السطور الوعائية أمر حيوي لتوليد إمكانات القوقعة الداخلية. هنا ، نقدم تشريح الأوعية الدموية للفأر البالغ لتسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح الأوعية الدموية للفأر البالغ من أجل تسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد إمكانات Endocochlear ، التي يتم إنشاؤها بواسطة السطور الوعائية ، ضرورية للحفاظ على بيئة مواتية للنقل الميكانيكي المناسب لخلايا الشعر والسمع في نهاية المطاف. يمكن أن تؤدي أمراض الأوعية الدموية السطورية إلى انخفاض السمع. يسمح تشريح الأوعية الدموية للخطوط البالغة بالتقاط نواة واحدة مركزة وتسلسل النواة المفردة اللاحقة والبقع المناعية. تستخدم هذه التقنيات لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للأوعية الدموية السعيرة على مستوى الخلية الواحدة.
يمكن استخدام تسلسل النواة المفردة في إعداد التحليل النسخي للأوعية الدموية السطورية. وفي الوقت نفسه، لا يزال التلوين المناعي مفيدا في تحديد مجموعات معينة من الخلايا. تتطلب كلتا الطريقتين تشريح الأوعية الدموية المناسب كشرط أساسي ، والذي يمكن أن يكون تحديا تقنيا.
المقدمة
تتكون القوقعة من ثلاث غرف مملوءة بالسوائل ، سكالا الدهليز ، سكالا ميديا ، وسكالا تيمباني . يحتوي كل من سكالا الدهليزي وسكالا تيمباني على perilymph ، الذي يحتوي على تركيز عال من الصوديوم (138 mM) وتركيز منخفض من البوتاسيوم (6.8 mM) 1. تحتوي وسائط سكالا على اللمف الداخلي ، الذي يحتوي على تركيز عال من البوتاسيوم (154 مللي مول) وتركيز منخفض من الصوديوم (0.91 مللي مول) 1،2،3. يمكن الإشارة إلى هذا الاختلاف في تركيز الأيونات باسم جهد القوقعة الداخلية (EP) ، ويتولد بشكل أساسي عن طريق حركة أيونات البوتاسيوم عبر قنوات أيونية مختلفة وتقاطعات الفجوة في الأوعية الد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع التجارب والإجراءات على الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى ، المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى ، المعاهد الوطنية للصحة. تم تنفيذ جميع الطرق وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة للجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى ، المعاهد الوطنية للصحة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نقدم طريقة لعزل SV لاستخدامها إما في sNuc-Seq أو تلطيخ المناعة. يمكن أن يساعد التشريح ذي الصلة (الشكل 1) للقوقعة بالنسبة إلى SV المستخدمين على فهم تنظيم SV وخطوات بروتوكول التشريح بشكل أفضل.
يتم تفصيل كل خطوة من خطوات هذا التشريح الدقيق ل SV من ماوس P30 في الفيديو المرتبط ، ويتم عرض لقطات من الخطوات الرئيسية لهذا التشريح وعزل SV في الشكل 2.
sNuc-Seq مفيد في التحقيق في ملف النسخ للخلايا المختلفة في SV غير ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قبل ظهور تسلسل الخلية الواحدة ، استخدم العديد من الباحثين تحليل الأنسجة السائبة ، مما جعل من الممكن فقط تحليل النسخ المتوسط عبر الخلايا. على وجه الخصوص ، جعلت الخلية المفردة و sNuc-Seq من الممكن عزل نسخة خلية واحدة أو نواة واحدة ، على التوالي32. في هذه الحالة ، يمكن تحديد النسخ أحادي النواة للخلايا الهامشية والمتوسطة والقاعدية ، وكذلك خلايا المغزل30. يتيح ذلك التحقيق في عدم تجانس النسخ بين أنواع خلايا SV ويمكن استخدامه في المستقبل للتحقيق في مساهمة هذه الأنواع من الخلايا في.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، NIDCD إلى M.H. (DC000088)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10-& مرشح م (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | # 43-50010-01 | تصفية الأنسجة أثناء sNuc-Seq |
| 18 × 18 مم غطاء زجاجي | فيشر Scientific | 12-541A | غطاء الانزلاق لتركيب SV |
| 30-& micro ؛ مرشح m (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | # 43-50030-03 | تصفية الأنسجة أثناء sNuc-Seq |
| 75 × 25 مم Superfrost Plus / Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide لتركيب SV على |
| الفئران C57BL / 6J | مختبر جاكسون | RRID: IMSR_JAX:000664 | سلالة الماوس للأغراض العامة التي تحتوي على صبغة يمكن رؤيتها بسهولة أكبر في الخلايا الوسيطة ل SV. |
| عداد الخلايا | Biosystems | L20001 | تستخدم لعد الخلايا |
| كشط Chalizon 5 '' ، مقاس 3 2.5 مم | أدوات البحث الطبية الحيوية | 15-1020 | تستخدم لنقل SV |
| Chromium Next GEM خلية واحدة 3 'GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | يولد خلية واحدة 3 'مكتبات التعبير الجيني |
| الأظافر الشفاف | فيشر العلمي | NC1849418 | تستخدم لختم |
| أطباق ثقافة الأنسجة القياسية من كورنينج فالكون ، طبق ثقافة 24 بئر Corning | 08-772B | يستخدم لحمل العينة أثناء التشريح | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 ، RRID: AB_2629482 | وصمة عار تستخدم لوضع العلامات على النواة |
| الخالط | Dounce Sigma-Aldrich | D8938 | تستخدم لتجانس الأنسجة من أجل ملقط |
| sNuc-seq Dumont # 5أدوات العلوم الدقيقة | 11252-30 | ملقط عام للتشريح | |
| Dumont # 55 ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11255-20 | ملقط بطرف رفيع يجعل التلاعب ب SV أسهل |
| مصل الأبقار | الجنيني ThermoFisher | 16000044 يستخدم لخطوات عصا الغراء sNuc-Seq | |
| Fisher Scientific | NC0691392 | يستخدم لتركيب | |
| الأجسام المضادة الجزيئية SV GS-IB4 | مجسات | I21411 ، RRID: AB-2314662 | الجسم المضاد المستخدم في وضع العلامات الشعرية |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n / a | n / a | فأر معدل وراثيا يعبر عن KCNJ10-ZsGreen ، جزئيا في الخلايا الوسيطة ل SV. |
| يستخدم | AM9530G MgCl2 | ThermoFisher | sNuc-Seq |
| ThermoFisher | #S36940 | كاشف التركيب للوحة SV | |
| Multiwell 24 بئر | Corning | # 353047 | لوحة تستخدم لتلطيخ المناعة |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | تستخدم لخطوات sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | تستخدم لخطوات sNuc-Seq |
| ماء خال من النوكليز | ThermoFisher | 4387936 | يستخدم لخطوات sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | يستخدم لخطوات التلوين |
| المناعي PBS | ThermoFisher | J61196. AP | تستخدم لخطوات التلوين المناعي وتشريح |
| الحمض النووي الريبي لاحقا | Invitrogen | AM7021 | يستخدم للحفاظ على SV ل sNuc-Seq |
| Scizzors | أدوات العلوم الدقيقة | 14058-09 | تستخدم لتقسيم جمجمة الفأر |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | تستخدم لخطوات sNuc-Seq |
| Trypan Blue stain | Gibco | 15250061 | تستخدم في عد الخلايا |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | تستخدم لخطوات sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo مجهر مجهر مجهر | Zeiss | n / a | مجهر يستخدم للتشريح |
المراجع
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
