يظهر هنا بروتوكول فعال لنضح الدم السريع لإعداد عينات الأنسجة من الضفادع الأفريقية ذات المخالب لدراسات النسخ والبروتينات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كانت Xenopus كائنات نموذجية قوية لفهم تطور الفقاريات وأمراضها لأكثر من 100 عام. هنا ، يتم تعريف بروتوكول نضح الدم السريع في Xenopus ، والذي يهدف إلى انخفاض ثابت وجذري للدم داخل جميع الأنسجة. يتم إجراء التروية عن طريق إدخال إبرة مباشرة في بطين القلب وضخ محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عبر نظام الأوعية الدموية. يمكن إكمال الإجراء في حوالي 10 دقائق لكل. يهيمن على الدم عدد قليل من البروتينات وأنواع الخلايا الوفيرة للغاية ، مما يخلق العديد من المشكلات لأن هذه البروتينات تخفي معظم الجزيئات وأنواع الخلايا الأخرى ذات الأهمية. سيستفيد التوصيف القابل للتكرار لأنسجة Xenopus البالغة مع البروتينات الكمية والنسخ أحادي الخلية من تطبيق هذا البروتوكول قبل أخذ عينات الأعضاء. يتم تعريف بروتوكولات أخذ عينات الأنسجة في الأوراق المصاحبة. تهدف هذه الإجراءات إلى توحيد الممارسات عبر Xenopus من مختلف الجنس والعمر والحالة الصحية ، وتحديدا X. laevis و X. tropicalis.
المقدمة
يتم الانتهاء من نضح البرمائيات بالكامل بشكل روتيني لأغراض الحفظ والتثبيت1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، تحدث هذه الإجراءات بمعدل يحد من عدد العينات الطازجة التي يمكن أخذها لكل. الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول فعال لنضح الدم في Xenopus ، مع إعطاء الأولوية لسرعة هذه التقنية. يستغرق البروتوكول أقل من 10 دقائق لكل ل X. tropicalis وأقل من 15 دقيقة لكل X. laevis. الأولويات الثانوية هي سهولة النسخ واستخدام المعدات التي يمكن الحصول عليها بسهولة بحيث يمكن مشاركة العينات عالية الجودة على نطاق واسع بين مختبرات Xenopus.
تستخدم ضفادع Xenopus على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لدراسة العمليات البيولوجية والمرضية الأساسية المحفوظة عبر الأنواع. هذا رباعي الأرجل له علاقة تطورية أوثق مع الثدييات من النماذج المائية الأخرى ، حيث يحتوي على رئتين وقلب من ثلاث غرف وأطراف ذات أرقام. يستخدم المجتمع الدولي Xenopus بشكل فعال لاكتساب فهم أعمق للأمراض البشرية من خلال نمذجة الأمراض المتعمقة والتحليل الجزيئي لوظيفة الجينات المرتبطة بالمرض. المزايا العديدة ل Xenopus كنموذج حيواني تجعلها أدوات لا تقدر بثمن لدراسة الأساس الجزيئي للتنمية البشرية والمرض. وتشمل هذه المزايا: حجم البويضة والجنين الكبير ، والخصوبة العالية ، وسهولة السكن ، والتطور الخارجي السريع ، وسهولة التلاعب الجينومي. تشير التقديرات إلى أن Xenopus يشارك ~ 80٪ من جينات الأمراض البشرية المحددة7.
بالمقارنة مع نماذج الثدييات الشائعة ، يعد Xenopus نموذجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة ، مع سهولة هدم المورفولينو وتوافر الجينات المحورة الفعالة والطفرات الجينية المستهدفة باستخدام CRISPR8. تم تطبيق قياس الطيف الكتلي الكمي والنسخ أحادي الخلية بنجاح على أجنة Xenopus 9,10 ، لكن أطلس الخلايا الأخير من Xenopus laevis يظهر أن تكوين معظم الأنسجة تهيمن عليه أنواع خلايا الدم 11. من خلال تطوير تقنية تقوم بإخراج الأنسجة بمعدل سريع واستخدام الوسائط المبردة ، تتأثر نضارة العينة إلى الحد الأدنى بالتروية. هذا مهم بشكل خاص للتطبيقات التي يكون الهدف فيها هو تحديد mRNA غير المضطرب من الناحية الفسيولوجية أو تعبير البروتين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع التجارب وفقا لقواعد وأنظمة كلية الطب بجامعة هارفارد IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان) (IS 00001365_3).
ملاحظة: على الرغم من أن الطريقة الأساسية للقتل الرحيم الموصوفة تعتبر تقنية مقبولة للقتل الرحيم من قبل الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية12 ، إلا أنه لم يتم العثور عليها تؤدي إلى توقف ضربات القلب13. حتى الطريقة الثانوية المستخدمة بشكل متكرر للضرب المزدوج لا تمنع ذلك ، ولا إزالة القلب من الحيوان. يعتبر استنزاف الحيوانات المخدرة طريقة إنسانية وفعالة للقتل الرحيمالناجح 12. نظرا لأن الحفاظ على الأنسجة الطازجة من خلال القتل الرحيم هو الهدف من هذا البروتوكول ، فمن المفيد أن يستمر القلب في النبض من خلال القتل الرحيم الأولي باستخدام MS-222 ، وهذا التروية هو في حد ذاته طريقة ثانوية للقتل الرحيم من خلال الاستنزاف.
1. التحضير
- تأكد من أن المؤسسة البحثية قد وافقت على تقنية القتل الرحيم والتروية الموضحة في هذا البروتوكول.
- تحضير محلول 5 جم / لتر MS-222 (تريكايين ميثان سلفونات) و 5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم. يجب أن يكون الحجم أكبر من الحجم المطلوب لتغطية الحيوانات التي يتم قتلها رحيما بالكامل. تحقق من الرقم الهيدروجيني للتأكد من أنه ≥7.
- تحضير 500 ميكرولتر من 180 وحدة / مل من الهيبارين في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لكل X. laevis ، أو 200 ميكرولتر لكل X. tropicalis.
- إجراء القتل الرحيم الأولي عن طريق وضع Xenopus في هذا الحل (من الخطوة 1.2) ؛ سيبقى الحيوان مغمورا لمدة 1 ساعة.
- تأكد من أن Xenopus قد فقد استجابته للألم عن طريق قرص القدم لمدة 15 دقيقة في القتل الرحيم. إذا كان الحيوان تفاعليا ، فأعده إلى محلول القتل الرحيم حتى تضيع هذه الاستجابة.
- قم بوزن Xenopus واتخاذ أي قياسات إضافية مطلوبة قبل أخذ العينات.
- باستخدام إبرة 31 G ، حقن X. laevis مع 250 ميكرولتر و X. tropicalis مع 100 ميكرولتر من 180 U / mL الهيبارين في PBS (من الخطوة 1.3) في عضلات كل طرف أمامي.
- تحضير محلول 1 مل / جم من وزن الحيوان 54 وحدة / مل من الهيبارين في بيرفوسات PBS. قد يجد الأفراد الأكثر خبرة في هذا البروتوكول أن هناك حاجة إلى وسائط أقل لإكمال التروية.
- استخدم إبرة تحت الجلد 22 جم لإثراء X. laevis ، وإبرة تحت الجلد 25 جم ل X. tropicali s. قم بتخفيف إبرة التروية عن طريق تقليم الطرف بقواطع الأسلاك (الشكل 1)14.
ملاحظة: هذا يقلل من احتمال ثقب الإبرة من خلال البطين إذا تم تحريكها. بالإضافة إلى التقشير ، قد يتم طحن الإبرة قليلا بحصوات أو ملف شحذ ، لكنها تظل حادة بما يكفي لاختراق البطين. - قم بإعداد المضخة عن طريق توصيل الإبرة المشذبة وتعميم 54 وحدة / مل من بيرفوسات PBS الهيبارين (من الخطوة 1.8). تأكد من تطهير جميع فقاعات الهواء من الأنبوب للقضاء على احتمال انسداد الهواء ، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التروية أو الفشل (انظر الجدول 1). احتفظ بوسائط التروية على الثلج طوال مدة الإجراء.
- إذا كانت المضخة غير قابلة للبرمجة ، مع وجود الإبرة في مكانها ، فقم بقياس حجم الوسائط التي يتم ضخها تحت الإعدادات المختلفة لتحديد الإعدادات الأقرب إلى 5 مل / دقيقة و 10 مل / دقيقة. سيتم استخدام معدلات التدفق هذه بغض النظر عن الأنواع. إذا كانت مضخة التروية قابلة للبرمجة ، فقم بمعايرتها مع وضع الإبرة في مكانها ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- ضع سطح التشريح (صينية أو لوح رغوي) على منحدر داخل حاوية ثانوية ، أو رتبه لتسهيل تصريف الدم.
- بمجرد أن يكون الضفدع في المحلول لمدة 1 ساعة ، يكون القتل الرحيم الأولي قد اكتمل. قم بإزالة الضفدع وأعد فحص فقدان استجابة الألم عن طريق إجراء قرصة القدم.
- ضع الضفدع على ظهره وقم بتثبيت كل طرف (الشكل 2). إذا كان الحفاظ على أنسجة الأطراف مطلوبا ، فقد يتم وضع دبابيس رفيعة من خلال الأرقام أو الدبابيس على شكل حرف U حول الأطراف.
- باستخدام مقص التشريح ، قم بقطع الجلد ، حتى خط الوسط ، ثم بشكل جانبي ، مما يجعل اثنين من اللوحات. (الشكل 2)
- استخدم الملقط للإمساك بالخط العريض وسحبه بعيدا عن التجويف القولوني (الشكل 3). استخدم المقص بعناية لتقطيع العضلات. اصنع لوحتين من جدار التجويف وقم بقص أو تثبيت جميع اللوحات بعيدا عن الطريق.
- استخدم مقص التشريح لقطع العظام الغرابية وقطع الأنسجة الزائدة للوصول بشكل أفضل إلى القلب (الشكل 3).
- يجب أن يظل القلب ينبض. إذا توقف القلب عن النبض قبل التروية ، لاحظ أن نضارة العينة قد تعرضت للخطر.
2. التروية
- حدد المعدة وقم بتحريكها برفق بحيث تكون أعلى الفص الأيسر من الكبد (على يمين المشاهد) ، مع ظهور الأوعية الدموية طوال مدة الإجراء. تحديد الرئة وإمساكها من طرفها باستخدام ملقط الأنسجة. اسحب الرئة خارج التجويف القولوني وثبتها من خلال الطرف (الشكل 4). افعل ذلك برفق ، لأن الأوعية الدموية المكسورة لا تتخلل جيدا. لاحظ ما إذا كان الدم مرئيا داخل الفص ، لأن هذا سيؤثر على القدرة على تحديد اكتمال الإجراء.
- التقط صورة للتجويف القولوني لتقييم كفاءة التروية بشكل أفضل وربما تحديد الأنسجة غير الطبيعية في وقت لاحق.
- حدد التامور الرقيق واسحبه باستخدام ملقط الأنسجة (الشكل 5). قم بثقب التامور برفق باستخدام طرف مقص استئصال القزحية ، مع الحرص على عدم قطع الأنسجة الكامنة. قشر التأمور بعيدا عن حجرات القلب الثلاث.
- استخدم الملقط للإمساك بالبطين برفق من قمته. ضع ضغطا محدودا بحيث يكون هناك مساحة كافية بين أسطح الجر للملقط حتى تمر إبرة التروية (الشكل 6).
- أدخل الإبرة من خلال إغلاق الملقط في حجرة البطين ، مع الحرص على عدم ثقب البطين (الشكل 7). ثبت ملقط الأنسجة في مكانه باستخدام حامل إبرة باستخدام مرقئ.
ملاحظة: تعمل هذه التقنية على تثبيت موضع الإبرة ، والذي لا يزال حادا. سيؤدي تثبيت الإبرة مباشرة إلى البطين أيضا إلى تلف غير ضروري ، مما يجعل إعادة التثبيت أكثر صعوبة إذا لزم الأمر (انظر الجدول 1). - ابدأ تدفق المضخة عند حوالي 5 مل / دقيقة. سوف تغرق الغرف الثلاث للقلب والجذع الشرياني (الشكل 8 ؛ انظر الجدول 1).
- باستخدام المقص ، قم بلف الأذن اليمنى بعناية (على يسار المشاهد) ؛ سوف يتدفق الدم. اضبط معدل التدفق على 5 مل / دقيقة أو قم بزيادته إلى 10 مل / دقيقة.
- استمر حتى تبيض الأوعية الدموية في المعدة (انظر الجدول 1) ، ثم انس الأذن اليسرى للقلب (على يمين المشاهد). إذا كان معدل التدفق لا يزال 5 مل / دقيقة ، فقم بزيادته إلى حوالي 10 مل / دقيقة.
- استخدم ماصة نقل لشطف التجويف القولوني في وسائط التروية ، للمساعدة في الحفاظ على الرؤية وتقييم لون البيرفوسات المتدفقة من الأذنين بشكل أفضل.
- حافظ على الإبرة في مكانها حتى يصبح البيروسوات المتدفقة من الأذنين صافية (انظر الجدول 1) وتفقد الرئة لونها الأحمر (انظر الجدول 1 ؛ الشكل 9).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد التروية الناجحة ، ستكون جميع الأنسجة (باستثناء الكبد في Xenopus المصطبغ) أخف وزنا بشكل واضح وأقل تشبعا بالدم. ستصبح الأوعية الدموية الرئيسية أقل وضوحا (الشكل 10) ، وستشطف الأنسجة (باستثناء الكبد) بشكل نظيف في المخزن المؤقت بعد أخذ العينات. في حين أن التنفيذ الناجح للبروتوكول لا يمكن تأكيده في النهاية إلا من خلال جودة البيانات من عينات الأنسجة المستنزهة ، يتم توفير العديد من المشكلات النموذجية وأسبابها المحتملة والإجراءات العلاجية المقترحة في جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول تقنيات التشريح التقليدية للوصول إلى تجويف coelomic. التقنيات الأخرى مقبولة أيضا ، بشرط أن تسبب الحد الأدنى من الضرر للأنسجة ، ويمكن الوصول إلى القلب ، وتكون الرئة والمعدة مرئية. وبالمثل ، يمكن استبدال معظم أدوات التشريح المدرجة بسهولة بعناصر قابلة للمقارنة.
في حين بذلت محاولات لتحسين فعالية هذا الإجراء ، قد تختلف النتائج اعتمادا على تجربة الفرد وتباينه بين الضفادع الفردية. أحد الجوانب المثيرة للاهتمام في نضح الدم الذي بقي خارج نطاق هذه الورقة هو كيفية مقارنة هذا الإجراء بطرق...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة OD R24 التابعة للمعاهد الوطنية للصحة OD031956 ومنحة NICHD R01 HD073104. نشكر دارسي كيلي على المناقشات المفيدة والمدخلات الأولية حول هذا البروتوكول. نود أيضا أن نشكر سامانثا جالبرت وجيل رالستون وويل راتزان على مساعدتهم ودعمهم بالإضافة إلى المراجعين النظراء الثلاثة المجهولين على ملاحظاتهم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5x عدسة مكبرة مع ضوء LED وحامل | amazon.com | B08QJ6J8P1 | يجب ألا تنتج الحرارة |
| ماصات نقل يمكن التخلص منها | VWR | 414004-036< / em> | |
| تشريح ملقط مدبب ناعم | فيشر Scinetific | 08-875 | |
| تشريح مقص حاد ، مستقيم 6.5 " | VWR | 76457-374 | |
| صينية تشريح | صفائح الستايروفوم | فيشر Scinetific | 14-370-284 |
| للقتل الرحيم | البند البلاستيكي الأمريكي | ؛ 2860 | حاويات غير شفافة بديلة مقبولة |
| غطاء حاوية القتل الرحيم | المتحدة | البلاستيك البند 3047 | |
| دبابيس تشريح دقيقة أجهزة | أنظمة الحياة | PIN- # 3 | |
| الاستخدام العام للإبر تحت الجلد ، 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | ل X. laevis< / em> |
| الاستخدام العام للإبر تحت الجلد ، 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | ل X. tropicalis< / em> |
| الهيبارين ، الغشاء المخاطي | المعوي للخنازيرMilliporeمقص قزحية | القزحية 37-505-410MG | |
| مقص قزحية 6 " | vwr | 470018-938 | مقص القزحية هو بديل مقبول |
| محول Luer-to-Barb ذكر Luer مع حلقة قفل | amazon.com | B09PTX6M2Z | سيعتمد الحجم على خرطوم المضخة المستخدمة |
| إبرة Mayo-Hegar | Fisher Scinetific | 08-966 | ملقط البعوض هو بديل مقبول |
| MS-222: Syncaine (tricaine سابقا) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| مضخة جرعات المضخة السائلة التمعجية 5 & ndash ؛ 100 مل / دقيقة | amazon.com | B07PWY4SM6 | أي مضخة تمعجية قادرة على ضخ 5-10 مل / دقيقة |
| مقبولة شحذ الحجر | VWR | 470150-112 | اختياري ؛ للإبر الباهتة |
| بيكربونات الصوديوم ، مسحوق ، ملقط عينة USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| VWR | 82027-442 | ||
| T-Pins لتشريح | فيشر Scinetific | S99385 | |
| محاقن الأنسولين القصيرة فائقة النعومة ، | 31 G VWR BD328438 | ||
| ، مقصات قطع جانبية فائقة الوضوح وقوية مقاس 6 بوصات | amazon.com | B087P191LP |
المراجع
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
