Method Article

تحليل الوراثة اللاجينية عبر الأجيال في C. elegans باستخدام مراسل الفلورسنت والترسيب المناعي للكروماتين (ChIP)

DOI:

10.3791/65285

⸱

May 5th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تداخل الحمض النووي الريبي ومقايسة ChIP لدراسة الوراثة اللاجينية للإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي وتعديلات الكروماتين المرتبطة به في C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح الوراثة اللاجينية عبر الأجيال (TEI) بنقل المعلومات عبر الخط الجرثومي دون تغيير تسلسل الجينوم ، من خلال عوامل مثل الحمض النووي الريبي غير المشفر وتعديلات الكروماتين. تعد ظاهرة وراثة تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans نموذجا فعالا للتحقيق في TEI يستفيد من دورة الحياة القصيرة لهذا الكائن النموذجي ، والتكاثر الذاتي ، والشفافية. في وراثة RNAi ، يؤدي تعرض ل RNAi إلى إسكات الجينات وتغيير توقيعات الكروماتين في الموقع المستهدف والتي تستمر لأجيال متعددة في غياب الزناد الأولي. يصف هذا البروتوكول تحليل وراثة الحمض النووي الريبي في C. elegans باستخدام مراسل بروتين الفلورسنت الأخضر النووي المعبر عنه بالخط الجرثومي (GFP). يبدأ إسكات المراسل عن طريق إطعام البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي المزدوج الذي يستهدف GFP. في كل جيل ، يتم تمرير للحفاظ على التطور المتزامن ، ويتم تحديد إسكات الجينات المراسل عن طريق الفحص المجهري. في أجيال مختارة ، يتم جمع السكان ومعالجتهم من أجل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) - تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) لقياس إثراء تعديل الهستون في موقع مراسل GFP. يمكن تعديل هذا البروتوكول لدراسة وراثة الحمض النووي الريبي بسهولة ودمجه مع تحليلات أخرى لمزيد من التحقيق في عوامل TEI في مسارات الحمض النووي الريبي والكروماتين الصغيرة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح الوراثة اللاجينية بنقل المعلومات التنظيمية الجينية عبر الأجيال ، وبالتالي يمكن أن تسمح للبيئة أو تجارب الوالدين بالتأثير على ذريتهم. في C. elegans ، يمكن توريث إسكات الجينات الجرثومية الذي بدأه الحمض النووي الريبي الخارجي المزدوج (dsRNA) لأجيال متعددة في ذرية غير معرضة للمحفز الأصلي1،2،3،4. هذه العملية ، التي تسمى وراثة تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، هي واحدة من العديد من ظواهر الإسكات اللاجينية ذات الصلة في C. elegans ، بما في ذلك الإسكات متعدد الأجيال الذي بدأه piRNA 2,5 ، والطفرة / RNAe (الإسكات اللاجيني الناجم عن الحمض النووي الريبي)6،7،8 ، والإسكات متعدد النسخ الذي بدأهالصفيف 9 ، والتي لها متطلبات متداخلة ولكنها متميزة لآلات تنظيم الحمض النووي الريبي والكروماتين الصغيرة . في C. elegans RNAi الخارجي ، تتم معالجة dsRNA إلى RNAs صغيرة متداخلة (siRNAs) تعمل في مركب مع بروتينات Argonaute الأولية للتعرف على mRNA المستهدف. يؤدي هذا الاستهداف إلى تضخيم siRNAs الثانوية التي ترتبط ب Argonautes الثانوية لإسكات mRNA المستهدفة من خلال مسارات الإسكات السيتوبلازمية والنووية. بالنسبة لأهداف RNAi المعبر عنها بالخط الجرثومي ، يستهدف Argonaute HRDE-1 الثانوي النووي وعوامل RNAi النووية الإضافية النسخ الوليدة ، مما يؤدي إلى قمع النسخ وتجنيد ميثيل ترانسفيراز هيستون لترسيب علامات الكروماتين القمعية ، بما في ذلك H3K9me310. يعزز Histone H3K9me3 إنشاء إسكات وراثي لجينات التحوير البروتينية الفلورية الخضراء المعبر عنها (GFP) عن طريق وراثة RNAi11,12.

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام جين محوري يعبر عن بروتين اندماج GFP-histone في الخط الجرثومي كمراسل لوراثة RNAi وفحص التغييرات في تعديلات الهستون في موضع التحوير الجيني المراسل باستخدام الترسيب المناعي للكروماتين وتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (ChIP-qPCR). يصف هذا البروتوكول نهج تغذية RNAi موحد قائم على الألواح لبدء إسكات المراسلين. كما يوفر جدولا زمنيا مفصلا لتمرير بين الأجيال عن طريق عزل الأجنة في الرحم عن البالغين الجاذبين عن طريق العلاج القلوي بهيبوكلوريت ("التبييض"). كما تم وصف الطرق والبيانات التمثيلية لرصد تواتر إسكات GFP في مجموعة فرعية من السكان بواسطة المجهر الفلوري وللهيستون H3K9me3 ChIP-qPCR. توفر مقايسات وراثة RNAi المستندة إلى المراسلين نظاما قابلا للتتبع للغاية لتشريح أدوار العوامل الوراثية والبيئية وظيفيا في التنظيم اللاجيني 13,14 ، وقد حددت الشاشات الجينية التي تستخدم مثل هؤلاء المراسلين كلا من الجينات المطلوبة ل 2,3,15 والجينات التي تنظمسلبا 16,17 مدة الوراثة اللاجينية عبر الأجيال.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم توفير جدول زمني للفحص في الشكل 1.

1. تحضير لوحات وسط نمو النيماتودا RNAi (RNAi-NGM)

  1. قم بإخراج E. coli HT115 (DE3) التي تحتوي إما على GFP أو ناقلات التحكم RNAi من مخزون الجلسرين على ألواح أجار Luria-Bertani (LB) المكملة ب 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين. احتضان البكتيريا طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  2. في اليوم التالي ، قم بإعداد ألواح RNAi-NGM (1.7٪ [w / v] أجار ، 0.3٪ [وزن / حجم] كلوريد الصوديوم ، 0.25٪ [وزن / حجم] ببتون ، 1 مللي مول CaCl2 ، 5 ميكروغرام / مل كوليسترول ، 25 مللي مول فوسفات البوتاسيوم العازلة [درجة الحموضة 6.0] ، 1 مللي مول MgSO4 ، 25 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين ، و 5 مللي متر إيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside [IPTG]) وفقا للبروتوكول القياسي18.
    1. لكل سلالة في الفحص ، قم بإعداد ما لا يقل عن ست لوحات RNAi-NGM مصنفة ب GFP RNAi (لوحان لكل من النسخ البيولوجية الثلاثة) ولوحين من RNAi-NGM مصنفين بالتحكم RNAi (نسخة بيولوجية واحدة).
    2. خيمة فضفاضة الألواح بورق احباط للحماية من الضوء واتركها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة حتى تجف.
  3. في نفس يوم صب لوحة RNAi-NGM ، قم بإعداد 4 مل من الثقافات السائلة لبكتيريا RNAi.
    1. في ظل ظروف معقمة ، يتم استكمال القسمة 4 مل من مرق LB مع 10 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين و 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين في أنابيب الاستزراع. اختر مستعمرات مفردة من ألواح أجار LB في كل أنبوب واحتضانها طوال الليل أثناء الاهتزاز لمدة 16 ساعة تقريبا عند 37 درجة مئوية.
  4. زرع بكتيريا RNAi على ألواح RNAi-NGM.
    1. بعد النمو بين عشية وضحاها ، قم بقياس الكثافة البصرية (OD600) للمزارع باستخدام تخفيف 1: 5 من البكتيريا مع مرق LB.
    2. تمييع بكتيريا RNAi إلى ODنسبي 600 من 2 باستخدام مرق LB المكمل ب 10 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين و 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين.
    3. في ظل ظروف معقمة، أضف 150 ميكرولتر من بكتيريا التحكم أو GFP RNAi على كل لوحة RNAi-NGM.
    4. خيمة الألواح بورق والسماح للبكتيريا بالنمو لمدة 24 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين ألواح RNAi-NGM غير المستخدمة مقلوبة لمدة تصل إلى 1 أسبوع عند 4 درجات مئوية في حاوية مغلقة في الظلام.

2. بدء فحص وراثة RNAi: تبييض وطلاء الأجنة لجيل P0

ملاحظة: قبل البدء في اختبار وراثة RNAi ، يجب الحفاظ على الديدان التي تحتوي على مراسل GFP mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 دون تجويع عند 21 درجة مئوية لمدة جيلين على الأقل.

  1. في 4 أيام (96 ساعة) قبل بدء مقايسة وراثة RNAi (الشكل 1) ، اختر ثلاثة أو أربعة بالغين جاذبين على كل لوحة NGM قياسية مقاس 35 مم مصنفة ببكتيريا OP50-1.
    ملاحظة: ثلاث لوحات NGM لكل سلالة كافية. بالنسبة للسلالات ذات الخصوبة المعرضة للخطر ، قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من أربعة لكل طبق.
  2. بعد 4 أيام ، تأكد من أن السكان البالغين قد بدأوا في وضع الأجنة على اللوحة. اغسل الديدان من الألواح إلى أنابيب سعة 1.5 مل باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 المكمل ب Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4 ، 42 mMNa 2HPO 4 ، 86 mM NaCl ، 1mM MgSO 4 ، 0.01٪ (v / v) TX-100). كرر الغسيل والمسبح في نفس الأنبوب.
  3. عزل الأجنة عن السكان عن طريق التبييض على النحو التالي.
    1. تحضير محلول التبييض مع التبييض (6 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم) و 10 N هيدروكسيد الصوديوم في نسبة حجم 1.5: 1. قم بإعداد كمية كافية بحيث يمكن استخدام 250 ميكرولتر لكل عينة.
    2. أجهزة الطرد المركزي أنابيب 1.5 مل مع الديدان في 1000 × غرام لمدة 1.5-2 دقيقة.
    3. نضح الطافع ، وترك 100 ميكرولتر دون إزعاج "بيليه" الدودة. بدلا من ذلك ، يمكن ترك الأنابيب لمدة 2 دقيقة تقريبا للسماح للديدان بالاستقرار قبل الشفط.
    4. أضف 650 ميكرولتر من ddH2O إلى كل أنبوب لتحقيق حجم نهائي يبلغ 750 ميكرولتر.
      ملاحظة: الخطوات التالية حساسة للوقت.
    5. أضف 250 ميكرولتر من محلول التبييض إلى كل أنبوب وابدأ مؤقتا.
    6. كل 1-2 دقيقة ، دوامة الأنابيب جيدا. بعد 5 دقائق ، تحقق من الديدان تحت المجسمة لمراقبة تدهور البالغين.
    7. استمر في الدوامة حتى تذوب الديدان تماما وتبقى الأجنة فقط. أجهزة الطرد المركزي على الفور الأنابيب في 1000 × غرام لمدة 1.5 دقيقة.
      ملاحظة: يكتمل التبييض بشكل عام في غضون 6-7 دقائق ، ولكن يجب مراقبته تحت مجسمة عند تكبير كاف لمراقبة الأجنة التي تم إطلاقها (40x). لا تترك الديدان في التبييض لفترة طويلة ، لأن هذا سوف يضر بالأجنة.
    8. بعد الطرد المركزي ، نضح الطاف واترك حوالي 50-100 ميكرولتر. أضف 1 مل من المخزن المؤقت M9 مع TX-100 للغسيل والخلط عن طريق الدوامة. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 1000 × غرام لمدة 1.5-2 دقيقة ويغسل مرتين أخريين على الأقل.
    9. نضح المادة الطافية من الغسيل النهائي واترك حوالي 100 ميكرولتر في الأنبوب. تخلط عن طريق دوامة. ماصة 2 ميكرولتر من كل أنبوب مرتين على شريحة زجاجية موسومة. عد الأجنة باستخدام عداد إحصاء لتقدير تركيز الأجنة لكل ميكرولتر.
      ملاحظة: يمكن استخدام الشرائح ذات الآبار المتجمدة المتعددة هنا لحساب النسخ المتماثلة لسلالات متعددة. يمكن غسل شرائح العد وإعادة استخدامها.
  4. لبدء نمو سكاني شبه متزامن ، امزج وماصة حجما يحتوي على 250 جنينا على كل لوحة RNAi-NGM. استخدم لوحين لكل نسخة مكررة. السماح للسائل لامتصاص.
  5. بالنسبة لجيل P0 المعالج ب RNAi ، احتضان عند 21 درجة مئوية لمدة 4 أيام (96 ساعة) (من الأجنة إلى مرحلة البلوغ). قد تختلف التوقيتات باختلاف النمط الجيني.

figure-protocol-1
الشكل 1: مخطط فحص وراثة RNAi. الجدول الزمني المقترح لإعداد لوحة RNAi-NGM وإعداد مقايسة وراثة RNAi. يتم اختيار البالغين الجاذبين في اليوم -4 على أطباق NGM المصنفة ب OP50-1. بعد 4 أيام ، يتم تبييض النسل البالغ ويتم طلاء الأجنة على ألواح RNAi-NGM. يتعرض جيل P0 ل RNAi لمدة 4 أيام عند 21 درجة مئوية. بمجرد وصول الديدان إلى مرحلة البلوغ ، يتم تمرير النسخ المتماثلة عن طريق التبييض وتسجيلها لتعبير GFP الجرثومي كل جيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تمرير وتسجيل كل جيل للتعبير عن الخط الجرثومي ل GFP

ملاحظة: لتسهيل التسجيل ، استخدم سجل الفينيل لإنشاء منصات الأغاروز ذات الحواف الخطية لمحاذاة الديدان. تم تكييف هذه الطريقة من ريفيرا جوميز وشفارزشتاين19.

  1. تحضير 1٪ (وزن / حجم) أغاروز عن طريق إذابة الأغاروز في ddH2O في قارورة صغيرة عن طريق التسخين في الميكروويف. يضاف شريط التحريك ويغطى بورق الألمنيوم. في حالة إعادة الصهر ، سخني الأغاروز على لوح تسخين عند 200 درجة مئوية مع التحريك. بمجرد الذوبان ، خففي الحرارة إلى 80 درجة مئوية.
  2. اغسل الديدان من ألواح NGM باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 مع TX-100 في أنبوب 1.5 مل. اغسل الأطباق مرتين لإزالة جميع البالغين الجاذبين. تحقق من اللوحات الموجودة أسفل المجسمة للتأكد من جمع بكفاءة.
  3. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 1000 × غرام لمدة 1.5-2 دقيقة أو السماح للديدان بالاستقرار لمدة 2 دقيقة. نضح الطافد واترك 100 ميكرولتر دون إزعاج "حبيبة" الدودة.
  4. تحضير منصات agarose لتركيب الديدان على النحو التالي.
    1. ضع قطرة من الأغاروز المذاب بنسبة 1٪ (وزن / حجم) على سجل الفينيل (الموصوف سابقا19) باستخدام ماصة باستور الزجاجية (مع قطع الطرف الضيق).
    2. قم بتوجيه شريحة زجاجية بحيث تكون الخطوط الموجودة على السجل إما أفقية أو رأسية وضع الشريحة بسرعة على قطرة الأغاروز. انتظر حوالي 30 ثانية قبل إزالة الشريحة الزجاجية من السجل.
      ملاحظة: في حالة تسجيل أنماط جينية متعددة ، قد يكون من المفيد عمل وسادة أغاروز أكبر على شريحة واحدة وتقطيعها إلى نصفين باستخدام شفرة.
  5. جبل الديدان على منصات أغاروز.
    1. تحت المجسمة ، أضف حوالي 5 ميكرولتر من 5 مللي متر ليفاميزول إلى وسادة الأغاروز. يجب أن يكون تخفيف ليفاميزول طازجا كل أسبوع.
    2. نفض الغبار برفق أنابيب الديدان لخلط ونقل 5-10 ميكرولتر من الديدان على وسادة الأغاروز. قم بتقدير عدد الديدان بالعين أثناء إضافتها بحيث يكون هناك ما يقرب من 40 دودة لكل نسخة مكررة.
    3. اصطف الديدان في صفوف باستخدام معول رمش لتسهيل التسجيل. أضف غطاء زجاجي.
      ملاحظة: يمكن أن تستمر الشرائح التي تحتوي على مثبتة بهذه الطريقة لعدة ساعات قبل أن تجف.
  6. اعزل الأجنة عن المتبقية باستخدام بروتوكول التبييض (راجع الخطوة 2.3) قبل تسجيل الشرائح. لوحة 250 جنين على ألواح NGM 35 مم بذر OP50-120. بمجرد امتصاص السائل ، اقلب الألواح وأعدها إلى حاضنة 21 درجة مئوية.
  7. استخدم مجسكوب الإزهار مع مجموعة مرشحات GFP. عد وسجل عدد الديدان الموجبة والسلبية GFP على الشرائح لكل نسخة متماثلة باستخدام عداد العد.
    ملاحظة: سيكون للديدان الإيجابية GFP تعبير نووي GFP في سلالتها الجرثومية والأجنة في الرحم. لن تتألق السلالات الجرثومية للديدان السالبة GFP ، ومع ذلك ، عندما يبدأ GFP في العودة إلى ON في الأجيال اللاحقة ، قد يكون التألق خافتا. قد يكون من المفيد تركيب سلالات دودة إضافية غير محورة وراثيا لحساب أي تألق ذاتي لوحظ.
  8. مرور السكان عن طريق التبييض ، كما هو موضح أعلاه ، كل 4 أيام تقريبا (96 ساعة) عند 21 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء المرور وفقا لجدول زمني متناوب لمدة 3 أيام / 4 أيام للراحة. لوحة إضافية ~ 50 أجنة للأجيال الأقصر تمر إذا بالتناوب ، حيث قد يكون هناك عائد أقل من الأجنة بعد 72 ساعة.
    ملاحظة: حافظ على اتساق وقت مرور جيل P0 في 4 أيام بعد طلاء الأجنة.

4. جمع ل ChIP

ملاحظة: يعتمد عدد وتوقيتها على السلالة ومرحلة النمو والخاتم وعدد أهداف الترسيب المناعي (IP). في المثال أدناه ، اجمع لثلاثة عناوين IP: H3K9me3 و histone H3 و IgG control. تم تكييف بروتوكول ChIP من Askjaer et al.21.

  1. قبل جمع عينات ChIP ، قم بتوسيع الجيل السابق من مقايسة وراثة RNAi بثلاث لوحات NGM إضافية (إلى أربع لوحات على الأقل لكل نسخة مكررة). تنمو لمدة 4 أيام عند 21 درجة مئوية.
  2. قم بتبييض البالغين الجاذبين لعزل الأجنة (راجع الخطوة 2.3).
  3. لكل سلالة ، ضع ما يقرب من 3500 جنين على 14 صفيحة (250 لكل طبق) وينمو لمدة 3 أيام عند 21 درجة مئوية إلى مرحلة الشباب.
  4. اغسل في أنابيب سعة 1.5 مل بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.01٪ (v / v) TX-100 (PBS / TX). أجهزة الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة. نضح وتجميع من سلالة واحدة في أنبوب واحد واغسلها ثلاث مرات أخرى مع ما لا يقل عن 1 مل من PBS / TX.
  5. نضح إلى 1000 ميكرولتر ، واقلب للخلط ، واحسب عدد في 3 ميكرولتر ثلاث مرات (راجع الخطوة 2.3.9).
  6. احسب تركيز وانقل حجما يتوافق مع 3000 إلى أنبوب جديد لربط الفورمالديهايد.
  7. تأكد من أن الحجم الإجمالي لا يقل عن 10 أضعاف حجم حبيبات الدودة.

5. الفورمالديهايد تشابك

تنبيه: اعمل مع الفورمالديهايد في غطاء دخان لمنع التعرض للبخار.

  1. أضف الفورمالديهايد (1.8٪ تركيز نهائي) إلى الأنبوب الذي يحتوي على الديدان. استدير في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 دقائق.
  2. تجميد على الفور في النيتروجين السائل. يمكن إيقاف التجربة مؤقتا في هذه الخطوة ويمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
  3. قم بإذابة العينة المتشابكة في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق وقم بتدويرها لمدة 16 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف 1.25 M من الجلايسين إلى تركيز نهائي يبلغ 125 مللي مول وقم بالتدوير لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: حتى شطف الخرزة المغناطيسية ، احتفظ بالعينات على الثلج أو عند 4 درجات مئوية واستخدم مخازن مثلجة.
  5. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 1000 × جم لمدة 3 دقائق. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS / TX في كل مرة. يغسل مرتين مع 1 مل من المخزن المؤقت لإعادة التعليق (150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 50 مللي متر HEPES-KOH [درجة الحموضة 7.5] ، 1 مللي متر حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك [EDTA] ، 0.01٪ TX-100 ، مثبط الأنزيم البروتيني [قرص واحد لكل 5 مل]).
  6. بعد الغسيل الأخير ، اترك ما يكفي من المخزن المؤقت للتأكد من أن الحجم الإجمالي لا يقل عن ثلاثة أضعاف حجم الحبيبات وبحد أدنى ~ 100 ميكرولتر.

6. سونيكيشن

ملاحظة: تعتمد معلمات Sonication على نوع وطراز الصوتنة والمرحلة الحيوانية. يجب تحسين المعلمات مثل حجم العينة وتركيزها ، وفترات التشغيل / الإيقاف ، وعدد الدورات ، وإعداد الطاقة تجريبيا. على سبيل المثال ، على مدار فترة زمنية من صوتنة ، رصد تحلل دودة باستخدام مقايسة البروتين وتحديد متى يصل التركيز إلى هضبة. بالإضافة إلى ذلك ، راقب عندما يكون متوسط حجم القص للحمض النووي الجينومي حوالي 200-1000 نقطة أساس عن طريق الرحلان الكهربائي للحمض النووي ، المنقى بعد انعكاس التشابك ، على هلام 1.5٪ من الأغاروز / تريس أسيتات EDTA (TAE).

  1. قياس حجم العينات من الخطوة السابقة. مزيج و aliquot 90-120 ميكرولتر إلى أنبوب صوتنة البوليسترين.
  2. أضف حجما متساويا من محلول إعادة التعليق الذي يحتوي على 2x منظفات (150 mM NaCl ، 50 mMM HEPES-KOH [درجة الحموضة 7.5] ، 1 mM EDTA ، 0.2٪ ديوكسي كولات الصوديوم ، 0.7٪ ساركوسيل).
  3. Sonicate في صوتنة حمام مائي عند 50٪ من الطاقة لمدة 7 دقائق (20 ثانية / 40 ثانية قبالة) عند 4 درجات مئوية. تخلط بلطف عن طريق الماصة. كرر صوتنة لمدة 7 دقائق إضافية.
  4. نقل المحللة صوتنة إلى أنبوب 1.5 مل. أضف 0.5 حجم من محلول إعادة التعليق بدون منظفات (150 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 50 مللي متر HEPES-KOH [درجة الحموضة 7.5] ، 1 مللي متر EDTA) (على سبيل المثال ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت إلى 200 ميكرولتر من العينة).
  5. أجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. الحفاظ على طاف المحللة ونقلها إلى أنبوب جديد.
  6. اختياريا ، قم بإجراء فحص البروتين لتحديد تركيزات كل محلل. قد تكون هذه الخطوة مفيدة لكميات العينات الكبيرة أو المقارنات بين المقايسات. ومع ذلك ، فإن توحيد عدد كما هو موضح أعلاه يعمل بشكل جيد مع كميات العينات الموصوفة هنا ، نظرا لوجود ارتباط أفضل مع محصول الكروماتين / الحمض النووي على النحو الذي يحدده qPCR.

7. الترسيب المناعي

ملاحظة: قم بقياس كمية الأجسام المضادة والخرز المغناطيسي إلى حجم وتركيز المحللة.

  1. قسم المادة الطافية المحللة إلى أربعة أجزاء: ثلاثة أحجام متساوية لكل IP و 10٪ من حجم IP واحد كمدخل (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر من IP # 1 ، 100 ميكرولتر من IP # 2 ، 100 ميكرولتر من IP # 3 ، 10 ميكرولتر من المدخلات). انقل محللة IP إلى أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر وقم بتخزين محلول الإدخال عند -20 درجة مئوية في أنبوب سعة 1.5 مل.
  2. أضف 0.5 ميكروغرام من الجسم المضاد ل H3K9me3 أو الجسم المضاد H3 المضاد للهيستون أو IgG إلى عينة IP المناسبة. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الدوران.
  3. في اليوم التالي ، قسمة 9 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المغلف بالبروتين G لكل IP إلى أنبوب واحد سعة 1.5 مل. اغسل الخرزات مرتين باستخدام 1 مل من FA-150 (150 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 50 مللي متر HEPES-KOH [درجة الحموضة 7.5] ، 1 مللي متر EDTA ، 1٪ TX-100 ، 0.1٪ ديوكسي كولات الصوديوم).
  4. أعد تعليق الخرزات المغناطيسية في المخزن المؤقت FA-150 إلى الحجم الأصلي المأخوذ من المخزون في الخطوة 7.3 أعلاه. أضف 7.5 ميكرولتر لكل IP. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع الدوران.

8. يغسل والشطف

ملاحظة: للتأكد من أن الخرزات المغناطيسية لا تجف ، أضف كل غسلة أو محلول شطف بسرعة بعد شفط الغسيل السابق.

  1. استخدم 0.2-1 مل من المحاليل العازلة التالية في كل مرة لغسل الخرز. اجمع الخرزات على حامل مغناطيسي لشفط الغسيل. احتضان كل غسلة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق مع الدوران. اتبع الترتيب على النحو التالي.
    1. يغسل مرتين مع FA-150.
    2. يغسل مرة واحدة باستخدام FA-1M (FA-150 مع 1 M كلوريد الصوديوم).
    3. يغسل مرة واحدة مع FA-0.5M (FA-150 مع 0.5 M كلوريد الصوديوم). نقل إلى أنبوب PCR جديد.
    4. يغسل مرة واحدة باستخدام TE-LiCl (250 مللي متر LiCl ، 10 مللي متر Tris-Cl [درجة الحموضة 8.0] ، 1 مللي متر EDTA ، 1٪ IGEPAL CA-630 ، 1٪ ديوكسي كولات الصوديوم).
    5. اغسل مرتين باستخدام TE+ (50 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 10 مللي متر Tris-Cl [درجة الحموضة 8.0] ، 1 مللي متر EDTA ، 0.005٪ IGEPAL CA-630).
      ملاحظة: استمر في معالجة العينات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.
  2. نضح آخر مخزن مؤقت للغسيل. أعد تعليق الحبيبات المغناطيسية ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لشطف ChIP (200 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي متر Tris-Cl [pH 8.0] ، 1 mM EDTA ، 1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS]) وانقلها إلى أنبوب 1.5 مل.
  3. ارفعه عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في خلاط حراري مع الخلط عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان كل دقيقة.
  4. جمع الخرز على حامل مغناطيسي ونقل طاف إلى أنبوب جديد.
  5. كرر الشطف مع 50 ميكرولتر أخرى من المخزن المؤقت لشطف ChIP. قم بتجميع المواد الطافية لما مجموعه 100 ميكرولتر. تابع عكس التشابك وشطف الحمض النووي ، كما هو مفصل أدناه.

9. التشابك العكسي وشطف الحمض النووي

  1. قم بإذابة عينة الإدخال المحللة. قم بتعبئة ما يصل إلى 100 ميكرولتر مع المخزن المؤقت لشطف ChIP.
  2. أضف 16.5 ميكروغرام من RNase A إلى كل عينة IP وإدخال. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. أضف 40 ميكروغرام من Proteinase K واحتضانها عند 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. ثم احتضان في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. قم بتبريد العينات إلى درجة حرارة الغرفة وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة عمود الدوران.

10. إعداد تفاعل qPCR وتشغيله

ملاحظة: يجب تعديل معلمات التمهيدي وإعداد التفاعل و thermocycler لتتناسب مع توصيات الشركة المصنعة لمزيج تفاعل qPCR المستخدم.

  1. قم بإعداد مجموعات تمهيدية تستهدف مراسل GFP RNAi ومناطق التحكم في التخصيب الإيجابي والسلبي H3K9me3. درجة حرارة انصهار التمهيدي هي 60 درجة مئوية. انظر جدول المواد للحصول على تسلسلات التمهيدي.
  2. بالنسبة للحمض النووي للإدخال ، قم بعمل أربعة تخفيفات تسلسلية رباعية (على سبيل المثال ، 1: 5 ، 1:20 ، 1:80 ، 1: 320).
    ملاحظة: يمكن استخدام الحمض النووي IP مباشرة أو مخفف (على سبيل المثال ، 1: 2 أو 1: 3) للسماح بمزيد من التفاعلات. يجب تحديد مدى ملاءمة التخفيف تجريبيا ، حيث قد يتأثر أداء qPCR.
  3. تنظيم جميع ردود الفعل المقابلة لمجموعة التمهيدي واحد على لوحة PCR واحدة. قم بإعداد تفاعلات تقنية مكررة لكل تخفيف لإدخال الحمض النووي وكل عينة IP DNA. يحتوي كل تفاعل 10 ميكرولتر على 1.5 ميكرولتر من المدخلات أو الحمض النووي IP (أو المخزن المؤقت للشطف كعنصر تحكم) ، والمزيج الرئيسي qPCR (تركيز نهائي واحد ×) ، والتمهيدي الأمامي ، والتمهيدي العكسي (التركيز النهائي 400 نانومتر لكل برايمر).
  4. على جهاز تدوير حراري في الوقت الفعلي ، قم بتشغيل البرنامج التالي: تمسخ أولي: 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ؛ التضخيم والكشف عن التألق: 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية مع قراءة اللوحة ؛ التمديد النهائي: 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ منحنى الذوبان: من 60 درجة مئوية إلى 90 درجة مئوية بزيادات 0.5 درجة مئوية ، 5 ثوان لكل خطوة.

11. تحديد كفاءة التضخيم والتحقق من خصوصية المنتج

  1. لكل مجموعة من تخفيفات الحمض النووي للإدخال ، ارسم نقاط البيانات الأربع باستخدام [log10 (1 / dilution)] على المحور x و [Input Cq] على المحور y. تحديد ميل خط الأنسب.
  2. احسب كفاءة التضخيم. يجب أن تعرض مجموعات التمهيدي المثالية باستمرار كفاءة 95٪ -100٪.
    figure-protocol-2
  3. تأكد من أن جميع التفاعلات لها قمة منحنى ذوبان حادة واحدة، وأن التفاعلات التي لها نفس المجموعة التمهيدية لها نفس درجة حرارة الانصهار. قد تشير القمم المتعددة أو درجات حرارة الانصهار المختلفة إلى تضخيم غير محدد.
  4. اختياريا ، قم بتشغيل التفاعلات على جل أغاروز / TAE قياسي بنسبة 2٪ في درجة حرارة الغرفة للتحقق من حجم نطاق المنتج.

12. حساب النسبة المئوية للمدخلات

  1. احسب عامل تخفيف الإدخال. نظرا لأنه تم حفظ 10٪ من حجم تحلل IP كمدخلات ، فإن عامل التخفيف للتخفيف 1: 5 من الحمض النووي للإدخال هو 50.
  2. تحديد عامل تخفيف IP. إذا لم يتم تخفيف الحمض النووي IP قبل qPCR ، فإن عامل التخفيف هو 1.
  3. احسب فرق Cq بين IP والإدخال المعدل لعوامل التخفيف.
    figure-protocol-3
  4. احسب النسبة المئوية للمدخلات.
    figure-protocol-4

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعرضت التي تحمل الخط الجرثومي المعبر عنه GFP-histone H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 مراسل (الشكل 2A) إلى GFP RNAi أو التحكم في RNAi عن طريق التغذية ، وتم تمريرها كما هو موضح في البروتوكول والشكل 1. تم تسجيل إشارة GFP النووية في الخط الجرثومي يدويا باستخدام مجهر تشريح مضان لعينة من السكان في كل جيل. كان إسكات جين التحوير مخترقا بالكامل في P0 و F1 التي تم تسجيلها والتي عولجت ب GFP RNAi (الشكل 2B). في جيل F2 ، كانت نسبة السكان الذين يظهرون ميراث إسكات GFP حوالي 50٪. بحلول جيل F5 ، لم تظهر غالبية السكان وراثة الإسكات ، وبحلول جيل F10 ، لم يتم اكتشاف أي ميراث ، حيث عبرت جميع عن GFP.

لتحديد التغير في تخصيب هيستون H3K9me3 المقابل للإسكات الناجم عن RNAi ، تم إجراء ChIP-qPCR على الجيل F1 بعد إما GFP RNAi أو التحكم في علاج RNAi. كما هو متوقع ، أظهر السكان المعالجون ب GFP RNAi مستويات هيستون H3K9me3 أعلى عند هدف GFP وفي منطقة المصب 1.3 كيلو بايت مقارنة بالحيوانات المعالجة ب RNAi (الشكل 2C). يتم دعم خصوصية هيستون H3K9me3 ChIP من خلال التخصيب في موضع التحكم الإيجابي (clec-18) المعروف أنه غني في هذه العلامة ، ولكن ليس في موضع تحكم سلبي قريب (hrp-2). كما تم الكشف عن تخصيب هيستون H3 والتخصيب القريب من الخلفية في الترسبات المناعية للتحكم في IgG في جميع مواقع qPCR ، كما هو متوقع. عندما يتم تطبيع تخصيب ChIP في المراسل إلى موضع التحكم الإيجابي clec-18 ، يتم عرض إثراء هيستون H3K9me3 أعلى على GFP RNAi ، في حين أن تخصيب هيستون H3 مشابه بين التحكم وعلاجات GFP RNAi (الشكل 2D). نظرا لأنه من غير المتوقع أن يؤثر GFP RNAi على هيستون H3K9me3 أو إجمالي إشغال هيستون H3 في موضع clec-18 ، فإن هذا التطبيع يخفف من الاختلاف الفني ، مثل الاختلافات في كفاءة ChIP بين عينات GFP RNAi وعينات التحكم RNAi. يظهر تغيير الطي لمستويات هيستون H3K9me3 وهيستون H3 بين علاجات RNAi إثراء هيستون H3K9me3 الخاص بمراسل GFP ، بغض النظر عن إشغال الهستون ، عند إسكات GFP RNAi الناجم عن (الشكل 2E).

figure-results-1
الشكل 2: يتوافق الإسكات الناجم عن GFP RNAi مع ارتفاع تخصيب H3K9me3 عند هدف RNAi. (أ) رسم تخطيطي لمراسل GFP RNAi المعبر عنه بالخط الجرثومي mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] مع تمييز مناطق amplicon qPCR. (ب) سجل تعبير GFP عبر الأجيال بعد علاجات RNAi عند 21 درجة مئوية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن نسختين بيولوجيتين. (ج) ChIP-qPCR من H3K9me3 ، هيستون H3 ، والتحكم IgG في F1 الشباب من اثنين من النسخ البيولوجية المتماثلة. clec-18 و hrp-2 هما مواضع التحكم الإيجابية والسلبية لتخصيب H3K9me3 ، على التوالي. (د) تم تطبيع تخصيب H3K9me3 وهيستون H3 في مراسل GFP RNAi إلى موضع التحكم الإيجابي clec-18. (ه) التغير في تخصيب H3K9me3 وهيستون H3 بين GFP RNAi- المعالجة بالحمض النووي الريبي الضابط ، مع التطبيع إلى clec-18. يمثل الخط المنقط تغييرا في الطي بمقدار 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، يتم إدخال dsRNA عن طريق التغذية ، والتي أصبحت طريقة قياسية في C. elegans18. بالنسبة لمقايسات وراثة RNAi ، يوفر نهج التغذية طريقة سهلة للحصول على عدد كبير من السكان P02،11،12،22،23،24،25. ومع ذلك ، فإن توقيت ومدة التعرض للحمض النووي الريبي يؤثر على فعالية إسكات الجيناتالمحورة 26 ، ويؤثر تركيز بكتيريا RNAi على استمرار إسكات RNAi الوراثي1. لذلك ، تعد بكتيريا RNAi الموحدة ونمو الديدان مهمة للحصول على مستوى ثابت من إسكات GFP ومدة الميراث. هنا ، يتم طلاء الأجنة على ألواح RNAi بحيث تتعرض P0 لبكتيريا RNAi من الفقس. قامت الأساليب البديلة بطلاء المرحلة L1 24,27 أوL4 25 المتزامنة على ألواح RNAi-NGM. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الجوع والضغوط الأخرى تؤثر على الحفاظ على وراثة RNAi13 ، يجب مراقبة اللوحات لمنع الاكتظاظ واستنفاد الإمدادات الغذائية. كبديل لبدء RNAi عن طريق التغذية ، فإن بعض دراسات وراثة C. elegans RNAi الرائدة تحفز RNAi من خلال حقن الغدد التناسلية ، مما يوفر تحكما أكبر في تركيز dsRNA 1,28.

في هذا البروتوكول ، يتم تمرير كل جيل كمجموعة سكانية مع معالجة هيبوكلوريت قلوية ، كما هو موضح سابقا16،22،23،24. تضمن معالجة هيبوكلوريت عدم تلوث جيل F1 ببكتيريا RNAi من البيئة الأبوية22 ويمنع اختناق الزجاجة غير المرغوب فيه من السكان. ومع ذلك ، قد يكون المرور الجماعي أيضا قيدا ، نظرا لأن الفردية قد يكون لها أنماط وراثة مميزة 1,29. طريقة بديلة لإنشاء كل جيل هي اختيار الفردية1،2،9،11،25. يسمح هذا النهج بتتبع الأنماط الظاهرية داخل الأنساب ودمج التهجينات الجينية. قد يكون تحليل النسب مفيدا أيضا للأنماط الظاهرية منخفضة الاختراق12.

تعبير البروتين الفلوري هو قراءة قوية ومريحة للإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي2،3،4،12،14،15،16،25،30. كما هو موضح في هذا البروتوكول ، يمكن تسجيل تعبير GFP يدويا ك ON أو OFF 11،12،15،16،25. يمكن تحسين التسجيل اليدوي بشكل أكبر من خلال تعيين مستويات الكثافة النوعية3،4،14. بدلا من ذلك ، يمكن أن يوفر تسجيل الكثافة الآلي للصور المجهرية11،12،14،25،27 أو قياس مضان التدفق الخلوي للحيوانات الحية2 قراءة كمية وعالية الإنتاجية. ومع ذلك ، نظرا لأن تعبير المراسل يقتصر على الخط الجرثومي ، فإن التحذير من الأساليب الآلية هو أنه يجب عليهم أيضا التمييز بين ذات التعبير الصامت ل GFP مقابل التي ليس لها خط جرثومي ، خاصة إذا كانت الدراسة تتضمن طفرات ذات تطور غير طبيعي للخط الجرثومي. كبديل لفلورة GFP ، يمكن استخدام النسخ العكسي (RT) -qPCR لتحديد مستويات RNAi المستهدفة قبل mRNA و mRNA2،16،23،24. يوفر هذا النهج قراءة أكثر مباشرة للإسكات ، والتي تستهدف الحمض النووي الريبي ، وهي مفيدة بشكل خاص لأهداف RNAi الأخرى حيث لا ينتج عن الإسكات نمط ظاهري مرئي. يتمثل أحد قيود استخدام مراسلي GFP المصطنعين في أن التسلسلات الخارجية والداخلية يتم تنظيمها بشكل تفاضلي في RNAi11 عبر الأجيال. لذلك ينبغي اعتبار الدراسات ذات الأهداف الداخلية ، مثل الأليل الجنيني المميت الحساس للحرارة oma-1 (zu405) 1،11،16،25 ، نهجا تكميليا لمراسلي الجينات المحورة الفلورية.

يتطلب تحليل ChIP في سياق مقايسات وراثة RNAi مقارنة بين العلاجات والتكرارات. أولا ، لحساب الاختلافات في المواد الأولية بين العينات ، يتم تطبيع إشارة ChIP إلى إشارة الإدخال في نفس موضع "النسبة المئوية للإدخال". ستساعد معالجة هيستون H3 ChIP بالتوازي على تحديد ما إذا كانت أي تغييرات في تعديل هيستون تتوافق مع التغيرات في كثافة النيوكليوسوم. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن ChIP عملية متعددة الخطوات ، فقد تختلف الكفاءة بين العينات. يعد اختيار مواقع التحكم الإيجابية والسلبية المناسبة مفيدا لتقييم ومقارنة نسبة الإشارة إلى الضوضاء بين العينات والتجارب. بالإضافة إلى ذلك ، لتسهيل المقارنات بين العينات ، غالبا ما يتم تسوية قيم دورة عتبة ChIP DNA qPCR عند هدف RNAi إلى موضع التحكم3،11،15،23،30،31. لتقييم آثار علاج RNAi ، تتم أيضا مقارنة نسبة إشارة ChIP في علاج RNAi مقابل التحكم أو عدم وجود شروط RNAi. يتمثل أحد قيود النهج الحالي في أن ChIP يتم إجراؤه مع كاملة ، في حين أن الاستجابة لعلاج RNAi قد تكون فريدة من نوعها بالنسبة للخط الجرثومي. تتمثل إحدى طرق التغلب على هذا التحذير في إجراء ChIP باستخدام نوى الخط الجرثومي المعزولة. كما تمت مناقشة اعتبارات فنية إضافية لتحسين ChIP على نطاق واسع في مكان آخر32,33.

بشكل عام ، يوفر وراثة RNAi وبروتوكول ChIP أساسا مفصلا وسهل التكيف يمكن دمجه مع تقنيات أخرى لمواصلة استكشاف التنظيم اللاجيني عبر الأجيال. على سبيل المثال ، يمكن إنشاء مكتبات تسلسل عالية الإنتاجية من ChIP DNA (ChIP-seq) للحصول على عرض أكثر تفصيلا لمشهد الكروماتين القريب من هدف RNAi وعلى نطاق واسع للجينوم.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤكد جميع المؤلفين أنه ليس لديهم أي تعارضات للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعرب عن تقديرنا للمختبرات في مجتمع C. elegans التي طورت الأدوات وشاركتها والتي تم الاستشهاد بعملها في هذه المخطوطة. تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). تم دعم هذا العمل من خلال منحة مشروع المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) إلى A.L.S. (PJT-175245). يتم دعم CL من قبل منحة الدراسات العليا لمجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) (PGS-D).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBioshopAGA002
AmpicillinBioshopAMP201اصنع محلول 100 مجم / مل في ماء عالي النقاء. قم بتعقيمها وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
مضاد ل H3K9me3 أرنب متعدد النسيلة الأجسام المضادةAbcamab8898تركيز يعتمد على الدفعة (0.9 - 1 مجم / مل).
مضاد هيستون H3 أرنب متعدد النسيلة الأجسام المضادةAbcamab1791التركيز يعتمد على الدفعة (0.7 - 1 مجم / مل).
التبييض (6٪ هيبوكلوريت الصوديوم)سلالة Lavo02358107
C. elegans< / em> مع GFP RNAi ReporterNASX1263Sapetschnig et al. 2015 (المرجع 7). هدية من مختبر E. Miska ، جامعة كامبريدج.
كاربينيسيلينبيو شوبCAR544اصنع محلول 25 مجم / مل في ماء فائق النقاء. قم بتعقيمها وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
Dynabeads Protein G الخرز المغناطيسيInvitrogen10003D
< em > الإشريكية القولونية < م > سلالة HT115 (DE3) مركزعلم الوراثة Caenorhabditis (CGC)HT115 (DE3)
E. القولوني< / EM > سلالة OP50-1مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC)OP50-1
EDTA (0.5 م ، درجة الحموضة 8.0)مضان Invitrogen15575020
StereoscopeZeissAxio Zoom.V16
الفورمالديهايد (37٪)SigmaF8775
GlycineSigma50046اصنع محلولا بحجم 1.25 M وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.
HEPES-KOH (1 م ، درجة الحموضة 7.5)TeknovaH1035
مطبوعة كارهة للماء ، 10 آبارVWR100488-904
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate)BioShopNON999اصنع محلولا بنسبة 10٪ (حجم حجم / حجم) في ماء عالي النقاء وخزنه في درجة حرارة الغرفة.
IPTG (الأيزوبروبيل - بيتا ؛ - د-ثيوغالاكتوسيد) BioShopIPT001اصنع محلول 0.2 جم / مل في الماء عالي النقاء. قم بتعقيمها وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725122
LB Agar Plates مكملة ب 100 & micro ؛ جم / مل أمبيسلينNANA وصفة المختبر القياسية.
ليفاميزول (تتراميسول هيدروكلوريد)سيجماL9756اصنع محلول 200 ملي مولار في ماء فائق النقاء. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
LiCl (8 M)SigmaL7026
M9 BufferNANA22 ملي مولار KH2PO4 ، 42 ملي Na2HPO4 ، 86 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي ملي MgSO4.
فاصل مغناطيسي (أنابيب 1.5 مل)حيوي تطبيقيA13346
مغناطيسي (أنابيب 0.2 مل) غطاءPermagenMSR812
زجاجفيشر Scientific12541B
مجهر الشريحةالتقني اختيارLAB-037
NaCl (5 M) PromegaV4221لمخازن ChIP.
هيدروكسيد الصوديوم SigmaS5881اصنع محلولا بطول 10 أمتار واحفظه في درجة حرارة الغرفة.
لوحات NGMNANA 1.7٪ (وزن / حجم) أجار ، 0.3٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم ، 0.25٪ (وزن / حجم) بيبتون ، 1 ملي مولار CaCl2 ، 5 & جم / مل من الكوليسترول ، 25 ملي فوسفات البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 6.0 ، 1 ملي ملزومات المغنيسوات 4 ، 50 وميكرو ؛ جم / مل ستربتومايسين.
أرنب عادي IgG (1 مجم / مل) تقنيةإشارات الخلية2729
أطباق بتري (35 مم × 10 مم)Sarstedt82.1135.500
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10X)كواشف فيشر الحيويةBP3991
بلازميد - التحكم في RNAi   ؛AddgeneL4440 (بلازميد # 1654) بلازميد
- GFP-targetting RNAi   ؛AddgeneL4417 (Plasmid # 1649)ملاحظة ، يمكن استخدام البلازميدات البديلة المشتقة من L4440 التي تستهدف GFP.
زوج التمهيدي [-3.3 كيلو بايت في المنبع من gfp]تقنيات الحمض النووي المتكاملةNAF: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA، R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG
زوج التمهيدي [+1.3 كيلو بايت في اتجاه مجرى GFP]تقنيات الحمض النووي المتكاملةNAF: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG، R: ACGTGGGGGATCATTTCTTACT
زوج التمهيدي [CLEC-18]تقنيات الحمض النووي المتكاملةNAF: TGCTCCATGACCTCAACACA، R: AGTACAGTTCACCACCACCAGA
زوج التمهيدي [gfp exon 1]تقنيات الحمض النووي المتكاملةNAF: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT ، R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC
زوج التمهيدي [GFP EXON 4]تقنيات الحمض النووي المتكاملةNAF: GATGGCCCTGTCCTTACCA ، R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA
زوج التمهيدي [HRP-2]تقنيات الحمض النووي المتكاملةNAF: CGTCAACAGGGAGCAGCTG ، R: CCTCCGAACTTTCTGTGTCCA
قرص كوكتيل مثبط للإنزيمروش11836170001
بروتيناز K طقم تنقية BiolineBIO-37084
QIAquick PCR  Qiagen28104
نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيBio-RadCFX96   ؛
ألواح RNAi-NGMNANA 1.7٪ (وزن / حجم) أجار ، 0.3٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم ، 0.25٪ (وزن / حجم) بيبتون ، 1 ملي مولار CaCl2 ، 5 & micro ؛ جم / مل من الكوليسترول ، 25 ملي فوسفات البوتاسيوم المخزن الهيدروجيني 6.0 ، 1 ملي ملزومات المغنيسوت 4 ، 25 وميكرو ؛ جم / مل كاربينسيلين و 5 ملي مولار IPTG.
RNase ASigmaR4642
Sarkosyl (ملح الصوديوم N-Lauroylsarcosine)SigmaL5777اصنع محلولا بنسبة 10٪ (وزن / حجم) واحفظه في درجة حرارة الغرفة محميا من الضوء لمدة أقصاها شهر واحد.
SDSSigma74255اصنع محلولا بنسبة 10٪ (وزن / حجم) وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
ديوكسي كولات الصوديومSigma30970اصنع محلول 5٪ (وزن / حجم) وخزنه في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء لمدة أقصاها شهر واحد.
أنبوب صوتنةدائم الخضرة214-3721-010
غطاء أنبوب صوتنةدائم الخضرة300-2911-020
سونيكاتورQ800R3-110
كبريتات الستربتومايسينBioshopSTP101اصنع محلول 50 مجم / مل في ماء عالي النقاء. قم بتعقيمها وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
عازلة TAE (1X)NANA 40 ملي مولار تريس ، 20 ملي أسيتات ، 1 ملي مولار EDTA
Tally عداد نقرأولينH-7350
التتراسيكلينBioshopTET701اصنع محلول 5 مجم / مل في الإيثانول وخزنه عند -20 درجة مئوية.
خلاط حراريEppendorf05-400-205
Tris-HCl (1 م ، درجة الحموضة 8.0)Invitrogen15568025
Triton X-100SigmaT8787اصنع محلولا بنسبة 10٪ (حجم / حجم) في ماء عالي النقاء وخزنه في درجة حرارة الغرفة.
شرائح نظام فاصل مجهر البروتيني

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).">Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).
  2. piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans. Cell. 150 (1), 88-99 (2012).">Ashe, A., et al. piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans. Cell. 150 (1), 88-99 (2012).
  3. A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality. Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).">Buckley, B. A., et al. A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality. Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).
  4. Long-term gene silencing by RNAi. Nature. 442 (7105), 882(2006).">Vastenhouw, N. L., et al. Long-term gene silencing by RNAi. Nature. 442 (7105), 882(2006).
  5. C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts. Cell. 150 (1), 78-87 (2012).">Lee, H. -C., et al. C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts. Cell. 150 (1), 78-87 (2012).
  6. Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).">Luteijn, M. J., et al. Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).
  7. Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans. PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).">Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans. PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).
  8. piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell. 150 (1), 65-77 (2012).">Shirayama, M., et al. piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell. 150 (1), 65-77 (2012).
  9. Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus. Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).">Minkina, O., Hunter, C. P. Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus. Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).
  10. Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways. Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).">Seroussi, U., et al. Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways. Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).
  11. H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes. eLife. 8, e40448(2019).">Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes. eLife. 8, e40448(2019).
  12. Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance. Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).">Woodhouse, R. M., et al. Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance. Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).
  13. Stress resets ancestral heritable small RNA responses. eLife. 10, e65797(2021).">Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. Stress resets ancestral heritable small RNA responses. eLife. 10, e65797(2021).
  14. A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 165 (1), 88-99 (2016).">Houri-Ze'evi, L., et al. A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 165 (1), 88-99 (2016).
  15. The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).">Spracklin, G., et al. The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).
  16. Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein. Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).">Perales, R., et al. Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein. Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).
  17. piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing. Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).">Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing. Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).
  18. Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology. WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).">Ahringer, J. Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology. WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).
  19. Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record. microPublication Biology. 2018, (2018).">Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record. microPublication Biology. 2018, (2018).
  20. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).">Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
  21. Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).">Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).
  22. Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint. Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).">Gu, S. G., et al. Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint. Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).
  23. Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans. Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).">Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans. Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).
  24. elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing. Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).">Kalinava, N., et al. elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing. Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).
  25. MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance. Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).">Lev, I., et al. MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance. Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).
  26. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).">Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  27. A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi. Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).">Xu, F., et al. A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi. Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).
  28. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).">Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).
  29. Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).">Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans. Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).
  30. Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).">Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).
  31. The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).">Mao, H., et al. The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).
  32. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).">Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  33. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).">Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transgenerational Epigenetic InheritanceRNAi InheritanceC ElegansChromatin ImmunoprecipitationFluorescent ReporterHistone ModificationGermline SilencingGFP ReporterSmall RNA PathwaysGene Silencing

Related Articles