يوضح هذا البروتوكول نموذجا فريدا لضربة الماوس مع احتشاء متوسط الحجم ومعدل بقاء ممتاز. يسمح هذا النموذج لباحثي السكتة الدماغية قبل السريرية بتمديد مدة نقص التروية ، واستخدام الفئران المسنة ، وتقييم النتائج الوظيفية طويلة الأجل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج معدل لانسداد الشريان الدماغي الأوسط عبر الجمجمة لدراسة نتائج السكتة الدماغية في الفئران المسنة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في أبحاث السكتة الدماغية التجريبية ، يستخدم انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) بخيوط داخل اللمعة على نطاق واسع لنمذجة السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران. يظهر نموذج MCAO الفتيل عادة احتشاء دماغي هائل في الفئران C57Bl / 6 التي تتضمن أحيانا أنسجة المخ في المنطقة التي يوفرها الشريان الدماغي الخلفي ، والذي يرجع إلى حد كبير إلى ارتفاع معدل رتق الشريان الخلفي المتصل. تعتبر هذه الظاهرة مساهما رئيسيا في ارتفاع معدل الوفيات الذي لوحظ في الفئران C57Bl / 6 أثناء التعافي من السكتة الدماغية على المدى الطويل بعد خيوط MCAO. وبالتالي ، فإن العديد من دراسات السكتة الدماغية المزمنة تستغل نماذج MCAO البعيدة. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج عادة ما تنتج احتشاء فقط في منطقة القشرة ، وبالتالي ، فإن تقييم العجز العصبي بعد السكتة الدماغية يمكن أن يمثل تحديا. أنشأت هذه الدراسة نموذجا معدلا ل MCAO عبر الجمجمة يتم فيه إغلاق MCA في الجذع جزئيا إما بشكل دائم أو عابر عبر نافذة جمجمة صغيرة. نظرا لأن موقع الانسداد قريب نسبيا من أصل MCA ، فإن هذا النموذج يولد تلفا في الدماغ في كل من القشرة والمخطط. أظهر التوصيف المكثف لهذا النموذج معدل بقاء ممتاز على المدى الطويل ، حتى في الفئران المسنة ، بالإضافة إلى عجز عصبي يمكن اكتشافه بسهولة. لذلك ، يمثل نموذج الماوس MCAO الموصوف هنا أداة قيمة لأبحاث السكتة الدماغية التجريبية.
المقدمة
يعاني ما يقرب من 800000 شخص من سكتة دماغية في الولايات المتحدة كل عام ، ومعظم هذه السكتات الدماغية هي نقص تروية في الطبيعة1. استعادة تدفق الدم الدماغي في الوقت المناسب مع منشط البلازمينوجين الأنسجة (tPA) و / أو استئصال الخثرة هو حاليا العلاج الأكثر فعالية لمرضى السكتة الدماغية. ومع ذلك ، فإن الشفاء التام للوظائف العصبية على المدى الطويل أمر نادر الحدوث 2,3. وبالتالي ، فإن البحث عن علاج جديد للسكتة الدماغية يستهدف التحسين الوظيفي هو مجال مكثف للبحث يتطلب نماذج حيوانية ذات صلة سريريا للسكتة الدماغية.
يستخدم نموذج السكتة الدماغية الإقفارية الأكثر شيوعا في القوارض انسداد الشريان الدماغي الأوسط داخل اللمعة (MCAO) للحث على السكتة الدماغية. في هذا النموذج ، الذي طورته Zea Longa في البداية في عام 1989 ، يتم إدخال خيوط نايلون في الشريان السباتي الداخلي (ICA) لمنع تدفق الدم إلى الشريان الدماغي الأوسط (MCA) 4. ومع ذلك ، فإن هذا النموذج له قيود. أولا ، عندما يتم إدخال الفتيل في ICA ، يمكن حظر تدفق الدم إلى الشريان الدماغي الخلفي (PCA) جزئيا أيضا ، خاصة في الفئران. بشكل حاسم ، فإن الشريان المتصل الخلفي (PcomA) ، وهو شريان صغير يربط الدورة الدموية الدماغية الأمامية والخلفية ، غالبا ما يكون متخلفا في بعض سلالات الفئران ، مثل C57Bl / 6 ، وهي السلالة المستخدمة في الغالب في أبحاث السكتة الدماغية التجريبية. يعتقد أن هذا المباح من PcomA يساهم في التباين في حجم الآفة في الفئران بعد السكتة الدماغية5. في الواقع ، عندما ينخفض تدفق الدم إلى PCA بشكل حاد خلال MCAO ، ولا يستطيع PcomA توفير تدفق دم جانبي كاف ، يمكن أن يتوسع احتشاء السكتة الدماغية إلى أراضي PCA. علاوة على ذلك ، في هذا النموذج ، تؤدي مدة نقص التروية الطويلة إلى زيادة فرصة الوفيات في الفئران. وبالتالي ، عادة ما يتم استخدام مدة MCAO قصيرة من 30-60 دقيقة في الفئران. ومع ذلك ، فإن معظم مرضى السكتة الدماغية يعانون من بضع ساعات من نقص التروية قبل علاج التروية. وبالتالي ، فإن نموذج ضربة الماوس مع مدة طويلة من نقص التروية له أهمية سريرية عالية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو نمذجة السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران التي لديها احتشاء متوسط الحجم ومعدل بقاء ممتاز. يعالج نموذج MCAO عبر الجمجمة السمات الحرجة للسكتة الدماغية السريرية ، حيث يمكن إجراء نقص التروية لفترات طويلة ، وتتحمل الفئران المسنة هذا النموذج جيدا ، مما يسمح بالتقييم طويل الأجل للتعافي الوظيفي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا العمل وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام في البحث ، وقد تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام بمعهد ديوك (IACUC). تم استخدام ذكور الفئران الصغيرة (8-10 أسابيع) والذين تتراوح أعمارهم بين (22 شهرا) C57Bl / 6 في الدراسة الحالية. يوضح الشكل 1 نظرة عامة على هذا البروتوكول.
1. التحضير الجراحي
- افحص الماوس بحثا عن تشوهات جسيمة وعجز سلوكي.
ملاحظة: قبل الجراحة ، من المهم أن يرتدي الجراحون معدات الوقاية الشخصية المناسبة (المعدات الشخصية الواقية) ، بما في ذلك القناع الجراحي والقبعة والقفازات والعباءة. - وزن الماوس. قم ببرمجة جهاز التنفس الصناعي (انظر جدول المواد) بناء على وزن الجسم.
- ضع الماوس في صندوق تحريض التخدير 4 × 4 بوصة × 7. قم بتشغيل مقياس تدفق الأكسجين (انظر جدول المواد) ، واضبط على 30 ، ومقياس تدفق أكسيد النيتروز ، مضبوطا على 70. قم بتشغيل المرذاذ بنسبة 5٪ إيزوفلوران.
- أدخل سلك التوجيه في القسطرة الوريدية (IV) 20 G.
- أخرج الماوس من صندوق الحث عندما ينخفض معدل التنفس إلى 30-40 نفسا في الدقيقة.
- ضع الماوس على المقعد الجراحي في وضع ضعيف. اسحب لسان الماوس للخارج وأمسكه بأصابع اليد اليسرى. أدخل منظار الحنجرة (انظر جدول المواد) في فم لتصور الحبل الصوتي.
- تثبيت ذقن الماوس على منظار الحنجرة باستخدام الإصبع الأوسط الأيمن. حرر اليد اليسرى لحمل قسطرة 20 G IV.
- أدخل سلك التوجيه قليلا في الحبل الصوتي ، ثم ادفع القسطرة الوريدية 20 G ببطء في القصبة الهوائية حتى يصبح جزء الجناح من القسطرة متساويا مع طرف الأنف.
ملاحظة: إذا كان الماوس يتحرك، فلا تقم بإدخال السلك. هذا قد يسبب صدمة في القصبة الهوائية والنزيف. - قم بتشغيل جهاز التنفس الصناعي (انظر جدول المواد) ، وقم بتوصيله بقسطرة 20 G IV التي يتم تنبيبها في الماوس. قلل الأيزوفلوران إلى 1.5٪ ، وتأكد من تهوية كلتا الرئتين ميكانيكيا.
ملاحظة: لا تنس تقليل تركيز الأيزوفلوران. خلاف ذلك ، سوف يتلقى الماوس جرعة زائدة من التخدير. - يوضع مرهم العين على كلتا العينين ويحقن 5 ملغ/ كغ من كاربروفين تحت الجلد.
- احتفظ بالماوس في وضع جانبي مع توجيه المنطقة الزمنية اليمنى لأعلى. حافظ على درجة حرارة المستقيم عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تدفئة (35 درجة مئوية) ومصباح حراري يتم التحكم فيه بواسطة منظم درجة الحرارة (انظر جدول المواد).
- حلق مساحة السطح بين العين اليمنى والأذن ، وتطهير المنطقة الجراحية ثلاث مرات على الأقل باستخدام مسحات اليود والكحول.
2. جراحة MCAO
- افتح حزمة الأدوات المعقمة لجراحة MCAO. ارتداء قفازات معقمة وعمل شق جلدي 1 سم بين العين اليمنى والأذن اليمنى باستخدام مقص جراحي.
ملاحظة: راقب لون البشرة ودرجة حرارة الجسم والاستجابة لقرصة إصبع القدم كل 15 دقيقة. - تشريح اللفافة الكامنة بالملقط لكشف العضلات الصدغية والعضلات العضلية.
ملاحظة: احرص على عدم إتلاف الغدة النكفية. - استخدم الملقط للمس الجزء السفلي من العضلة الصدغية واكتشاف موقع القوس الوجني. اسحب بعناية فروع العصب الوجهي.
- استخدم طرف حلقة الكي ذات درجة الحرارة العالية (انظر جدول المواد) لقطع شق عرضي 5 مم على العضلة الصدغية.
- استخدم ملقطين لتشريح القوس الوجني الأساسي وكشف المفصل بين عظام الفك العلوي والعظام الوجنية.
- استخدم المقص لقطع جزء 3 مم من القوس الوجني وإزالته. افصل عضلة العضلة عن قاعدة الجمجمة.
ملاحظة: احرص على عدم كسر الجيب الحجاجي الخلفي والوريد الصدغي السطحي. - ضع أربعة مبعدات صغيرة موضوعة في اتجاهات مختلفة لكشف قاعدة الجمجمة القحفية ، مع سحب فروع العصب الثلاثي التوائم بشكل جانبي بواسطة ضامد واحد.
ملاحظة: يشير التلم الموجود على السطح الخارجي لقاعدة الجمجمة إلى موقع الشق الجانبي بين الفص الجبهي والصدغي. يقع MCA هنا (الشكل 2A) ، ويمكن رؤية جذعه وفروعه من خلال الجمجمة الرفيعة والشفافة (الشكل 2B). يوضح الشكل 2 أ علاقة هذا الشريان بالشرايين الدماغية الرئيسية الأخرى. - ضع قطرة محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.9٪ على الجمجمة فوق جذع MCA وبالقرب من فرع قشرة الأنف. استخدم مطحنة كهربائية لترقق الجمجمة حتى يظهر كسر صغير.
ملاحظة: لا تدفع المطحنة على الجمجمة ، لأنها قد تخترق الجمجمة وتصيب الشريان الأساسي. - استخدم طرف الملقط لرفع الجمجمة الرقيقة وإزالتها. بالنسبة للفئران الوهمية ، توقف هنا ، ولا تضغط على الشريان.
ملاحظة: يتم تشكيل نافذة مستطيلة صغيرة عبر جذع MCA. - ضع حلقة أحادية الخيط من الحرير الأسود المضفر أعلى MCA (الشكل 2C). أدخل 8-0 إبرة جراحية مجهرية لرفع جذع MCA ، وربط الخيط (انظر جدول المواد) تحت الإبرة ، مع ترك طرفي الإبرة أعلى عقدة حلقة خيط الحرير (الشكل 2 د).
- بالنسبة ل MCAO العابر ، شد عقدة الخيط الحريري قليلا أسفل الإبرة لمنع تدفق الدم الشرياني (الشكل 2E) ، الذي يمثل بداية MCAO.
- استخدم الملقط لتثبيت الخيط ، وقم بإزالة الإبرة ببطء في نهاية نقص التروية (على سبيل المثال ، 60 دقيقة أو أكثر).
ملاحظة: عند إزالة الإبرة ، تنزلق عقدة خيط الحرير من MCA ، ويتم إعادة تغذية الدماغ (الشكل 2F). - للحصول على MCAO دائم ، شد حلقة خيط الحرير بإحكام حول الشريان ، وقم بإزالة الإبرة. قطع وإزالة مواد خياطة الزائدة.
- ضع قطرة من 0.25٪ بوبيفاكايين على شق الجلد ، وقم بخياطة العضلات والجلد بشكل منفصل باستخدام خيوط من النايلون 6-0 بشكل متقطع (انظر جدول المواد). تطبيق مرهم مضاد حيوي على سطح شق الجلد.
ملاحظة: يمكن أيضا إغلاق شق الجلد بدبابيس معقمة أو غراء.
3. رعاية ما بعد الجراحة
- قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران لإيقاظ الماوس. افصل جهاز التنفس الصناعي عند استعادة التنفس التلقائي.
- انقل الماوس إلى غرفة الاسترداد (انظر جدول المواد) بدرجة حرارة متحكم فيها.
- قم بإخراج الماوس عند استعادة رد الفعل الصحيح ، أو يبدأ في التحرك.
- راقب الماوس عن كثب في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها ورطوبتها. أعد الماوس إلى قفص المنزل بعد أن يكتسب وعيا كاملا (فترة الاسترداد ~ 2 ساعة). تطبيق 5 ملغ/ كغ كاربروفين تحت الجلد يوميا لمدة 3 أيام.
4. تصوير تباين البقع بالليزر (LSCI)
- ستة و 24 ساعة بعد MCAO ، قم بتركيب الماوس المخدر على الإطار المجسم. حلق الجزء العلوي من الرأس ، وقم بتنظيفه بثلاث مسحات متناوبة من اليود والكحول.
ملاحظة: تم إجراء التخدير كما هو مذكور في الخطوة 1.3. يتم تنفيذ LSCI أيضا قبل MCAO. - قم بعمل شق جلدي في خط الوسط بطول 3 سم وقم بتشريح الجلد من الجمجمة. ضع أربعة مبعدات إبرة صغيرة لكشف الجزء العلوي من الجمجمة.
- حرك كاميرا الليزر المرقطة (انظر جدول المواد) فوق الرأس، واضبط تركيز الكاميرا. تخيل تدفق الدم الدماغي.
5. 2،3،5-ثلاثي فينيل تيترازوليوم كلوريد (TTC) تلطيخ
- تخدير الفأر بعمق باستخدام 5٪ إيزوفلوران في نهاية التجربة ، عادة في اليوم 1 أو 3 أو 28 بعد السكتة الدماغية. اضغط على الذيل للتأكد من عدم وجود استجابة للألم.
- قطع رأس الفأر باستخدام مقص جراحي وحصاد الدماغ. احتضان الدماغ في محلول ملحي بارد لمدة 20 دقيقة.
- ضع الدماغ في مصفوفة تقطيع الدماغ على الثلج وأسقط محلول ملحي بارد على الدماغ. قطع الدماغ إلى شرائح 1 مم باستخدام شفرات حلاقة رقيقة.
- اغمر شرائح الدماغ في نفس الاتجاه في طبق من محلول TTC 2٪ (انظر جدول المواد). الحفاظ على الطبق في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: تصبح أنسجة المخ الطبيعية حمراء وتبقى الأنسجة الإقفارية بيضاء. - نقل شرائح الدماغ إلى 10 ٪ الفورمالين لمدة 24 ساعة من التثبيت. تخيل شرائح الدماغ وقياس منطقة الاحتشاء.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
من خلال عرض مباشر تحت المجهر الجراحي ، يمكن التأكد بصريا من أن تدفق الدم MCA يتم حظره أثناء نقص التروية. أظهرت دراستنا السابقة انخفاضا بنسبة >80٪ في تدفق الدم في المنطقة الإقفارية باستخدام جهاز مراقبة دوبلر بالليزر6. من أجل تحديد تغيرات تدفق الدم بعد MCAO ، يمكن استخدام LSCI لمزيد من تأكيد الإهانة الإقفارية وإعادة التروية (الشكل 1). في الواقع ، في الشكل 3 أ ، لوحظ أن تدفق الدم قد انخفض في أراضي MCA الأيمن. بالنسبة ل MCAO العابر ، بعد إ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم إنشاء أول نموذج انسداد MCA عبر الجمجمة في الفئران في عام 198111،12 ، واستبدل بنموذج MCAO بدون استئصال الجمجمة في عام 19894. كان لانسداد MCA الأولي عبر الجمجمة مجال جراحي واسع ، بحيث تمت إزالة القوس الوجني بالكامل وسحب العضلات بشكل جانبي. تورمت الأنسجة المحلية بعد الجراحة ، مما تسبب في الإجهاد وانخفاض تناول الطعام للحيوانات. في نموذج MCAO المعدل عبر الجمجمة ، يكون الشق أقل توغلا ، ولا تتم إزالة سوى جزء صغير من القوس الوجني. يتم الكشف عن ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون كاثي غيج على دعمها التحريري. تم إنشاء أرقام المخطط مع BioRender.com. تم دعم هذه الدراسة بأموال من قسم التخدير (المركز الطبي بجامعة ديوك) ومنح المعاهد الوطنية للصحة (NS099590 و HL157354 و NS117973 و NS127163).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ بوبيفاكائين | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9٪ كلوريد الصوديوم | العناية المركزة الطبية | NDC 0990-7983-03 | |
| 2،3،5-كلوريد ثلاثي فينيلترازوليوم (TTC) ؛ | سيجما أو أي بائع | ||
| 20 G IV قسطرة | BD | 381534 | 20 GA 1.6 IN |
| 30 G إبرة | BD | 305106 | |
| 4-0 خياطة حريرية | Look | SP116 | خياطة حرير مضفر أسود |
| 8-0 مع إبرة | مسحات كحول Ethilon | 2822G | |
| BD | 326895 | ||
| صندوق تحريض التخدير | أي بائع | Pexiglass يصنعه ؛ | |
| طاحونة كهربائية | JSDA JD | 700 | |
| طرف حلقة كي بدرجة حرارة عالية | Bovie | AA03 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| جهاز مراقبة نضح دوبلر | بالليزر Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| مرهم العين زيوت التشحيم | Bausch + Lomb | 339081 | |
| مسبار | المستقيم للفأرPhysitemp | RET-3 | |
| أكسيد النيتروز | Airgas | UN1070 | |
| منظار الأذن | Welchallyn | 728 | 2.5 مم منظار الأذن المنظار بمثابة منظار حنجرة لتصور الحبال الصوتية في الفئران |
| Oxygen | Airgas | UN1072 | |
| Povidone-iodine | CVS | 955338 | |
| صندوق الاسترداد | Brinsea & nbsp ؛ | TLC eco | |
| Rimadyl (كاربروفين) | Zoetis | 6100701 | القابل للحقن 50 مجم / مل |
| كينت ساينتيك | رودنت جونيور | ||
| جهاز التحكم في درجة الحرارة | Physitemp | TCAT-2DF & nbsp ؛ | |
| مضاد حيوي ثلاثي وتخفيف الآلام | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| مبخر | RWD | R583S |
المراجع
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153(2022).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
- Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741(2020).
- Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
- Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646(2021).
- Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
- Li, X., et al. Beneficial effects of neuronal ATF6 activation in permanent ischemic stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 1016391(2022).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
