مقالة منهجية

نظام الجزر الزائفة البشرية للتقييم المتزامن لديناميات الاستشعار الحيوي الفلوري وملامح إفراز الهرمونات

DOI:

10.3791/65259

⸱

نوفمبر 3, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 2Division of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 4VA Tennessee Valley Healthcare System

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة للاكتساب المتزامن والتسجيل المشترك لأحداث الإشارات داخل الخلايا وإفراز الأنسولين والجلوكاجون بواسطة الجزر الكاذبة البشرية الأولية باستخدام توصيل الفيروس الغدي لمستشعر حيوي دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (cAMP) ، وكاشف فرق cAMP في الموقع (cADDis) ، ونظام microperifusion.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جزر البنكرياس في لانجرهانز ، وهي مجموعات 3D صغيرة من الغدد الصماء المتخصصة والخلايا الداعمة التي تتخللها البنكرياس ، لها دور مركزي في السيطرة على توازن الجلوكوز من خلال إفراز الأنسولين بواسطة خلايا بيتا ، مما يخفض نسبة الجلوكوز في الدم ، والجلوكاجون بواسطة خلايا ألفا ، مما يرفع نسبة الجلوكوز في الدم. تعد مسارات الإشارات داخل الخلايا ، بما في ذلك تلك التي تتوسطها cAMP ، أساسية لتنظيم إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا. هيكل جزيرة 3D ، في حين أنه ضروري لوظيفة الجزيرة المنسقة ، يقدم تحديات تجريبية للدراسات الميكانيكية لمسارات الإشارات داخل الخلايا في خلايا الجزيرة البشرية الأولية. للتغلب على هذه التحديات والقيود ، يصف هذا البروتوكول تصويرا متكاملا للخلايا الحية ومنصة الموائع الدقيقة باستخدام الجزر الكاذبة البشرية الأولية المتولدة من متبرعين غير مصابين بداء السكري تشبه الجزر الأصلية في مورفولوجيتها وتكوينها ووظيفتها. يتم التحكم في حجم هذه الجزر الكاذبة من خلال عملية التشتت وإعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية الأولية. في الحالة المشتتة ، يمكن التلاعب بالتعبير الجيني لخلية الجزيرة. على سبيل المثال ، يمكن إدخال أجهزة الاستشعار الحيوية مثل المستشعر الحيوي cAMP المشفر وراثيا ، cADDis. بمجرد تشكيلها ، تسمح الجزر الكاذبة التي تعبر عن مستشعر حيوي مشفر وراثيا ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر ومنصة microperifusion ، بالتقييم المتزامن لديناميكيات المستشعر الحيوي الفلوري وملامح إفراز هرمون خلايا ألفا وبيتا لتوفير مزيد من التبصر في العمليات الخلوية والوظيفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جزر لانجرهانز أعضاء صغيرة منتشرة في جميع أنحاء البنكرياس، ووظيفتها حاسمة للحفاظ على توازن الجلوكوز. يفرز الأنسولين من خلايا بيتا بعد استقلاب الجلوكوز ، وزيادة نسبة ATP / ADP ، وإغلاق قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP ، وإزالة استقطاب غشاء البلازما ، وتدفق الكالسيوم خارج الخلية1. إفراز الجلوكاجون من خلايا ألفا أقل فهما ، ولكن تم افتراض أن المسارات داخل الخلايا و paracrine تساهم في زيادة عدد الخلايا الحبيبيةللجلوكاجون 2،3،4. يرتبط كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 بخلل الخلايا الجزيرية5،6،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على الجزر البشرية (N = 4 مستحضرات) من خلال شراكات مع برنامج توزيع الجزر المتكامل ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري ، ومختبرات Prodo ، Inc. ، و Imagine Pharma. لا يعتبر مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة فاندربيلت عينات البنكرياس البشرية غير المحددة كأبحاث بشرية. لن يكون هذا العمل ممكنا بدون المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم ومنظمات شراء الأعضاء. انظر الجدول 1 للاطلاع على المعلومات الديمغرافية للمانحين. تم عزل الجزر البشرية من المتبرعين بالبنكرياس غير المصابين بداء السكري بأقل من 15 ساعة من وقت نقص التروية الباردة.

1. تشكيل جزيرة زائفة (مفصلة في Walker et al.7)

    <....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء الجزر الكاذبة البشرية المعبرة عن أجهزة الاستشعار الحيوية عن طريق توصيل الفيروسات الغدية للتركيبات التي تشفر cAMP biosensor cADDis (الشكل 1 أ). يوضح الشكل 1B إعادة تجميع الخلايا الجزيرية البشرية المتحولة بمرور الوقت ، مع ملاحظة الجزر الكاذبة كاملة التكوين بعد 6 أيام من الثقافة. بدأت الخلايا في إظهار مضان cADDis مرئي في غضون 48 ساعة ، وكان هناك تعبير عالي للمستشعر الحيوي في الخلايا المنقولة بحلول نهاية فترة الاستزراع. باستخدام هذا البروتوكول ، أظ.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح دمج نظام microperifusion ، والجزر الكاذبة التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية ، والفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر بالتقييم المتزامن لأحداث الإشارات داخل الخلايا وملامح إفراز الهرمونات الديناميكية. يمكن لنظام microperifusion الديناميكي تقديم سلسلة من المحفزات المحددة جيدا إلى الجزر الكاذبة ويسمح بجمع النفايات السائلة ، حيث يمكن قياس تركيزات الأنسولين والجلوكاجون بواسطة ELISA المتاح تجاريا. في الوقت نفسه ، يلتقط تصوير الخلايا الحية للجزر الكاذبة التي تعبر عن المستشعر الحيوي بواسطة منصة مجهرية متحدة البؤر نشاط .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقدير المتبرعين بالأعضاء وعائلاتهم لتبرعاتهم التي لا تقدر بثمن ، ويتم الاعتراف بالمعهد الدولي لمنظمات شراء الأعضاء ، وتقدم الطب (IIAM) والتبادل الوطني لأبحاث الأمراض (NDRI) لشراكتهم في جعل أنسجة البنكرياس البشرية متاحة للبحث. تم دعم هذا العمل من قبل شبكة أبحاث الجزر البشرية (RRID: SCR_014393) ، وبرنامج تحليل البنكرياس البشري (RRID: SCR_016202) ، DK106755 ، DK123716 ، DK123743 ، DK120456 ، DK104211 ، DK108120 ، DK112232 ، DK117147 ، DK112217 ، EY032442 ، و DK20593 (مركز فاندربيلت لأبحاث وتدريب مرض السكري) ، صندوق ليونا إم وهاري بي هيلمسلي الخيري ، JDRF ، وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية (BX000666) ، NIGMS من المعاهد الوطنية للصحة (T32GM007347) ، F30DK134041 ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Ad-CMV-cADDisWelgenغير قابل للتطبيق
  0.01 بوصة أنابيب FEPIDEX1527L
1 M HEPESGibco15630-080مكون وسائط CMRL
المخصب 1.5 مل وأنابيب مخروطيةأيأي
10 مو ؛ m PTFE filterCole-ParmerSK-21940-41تغيير كل 8-10 تشغيل
100 ملي مولار بيروفات الصوديومالحرارية العلمية11360070المخصب CMRL الوسائط
مكون 190 دليل على مختبرات الإيثانولDecon 2816حمض الإيثانول المكون
200 ملي مولار GlutaMAX-I الملحقGibco35050061وسائط CMRL
المخصب AscorbateSigmaA5960DMEM Perifusion Buffer Component
Serum AlbuminSigmaA7888DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble Trap  Omnifit006BT
CellCarrier ULA  96-بئر MicroplatesPerkin Elmer6055330
cellSens برنامج تحليلOlympusv3.1البرمجيات المستخدمة لتحليل البيانات
CMRL 1066MediaTech 15-110-CVمكون الوسائط CMRL
المخروطي (IDEX ، P-794) IDEXP-794
D- (+) -GlucoseSigmaG7528مكون عازلة الجلوكوز
DMEM   ؛سيجماD5030DMEM مكون عازلة إنهار
الغرفة البيئيةokolabIX83
Epinepherine (Epi)SigmaE4250مكون عازلة
التحفيز مصل الأبقار الجنينية (FBS) ،سيجما12306Cمكون وسائط غني CMRL
غلوكاغون ELISAMercodia10-1281-01
مجموعة الجلوكاجون HTRFCisbio62CGLPEH
HCl (12N)أيمكون من الإيثانول الحمضي
HEPESSigmaH7523DMEM مكون عازلة إنجاة
iCell الخلايا البطانية المكملات المتوسطةديناميكيات الخليةM1019iEC مكون الوسائط
Idex Derlin الجوز والطويق 1 / 4-24Cole-ParmerEW-00414-LW
الأنسولين ELISAMercodia10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)SigmaI5879مكون التحفيز العازلة
المجهر متحد البؤر المسح بالليزرOlympusFV3000
L-GlutamineSigmaG8540DMEM رقاقة مكون عازلة للانصهار
(جامعة ميامي ، FP-3W)جامعة مياميحامل رقاقة FP-3W
 Micronit MicrofluidicsFC_PRO_CH4525
موديل 2110 Fraction CollectorBiorad7318122
P10 و P200 و P1000 ماصات ونصائحأيمضخة
تمعجية لمكون البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140-122المضخة التمعجية لمكون الوسائط CMRL المخصب
  ؛InstechP720
Fossil Buffered SalineGibco14190-144Wash Islets
Sarstedt أطباقSarstedtيعتمد على قطر
بيكربونات الصوديومSigmaS6014DMEM مكون عازلة
بيروفات الصوديومSigmaP2256& nbsp ؛ DMEM Perifion Buffer Component
StereoscopeOlympusSZX12
Steriflip Filter (0.22 & mu; م)MilliporeSCGP00525تصفية جميع المخازن المؤقتة مرتين
VascuLife VEGF مجموعة كاملةLifeLine Cell TechnologyLL-0003iEC Media Component
مكون Fibroin محول مخروطي الطبق متوسطة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
  2. Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alph....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

cAMP

مقالات ذات صلة