عن طريق تتبع ملقط # 55 على طول الجدار الجانبي. قم بتنظيف الملقط برفق بين العظم والجدار الجانبي المتبقي. يمكن القيام بذلك على طول الطريق إلى القمة في قطعة واحدة إذا كان المستخدم من ذوي الخبرة. انقل الجدار الجانبي إلى برنامج تلفزيوني جديد.
    ملاحظة: على الرغم من أن القطع الأكبر من SV قد يكون من الأسهل تصويرها ، نظرا للطبيعة الحساسة للأنسجة ، يمكن التقاط قطع أصغر (الشكل 2F ، G) ، واعتمادا على الحجم ، يمكن أن تعمل أيضا للتصوير.
  11. استخدم # 55 ملقط لوضع الجدار الجانبي بشكل مسطح. يجب أن يكون SV مرئيا كطبقة داكنة من الأنسجة على الجانب الداخلي للجدار الجانبي.
    ملاحظة: قد يجد المستخدمون ، خاصة بالقرب من النهاية القمية ، أن بعض أنسجة SV تنفصل عن الجدار الجانبي طوال فترة التشريح.
  12. انزع طبقة SV برفق لفصلها عن الجدار الجانبي في نهايتها القاعدية (الشكل 2H). ادفع برفق SV المنفصل جانبا وحرك الملقط أكثر نحو الطرف القمي للجدار الجانبي ، وافصل SV كشريط طويل إن أمكن (الشكل 2I). لا تضغط على SV بالملقط لسحبه. إذا كان النسيج هشا جدا بحيث لا يمكن الإمساك به ، فيمكن بدلا من ذلك جمعه باستخدام مغرفة مناديل ، مثل مكشطة البردة.
    ملاحظة: يجب أن يتم تحريك SV دائما تحت المجهر الضوئي لضمان عدم فقده. كن حذرا دائما عند الاستيلاء باستخدام الملقط بسبب خطر التلف. قد يجد المستخدمون أن استخدام كشط البردة يخفف من خطر تلف أنسجة SV. لتسلسل النواة المفردة ، انتقل إلى القسم 5. بالنسبة للتلوين المناعي SV ، انتقل إلى القسم 7.

5. تعليق SV أحادي النواة

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول لأنسجة SV على وجه التحديد من بروتوكول تعليق أحادي النواة للشركة المصنعة المنشورة. يمكن استخدام منصات من مختلف الصانعين31. نظرا للاختلاف الخاص بالنظام الأساسي ، يوصى بمراجعة البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة المقدم مع الجهاز. لتحقيق أفضل النتائج ل sNuc-Seq وتقليل تدهور الحمض النووي الريبي ، كلما كان تشريح الأنسجة أسرع كان ذلك أفضل (يوصى به في غضون 15-20 دقيقة من القتل الرحيم). قد يكون من المفيد القتل الرحيم لحيوان واحد في كل مرة وفقط عندما يكون جاهزا للتشريح. يمكن أن يؤدي وجود عدة أشخاص يعملون في وقت واحد على التشريح أيضا إلى القضاء على وقت التدهور (على سبيل المثال ، يعمل أحد موظفي المختبر على الأذن اليسرى بينما يعمل آخر على الأذن اليمنى).

  1. إذا تم استخدام أنسجة SV ل sNuc-Seq ، فضع الأنسجة في محلول تحلل مبرد (10 mM Tris-HCl ، 10 mM NaCl ، 3 mM MgCl2 ، 0.005٪ nonidet P40 في الماء الخالي من النيوكلياز).
    ملاحظة: إذا كان سيتم إجراء التسلسل مباشرة بعد التشريح ، فتابع البروتوكول. إذا كنت ترغب في إيقاف البروتوكول مؤقتا ، فيمكن الحفاظ على SV عن طريق وضع SV في RNAlater. يحفظ طوال الليل على حرارة 4 درجات مئوية ، ثم يوضع في الفلاش ويحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. عندما تكون جاهزا للاستخدام ، قم بإذابة الثلج وغسله مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما ، ثم تابع التجانس (الخطوة 5.2).
  2. تجانس الأنسجة في الخالط dounce 2 مل مع 10-20 السكتات الدماغية على الجليد.
    ملاحظة: ستتصل الأسطوانة الزجاجية يدويا بالجزء السفلي من الأنبوب الزجاجي ، مما يؤدي إلى تفتيت SV. SV حساس ، لذلك عادة ما تحقق 20 ضربة تجانسا ناجحا.
  3. تحلل المنديل على الثلج لمدة 25 دقيقة.
    ملاحظة: يختلف وقت التحلل وفقا لنوع الأنسجة. قد يحقق التحلل لمدة 25 دقيقة في أنسجة SV قابلية منخفضة للخلية (أقل من 4٪) ، ولكن قد يتم تكييف الوقت إذا كانت صلاحية الخلية عالية جدا (الخطوة 5.8).
  4. قم بالتصفية من خلال مرشح 30 ميكرومتر وقم بتدوير المرشح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول غسل النوى وإعادة التعليق (1x PBS ، 1٪ ألبومين مصل بقري [BSA] ، مثبط RNase 0.2U / μL).
  6. قم بتصفية الخلايا من خلال مرشح 10 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقها في 50 ميكرولتر من النوى والغسيل وإعادة التعليق العازلة.
  8. عد النوى باستخدام عداد الخلية وتلطيخ التريبان الأزرق. تمييع 5 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 50 ميكرولتر من 1x PBS لعد الخلايا ؛ يجب أن تكون الجدوى ضئيلة (3٪ -4٪) في هذه المرحلة. إذا تبين أن الصلاحية أعلى ، فقم بتكييف البروتوكول للخطوة 5.3 (التحلل) وتوحيد وقت التحلل لضمان التحلل الكافي للخلايا.
    ملاحظة: تعني قابلية بقاء الخلية العالية في تحضير نواة واحدة أن هناك خلايا سليمة أكثر من المطلوب ، وقد تكون هناك حاجة إلى هضم إضافي.
  9. قم بتحميل العينة بالكثافة النووية المطلوبة على جهاز / شريحة الشركة المصنعة (انظر دليل الشركات المصنعة). الالتقاط أحادي النوى جاهز الآن.
    ملاحظة: من فأر بالغ واحد SV ، عادة ما يتم تحقيق 50 ميكرولتر من المعلق بتركيز 150000 نواة / مل.

6. تسلسل SV أحادي النواة

  1. إرسال العينات إلى المرفق الأساسي للتسلسل.
    ملاحظة: يتبع هذا الجزء من البروتوكول الخطوات العامة ل (1) توليد مستحلب الخرز الهلامي (GEM) والترميز الشريطي ، (2) تنظيف ما بعد GEM-RT وتضخيم cDNA ، و (3) 3 'بناء مكتبة التعبير الجيني. ما تبقى من بروتوكول sNuc-Seq طويل نسبيا ، ويوصى بأن يستخدم القراء بروتوكولهم الخاص بالشركة المصنعة. من المحتمل أن يصف دليل الشركة المصنعة الخطوات بتفاصيل محددة وصور مصاحبة. قد تكون هناك أيضا مقاطع فيديو "إرشادية" على موقع الشركة المصنعة. يمكن تمثيل مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها بطريقة مخفضة الأبعاد ، مثل تقريب وإسقاط مشعب موحد (UMAP; الشكل 3). تستخدم العديد من المختبرات نواة تسلسل قد تؤدي هذا البروتوكول للمستخدمين.

7. SV المناعي وتركيب الأنسجة

  1. إذا تم استخدام الأنسجة للتلطيخ المناعي ، فقم بنقلها إلى صفيحة 24 بئرا ، مغمورة في 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 1x PBS ، واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: من المفيد إجراء جميع عمليات إزالة السوائل والغسيل والبقع المناعية تحت المجهر. سيضمن التصور أثناء سحب الأنسجة عدم فقدانها عن طريق الخطأ أثناء إزالة السائل. يمكن تعديل أحجام الأجسام المضادة والغسالات طالما أن الحجم كبير بما يكفي لغمر أنسجة SV داخل المحلول.
  2. بعد خطوة التثبيت ، قم بإزالة PFA عن طريق إجراء غسلتين قصيرتين في 1x PBS (حوالي 500 ميكرولتر) عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لكل منهما على شاكر مداري عند عدد دورات منخفض (30-50) دورة في الدقيقة. في حالة التخزين ، يمكن تخزين الأنسجة في 1x PBS عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بإزالة PBS وتخلل وحجب لمدة لا تقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في حوالي 300 ميكرولتر من محلول PBS-T (0.05 Tween20 في 1x PBS مع 10٪ مصل بقري جنيني).
    ملاحظة: يجب تخفيف الأجسام المضادة الأولية والثانوية في محلول الحجب هذا.
  4. تلطيخ الأنسجة بالأجسام المضادة الأولية وفقا لمواصفات الجسم المضاد المستخدم ، عادة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة PBS المتبقي وإضافة الجسم المضاد الأساسي المخفف.
    ملاحظة: يجب اختيار التخفيف بناء على اقتراحات الشركة المصنعة والبيانات المنشورة والخبرة السابقة وما إلى ذلك. عادة ما يكون التركيز الأول للاختبار هو تخفيف 1: 100-200. بالنسبة للمثال المقدم في هذه الورقة ، تم تخفيف كل من الأجسام المضادة GS-IB4 و DAPI عند 1: 200. في حالة تلطيخ أكثر من بروتين واحد، يمكن دمج أجسام مضادة أولية متعددة في المحلول نفسه، طالما أن كل جسم مضاد أولي له مضيف مختلف لتجنب التفاعل المتبادل للأجسام المضادة الثانوية.
  5. اغسل الجسم المضاد الأساسي من الأنسجة باستخدام ما يقرب من 500 ميكرولتر من 1x PBS مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما على شاكر مداري عند عدد دورات منخفض في الدقيقة.
    ملاحظة: استمر في التأكد من أن أنسجة SV مغمورة في المحلول ، وليست عالقة على جانب البئر.
  6. بقعة مع الجسم المضاد الثانوي وفقا لمواصفات الجسم المضاد المعين المستخدم ، عادة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري عند عدد دورات منخفضة في الدقيقة. قم بتغطية اللوحة المكونة من 24 بئرا بحيث يكون الجسم المضاد الثانوي الموسوم بالفلورسنت محميا من الضوء.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى أكثر من جسم مضاد ثانوي واحد ، فقم بدمج الأجسام المضادة الثانوية في نفس المحلول. تأكد من تجنب وضع العلامات المتقاطعة.
  7. اغسل الجسم المضاد الثانوي من الأنسجة باستخدام ما يقرب من 500 ميكرولتر من 1x PBS أربع مرات لمدة 5 دقائق لكل منها على شاكر مداري عند عدد دورات منخفض في الدقيقة. حافظ على اللوحة المكونة من 24 بئرا مغطاة لحمايتها من الضوء.
  8. قم بإعداد الشريحة الصغيرة الأكبر (75 مم × 25 مم) عن طريق وضع خطين صغيرين من الغراء على طول المحور 25 مم ، أصغر بقليل من غطاء زجاجي أصغر 18 مم × 18 مم. ضع قطرة واحدة من كاشف التركيب (حوالي 50 ميكرولتر) بين خطوط الغراء.
    ملاحظة: يخلق الغراء مساحة صغيرة من المساحة الرأسية بحيث عند وضع الغطاء الثاني في الأعلى ، يمكن أن توجد عينة أنسجة SV بأمان ، ولكنها تستمر في البقاء في مكانها. في حين أن سمك السطور هو 30-40 ميكرون ، يجب تجنب الضغط على الأنسجة بين الأسطح الزجاجية للحفاظ على التشكل. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام شريط شفاف.
  9. باستخدام ملقط # 55 ، أمسك بأقل قدر ممكن من الأنسجة على أحد طرفي SV وانقله من PBS إلى قطرة كاشف التركيب على الشريحة الصغيرة الأكبر (75 مم × 25 مم). ضع أحد طرفي غطاء زجاجي أصغر (18 مم × 18 مم) على الشريحة حيث تم وضع خط واحد من الغراء وحرره برفق لتجنب تكوين فقاعات هواء. سوف يسقط غطاء الغطاء على خط الغراء الآخر وسيغطي نسيج SV.
  10. أغلق الحامل عن طريق وضع قطرة من طلاء الأظافر الشفاف على كل ركن من أركان الحامل. قم بتسمية العينة وفقا لذلك على الغطاء الزجاجي بعيدا عن حقل التصور. إنه جاهز الآن للفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 4).
  11. تصور أنسجة SV باستخدام مجهر تشريح للتأكد من أنها مسطحة وليست بالقرب من أي فقاعات هواء. إذا لم يتم توجيه نسيج SV بشكل صحيح ، يمكن للمستخدم محاولة دفع فقاعات الهواء أو إزالة الغطاء الزجاجي الأصغر بعناية وإعادة وضع SV. يجب أن يتم ذلك برفق لتجنب كسر أغطية الزجاج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نقدم طريقة لعزل SV لاستخدامها إما في sNuc-Seq أو تلطيخ المناعة. يمكن أن يساعد التشريح ذي الصلة (الشكل 1) للقوقعة بالنسبة إلى SV المستخدمين على فهم تنظيم SV وخطوات بروتوكول التشريح بشكل أفضل.

يتم تفصيل كل خطوة من خطوات هذا التشريح الدقيق ل SV من ماوس P30 في الفيديو المرتبط ، ويتم عرض لقطات من الخطوات الرئيسية لهذا التشريح وعزل SV في الشكل 2.

sNuc-Seq مفيد في التحقيق في ملف النسخ للخلايا المختلفة في SV غير ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

قبل ظهور تسلسل الخلية الواحدة ، استخدم العديد من الباحثين تحليل الأنسجة السائبة ، مما جعل من الممكن فقط تحليل النسخ المتوسط عبر الخلايا. على وجه الخصوص ، جعلت الخلية المفردة و sNuc-Seq من الممكن عزل نسخة خلية واحدة أو نواة واحدة ، على التوالي32. في هذه الحالة ، يمكن تحديد النسخ أحادي النواة للخلايا الهامشية والمتوسطة والقاعدية ، وكذلك خلايا المغزل30. يتيح ذلك التحقيق في عدم تجانس النسخ بين أنواع خلايا SV ويمكن استخدامه في المستقبل للتحقيق في مساهمة هذه الأنواع من الخلايا في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، NIDCD إلى M.H. (DC000088)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10-& مرشح م (Polyethylenterephthalat)PluriSelect# 43-50010-01تصفية الأنسجة أثناء sNuc-Seq
18 × 18 مم غطاء زجاجيفيشر Scientific12-541Aغطاء الانزلاق لتركيب SV
30-& micro ؛ مرشح m (Polyethylenterephthalat)PluriSelect# 43-50030-03تصفية الأنسجة أثناء sNuc-Seq
75 × 25 مم Superfrost Plus / Colorforst Plus MicroslideDaiggerEF15978ZMicroslide لتركيب SV على
الفئران C57BL / 6Jمختبر جاكسونRRID: IMSR_JAX:000664سلالة الماوس للأغراض العامة التي تحتوي على صبغة يمكن رؤيتها بسهولة أكبر في الخلايا الوسيطة ل SV.
عداد الخلاياBiosystemsL20001تستخدم لعد الخلايا
كشط Chalizon 5 '' ، مقاس 3 2.5 ممأدوات البحث الطبية الحيوية15-1020تستخدم لنقل SV
Chromium Next GEM خلية واحدة 3 'GEM Kit v3.1ChromiumPN-1000141يولد خلية واحدة 3 'مكتبات التعبير الجيني
الأظافر الشفاففيشر العلميNC1849418تستخدم لختم
أطباق ثقافة الأنسجة القياسية من كورنينج فالكون ، طبق ثقافة 24 بئر Corning08-772Bيستخدم لحمل العينة أثناء التشريح
DAPIInvitrogenD1306 ، RRID: AB_2629482وصمة عار تستخدم لوضع العلامات على النواة
الخالطDounce Sigma-AldrichD8938تستخدم لتجانس الأنسجة من أجل ملقط
sNuc-seq Dumont # 5أدوات العلوم الدقيقة11252-30ملقط عام للتشريح
Dumont # 55 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11255-20ملقط بطرف رفيع يجعل التلاعب ب SV أسهل
مصل الأبقارالجنيني ThermoFisher16000044 يستخدم لخطوات عصا الغراء sNuc-Seq
Fisher ScientificNC0691392يستخدم لتركيب
الأجسام المضادة الجزيئية SV GS-IB4 مجساتI21411 ، RRID: AB-2314662الجسم المضاد المستخدم في وضع العلامات الشعرية
KCNJ10-ZsGreen Micen / an / aفأر معدل وراثيا يعبر عن KCNJ10-ZsGreen ، جزئيا في الخلايا الوسيطة ل SV.
يستخدمAM9530G MgCl2ThermoFishersNuc-Seq
ThermoFisher#S36940كاشف التركيب للوحة SV
Multiwell 24 بئرCorning# 353047لوحة تستخدم لتلطيخ المناعة
NaClThermoFisherAAJ216183تستخدم لخطوات sNuc-Seq
Nonidet P40Sigma-Aldrich9-16-45-9تستخدم لخطوات sNuc-Seq
ماء خال من النوكليزThermoFisher4387936يستخدم لخطوات sNuc-Seq
Orbital shakerSilent ShakeSYC-2102Aيستخدم لخطوات التلوين
المناعي PBSThermoFisherJ61196. APتستخدم لخطوات التلوين المناعي وتشريح
الحمض النووي الريبي لاحقاInvitrogenAM7021يستخدم للحفاظ على SV ل sNuc-Seq
Scizzorsأدوات العلوم الدقيقة14058-09تستخدم لتقسيم جمجمة الفأر
Tris-HClSigma-Aldrich15506017تستخدم لخطوات sNuc-Seq
Trypan Blue stainGibco15250061تستخدم في عد الخلايا
Tween20ThermoFisherAAJ20605AP تستخدم لخطوات sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo مجهر مجهر مجهرZeissn / aمجهر يستخدم للتشريح
شعارات طلاء لخطوات كاشف تركيب

المراجع

  1. Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
  2. Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
  3. Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
  4. Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
  5. Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
  6. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
  7. Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239(2017).
  8. Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
  9. Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
  10. Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
  11. Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
  12. Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682(2023).
  13. Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119(2022).
  14. Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
  15. Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
  16. Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
  17. Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
  18. Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100(2020).
  19. Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
  20. Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
  21. Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
  22. Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30(2004).
  23. Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
  24. Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
  25. Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. Tissue-resident macrophages in the stria vascularis. Frontiers in Neurology. 13, 818395(2022).
  26. Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285(2021).
  27. Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
  28. Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561(2021).
  29. Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
  30. Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316(2019).
  31. Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
  32. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  33. Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175(2019).
  34. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).
  35. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  36. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
  37. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  38. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تشريح الأوعية الدموية للفأر البالغ من أجل تسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.