هنا ، نقدم بروتوكولا يصف تحضير نوى الخلية. بعد التشريح المجهري والتفكك الأنزيمي للأنسجة القلبية إلى خلايا مفردة ، تم تجميد الخلايا السلفية ، تليها عزل الخلايا النقية القابلة للحياة ، والتي تم استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تحليلات تسلسل عالية الإنتاجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل النوى من الخلايا السلفية القلبية للفأر من أجل التنميط فوق الجينوم والتعبير الجيني بدقة خلية واحدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
القلب النامي هو هيكل معقد يحتوي على خلايا سلفية مختلفة تتحكم فيها آليات تنظيمية معقدة. يسمح فحص التعبير الجيني وحالة الكروماتين للخلايا الفردية بتحديد نوع الخلية وحالتها. كشفت مناهج تسلسل الخلية الواحدة عن عدد من الخصائص المهمة لعدم تجانس الخلايا السلفية القلبية. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرق بشكل عام على الأنسجة الطازجة ، مما يحد من الدراسات ذات الظروف التجريبية المتنوعة ، حيث يجب معالجة الأنسجة الطازجة مرة واحدة في نفس الجري لتقليل التباين التقني. لذلك ، هناك حاجة إلى إجراءات سهلة ومرنة لإنتاج البيانات من طرق مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (snATAC-seq) في هذا المجال. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل النوى بسرعة للنواة المزدوجة أحادية النوى اللاحقة (الجمع بين snRNA-seq و snATAC-seq). تسمح هذه الطريقة بعزل النوى من العينات المجمدة للخلايا السلفية القلبية ويمكن دمجها مع المنصات التي تستخدم غرف الموائع الدقيقة.
المقدمة
من بين العيوب الخلقية ، عيوب القلب الخلقية (CHDs) هي الأكثر شيوعا ، وتحدث في حوالي 1٪ من المواليد الأحياء كلعام 1,2. يتم تحديد الطفرات الجينية في أقلية فقط من الحالات ، مما يعني أن الأسباب الأخرى ، مثل التشوهات في تنظيم الجينات ، متورطة في مسببات أمراض القلبالتاجية 2,3. تطور القلب هو عملية معقدة من أنواع الخلايا المتنوعة والمتفاعلة ، مما يجعل تحديد الطفرات السببية غير المشفرة وتأثيراتها على تنظيم الجينات أمرا صعبا. يبدأ تكوين الأعضاء في القلب بالسلف الخلوي الذي يؤدي إلى ظهور أنواع فرعية مختلفة من خلايا القلب ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب والخلايا الليف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على الإجراء الحيواني المعتمد في هذه الدراسة من قبل لجان أخلاقيات الحيوان بجامعة إيكس مرسيليا (C2EA-14) وتم تنفيذه وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية الوطنية المعينة للتجارب على الحيوانات (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; تفويض Apafis رقم 33927-2021111715507212).
1. إعداد التزاوج الموقوت قبل التشريح
- لتوليد أجنة الفئران ، قم بإجراء تزاوج محدد الوقت بين الفئران البالغة قبل 9.5 أيام من عزل منطقة القلب. في هذا الإجراء ، تم استخدام الفئران من النوع البري C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 2-6 أشهر ، وتم إجراء التزاوج الموقوت بين عشية وضحاها....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بالمقارنة مع إعداد معلقات أحادية الخلية لنهج الخلية الواحدة ، فإن إعداد معلقات أحادية النوى أكثر صعوبة ويتطلب درجة أعلى من الدقة والمعالجة. العامل الرئيسي لنجاح snRNA-seq و snATAC-seq هو تعليق نوى نظيف وسليم. يجب تكييف بروتوكول عزل النوى الفعال مع كل نوع من الأنسجة وحالتها (طازجة أو مجمدة). هنا ، يتم وصف بروتوكول محسن لعزل النوى من خلايا القلب الجنينية للفأر المجمدة. يلخص الشكل 1 جميع الخطوات من تشريح المنطقة القلبية الجنينية وتفكك الخلايا القلبية إلى عزل النوى. بالنسبة للمادة الأولية ، يوصى.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر تحليل التركيب الخلوي للقلب النامي من خلال دراسات snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة فهما أعمق لأصل أمراض القلب الخلقية26. درست العديد من مختبرات الأبحاث آثار حفظ أنسجة القلب بالتبريد على snRNA-seq27. يمكن أن يكون إجراء snRNA-seq و snATAC-seq باستخدام أنسجة تشريح دقيقة جديدة من نماذج الفئران للأمراض البشرية أمرا صعبا من الناحية اللوجستية عند مقارنة الظروف التجريبية المختلفة. بالنسبة لمرحلة معينة من التطوير ، تتمثل إحدى الصعوبات في أنه يجب معالجة المجموعات الضابطة والتجريبية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث من قبل ERA-CVD-2019 و ANR-JCJC-2020 إلى SS. نشكر مرفق علم الجينوم والمعلوماتية الحيوية (GBiM) من مختبر U 1251 / Marseille Medical Genetics والمراجعين المجهولين على تقديم تعليقات قيمة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2100 أداة محلل حيوي | Agilent | لا يوجد رقم كتالوج | |
| 5M كلوريد الصوديوم (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML & nbsp ؛ | |
| BSA 10٪ | Sigma | A1595-50ML | |
| الكروم التالي GEM Chip J مجموعة خلية واحدة ، 16 rxns | 10X علم الجينوم | 1000230 | |
| الكروم التالي GEM أحادي الخلية Multiome ATAC + حزمة كاشف التعبير الجيني ، 4 rxns (بما في ذلك Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسة | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | لا يوجد رقم كتالوج | |
| Digitonin (5٪) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | معقمة وخالية من RNase |
| TT مجموعة 96 rxns | 10X الجينوم | 1000215 | |
| Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية ؛ | فيشر العلمية | 352096 | |
| Falcon 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | فيشر العلمية | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | معطل بالحرارة |
| طقم الحمض النووي عالي الحساسية | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE / DEAD VIVABILITY / Cellular Poisonity | Kit Thermofisher | L3224 | |
| MACS طقم إزالة الخلايا الميتة: حبات الخلايا الميتة Romoval MicroBeads ، عازلة ملزمة 20X | مصافي ميلتيني بيوتيك | 130-090-101 | |
| MACS الذكية (30 وميكرو ؛ م) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A & nbsp ؛ | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | لا يوجد رقم كتالوج | |
| Penicillin Streptomycin (Pen / Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40 & micro ؛ m | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| مثبط الصخور | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| مجموعة مؤشر واحد N مجموعة A ، 96 rxn | 10X علم الجينوم | 1000212 | |
| قياسي 90 مم طبق بتري Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| ماء مقطر مزدوج معقم | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride الحل (HCl) | Sigma | T2194-100ML ؛ | |
| صبغة تريبان زرقاء (0.4٪) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05٪ - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| رؤوس ماصة مرشحة بفتحة عريضة 200 مو ؛ ل | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | لا يوجد رقم كتالوج |
المراجع
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
