مقالة منهجية

تفاعل البلمرة المتسلسل وتهجين اللطخة النقطية للكشف عن Leptospira في عينات المياه

2.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65435

⸱

يونيو 14, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

في هذه المقالة

ملخص

في هذه الدراسة ، تم تصميم تطبيق نقطي للكشف عن Leptospira من الفصائل الرئيسية الثلاثة في عينات المياه. تسمح هذه الطريقة بتحديد الحد الأدنى من كميات الحمض النووي المستهدفة على وجه التحديد بواسطة مسبار يحمل علامة ديجوكسيجينين ، ويمكن اكتشافه بسهولة بواسطة جسم مضاد للديجوكسيجينين. هذا النهج هو أداة قيمة ومرضية لأغراض الفرز.

الملخص

اللطخة النقطية هي تقنية بسيطة وسريعة وحساسة ومتعددة الاستخدامات تتيح تحديد كميات قليلة من الحمض النووي المستهدف على وجه التحديد عن طريق تهجين المسبار في وجود الحمض النووي الناقل. يعتمد على نقل كمية معروفة من الحمض النووي إلى دعامة صلبة خاملة ، مثل غشاء النايلون ، باستخدام جهاز البقعة النقطية وبدون فصل كهربائي. تتميز أغشية النايلون بقدرة ربط الحمض النووي العالية (400 ميكروغرام / سم2) ، والقوة العالية ، وهي مشحونة بشكل إيجابي أو محايد. المسبار المستخدم عبارة عن جزء من ssDNA محدد للغاية من 18 إلى 20 قاعدة موسومة بالديجوكسيجينين (DIG). سوف يترافق المسبار مع الحمض النووي Leptospira . بمجرد تهجين المسبار مع الحمض النووي المستهدف ، يتم اكتشافه بواسطة جسم مضاد مضاد للديجوكسيجينين ، مما يسمح باكتشافه بسهولة من خلال انبعاثاته التي تم الكشف عنها في فيلم الأشعة السينية. سوف تتوافق النقاط ذات الانبعاث مع شظايا الحمض النووي ذات الأهمية. تستخدم هذه الطريقة وضع العلامات غير النظيرية للمسبار ، والتي قد يكون لها عمر نصف طويل جدا. عيب هذا الملصق المناعي القياسي هو حساسية أقل من تحقيقات النظائر. ومع ذلك ، يتم تخفيفه عن طريق اقتران تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ومقايسات البقع النقطية. يتيح هذا النهج إثراء التسلسل المستهدف واكتشافه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه كتطبيق كمي عند مقارنته بالتخفيف التسلسلي لمعيار معروف. يتم تقديم تطبيق لطخة نقطية للكشف عن Leptospira من الكتل الرئيسية الثلاثة في عينات المياه هنا. يمكن تطبيق هذه المنهجية على كميات كبيرة من المياه بمجرد تركيزها عن طريق الطرد المركزي لتقديم دليل على وجود الحمض النووي Leptospiral. هذه أداة قيمة ومرضية لأغراض الفحص العام ، ويمكن استخدامها للبكتيريا الأخرى غير القابلة للزراعة التي قد تكون موجودة في الماء ، مما يعزز فهم النظام البيئي.

المقدمة

داء البريميات في البشر ينشأ أساسا من مصادر بيئية1،2. يعد وجود Leptospira في البحيرات والأنهار والجداول مؤشرا على انتقال داء البريميات بين الحياة البرية الأليفة والمنتجة التي قد تتلامس في النهاية مع هذه المسطحات المائية1،3،4. علاوة على ذلك ، تم تحديد Leptospira في مصادر غير طبيعية ، بما في ذلك مياه الصرف الصحي والراكدة ومياهالصنبور 5,6.

Leptospira هي بكتيريا موزعة في جميع أنحاء العالم 7,8 ، وقد تم التعرف على دور البيئة في الحفاظ عليها ونقلها بشكل جيد. يمكن أن تعيش Leptospira في مياه الشرب تحت درجة الحموضة والمعادنالمتغيرة 9 ، وفي المسطحات المائيةالطبيعية 1. يمكنه أيضا البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة في الماء المقطر10 ، وتحت درجة حموضة ثابتة (7.8) ، قد يعيش حتى 152 يوما11. علاوة على ذلك ، قد تتفاعل Leptospira في اتحادات بكتيرية للبقاء على قيد الحياة في الظروف القاسية12,13. قد يكون جزءا من الأغشية الحيوية في المياه العذبة مع Azospirillum و Sphingomonas ، بل إنه قادر على النمو وتحمل درجات حرارة تتجاوز 49 درجة مئوية14,15. يمكن أن تتكاثر أيضا في التربة المشبعة بالمياه وتظل قابلة للحياة لمدة تصل إلى 379 يوما16 ، مما يحافظ على قدرتها على التسبب في المرض لمدة تصل إلى عام17,18. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن البيئة داخل المسطحات المائية وكيف يتم توزيعها داخلها.

منذ اكتشافها ، استندت دراسة جنس Leptospira إلى الاختبارات المصلية. لم يكن حتى القرن الحالي أن التقنيات الجزيئية أصبحت أكثر انتشارا في دراسة هذا spirochaete. نادرا ما تم استخدام اللطخة النقطية لتحديدها باستخدام (1) مسبار نظيري يعتمد على 16S rRNA وعلى تكرار تسلسل بسيط (ISSR) 19،20 ، (2) كاختبار مناعي قائم على الذهب النانوي لداء البريميات البشري المطبق على البول21 ، أو (3) كمقايسة قائمة على الأجسام المضادة لعينات بول الأبقار22. سقطت هذه التقنية في حالة إهمال لأنها كانت تستند في الأصل إلى تحقيقات نظيرية. ومع ذلك ، فهي تقنية معروفة جيدا ، إلى جانب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تسفر عن نتائج محسنة ، وتعتبر آمنة بسبب استخدام المجسات غير النظيرية. يلعب تفاعل البوليميراز المتسلسل دورا حاسما في إثراء الحمض النووي Leptospira عن طريق تضخيم جزء معين من الحمض النووي يمكن العثور عليه بكميات ضئيلة في العينة. خلال كل دورة PCR ، تتضاعف كمية جزء الحمض النووي المستهدف في التفاعل. في نهاية التفاعل ، تم ضرب amplicon بعامل أكثر منمليون 23. يصبح المنتج الذي يتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والذي غالبا ما يكون غير مرئي في رحلان الأغاروز الكهربائي ، مرئيا من خلال تهجين محدد باستخدام مسبار يحمل علامة DIG في البقعةالنقطية 24،25،26.

تقنية dot-blot بسيطة وقوية ومناسبة للعديد من العينات ، مما يجعلها في متناول المختبرات ذات الموارد المحدودة. تم استخدامه في مجموعة متنوعة من دراسات البكتيريا ، بما في ذلك (1) البكتيريا الفموية27 ، (2) أنواع العينات الأخرى مثل الطعام والبراز28 ، و (3) تحديد البكتيريا غير القابلة للزراعة29 ، غالبا بالاتفاق مع التقنيات الجزيئية الأخرى. من بين المزايا التي توفرها تقنية dot-blot ما يلي: (1) يتمتع الغشاء بقدرة ربط عالية ، قادرة على ربط أكثر من 200 ميكروغرام / سم2 من الأحماض النووية وما يصل إلى 400 ميكروغرام / سم2 ؛ (2) يمكن تفسير نتائج البقع النقطية بصريا دون الحاجة إلى معدات خاصة ، و (3) يمكن تخزينها بسهولة لسنوات في درجة حرارة الغرفة (RT).

تم تصنيف جنس Leptospira إلى مجموعات مسببة للأمراض ومتوسطة ورمية30,31. يمكن تحقيق التمييز بين هذه الفصائل بناء على جينات محددة مثل lipL41 و lipL32 و 16S rRNA. LipL32 موجود في الكتل المسببة للأمراض ويظهر حساسية عالية في مختلف الأدوات المصلية والجزيئية ، في حين أنه غائب في الأنواع الرمية21. يعرف جين التدبير المنزلي lipL41 بتعبيره المستقر ويستخدم في التقنيات الجزيئية32 ، بينما يستخدم جين 16S rRNA لتصنيفها.

يمكن تطبيق هذه المنهجية على كميات كبيرة من المياه بمجرد تركيزها بواسطة الطرد المركزي. يسمح بتقييم النقاط والأعماق المختلفة داخل الجسم المائي للكشف عن وجود الحمض النووي البريمي والمجموعة التي ينتمي إليها. هذه الأداة ذات قيمة لكل من أغراض الفحص البيئي والعام ويمكن استخدامها أيضا للكشف عن البكتيريا الأخرى غير القابلة للزراعة التي قد تكون موجودة في الماء.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل واللطخة النقطية ميسورة التكلفة تقنيا واقتصاديا لمجموعة واسعة من المختبرات ، حتى تلك التي تفتقر إلى معدات متطورة أو باهظة الثمن. تهدف هذه الدراسة إلى تطبيق اللطخة النقطية القائمة على الديغوكسيجينين لتحديد مجموعات Leptospira الثلاثة في عينات المياه التي تم جمعها من المسطحات المائية الطبيعية.

السلالات البكتيرية
تم تضمين اثني عشر Leptospira serovars (Autumnalis ، Bataviae ، Bratislava ، Canicola ، Celledoni ، Grippothyphosa ، Hardjoprajitno ، Icterohaemorrhagiae ، Pomona ، Pyrogenes ، Tarassovi ، و Wolffi) في هذه الدراسة. هذه المصل هي جزء من المجموعة في قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة ، كلية الطب البيطري وعلم ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك ، وتستخدم حاليا في اختبار التراص الدقيق (MAT).

تم استزراع جميع Leptospira serovars في EMJH ، وتم استخراج الحمض النووي الخاص بهم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية (انظر جدول المواد). تم استخدام مزيج الحمض النووي الجينومي من المصل الاثني عشر كعنصر تحكم إيجابي للزمرة المسببة للأمراض Leptospira . كعنصر تحكم إيجابي في مجموعة Leptospira الوسيطة ، تم تضمين الحمض النووي الجينومي من سلالة Leptospira fainei serovar Hurstbridge BUT6 ، وكعنصر تحكم إيجابي في مجموعة Leptospira saprophyte ، تم أيضا تضمين الحمض النووي الجينومي لسلالة Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc I.

تألفت الضوابط السلبية من بلازميد فارغ ، وحمض نووي من بكتيريا غير ذات صلة (Ureaplasma urealyticum ، والمكورات العنقودية الذهبية ، والبروسيلا المجهضة ، والسالمونيلا التيفية ، والشيغيلة البوجيدية ، والكلبسيلة الرئوية ، والراكدة البوماني ، والإشريكية القولونية) ، والمياه من درجة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتي كانت بمثابة تحكم غير قالب.

عينات المياه
تم جمع اثنتي عشرة عينة تجريبية باستخدام طريقة أخذ العينات الطبقية العشوائية من مركز بحوث Cuemanco البيولوجي وتربية الأحياء المائية (CIBAC) (19 ° 16' 54" شمالا 99 ° 6' 11" غربا). تم الحصول على هذه العينات على ثلاثة أعماق: سطحية ، 10 ، و 30 سم (الشكل 1 أ ، ب). لم تؤثر إجراءات جمع المياه على أي أنواع مهددة بالانقراض أو محمية. تم جمع كل عينة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. لجمع العينة ، تم غمر كل أنبوب برفق في الماء ، وملئه بالعمق المحدد ، ثم إغلاقه. تم الاحتفاظ بالعينات عند 22 درجة مئوية ونقلها على الفور إلى المختبر لمعالجتها.

تم تركيز كل عينة عن طريق الطرد المركزي في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 1.5 مل عند 8000 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تكررت هذه الخطوة حتى تم تركيز جميع العينات في أنبوب واحد ، والذي تم استخدامه بعد ذلك لاستخراج الحمض النووي (الشكل 1C).

figure-introduction-1
الشكل 1: تركيز عينات المياه بالطرد المركزي. أ: أحواض أخذ عينات المياه، ب: الجداول الطبيعية. (ج) معالجة عينات المياه القائمة على الطرد المركزي في خطوات متكررة عدة مرات حسب الحاجة (ن). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

استخراج الحمض النووي
تم عزل إجمالي الحمض النووي باستخدام مجموعة الحمض النووي الجينومي التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). تم استخلاص استخلاص الحمض النووي في 20 ميكرولتر من محلول الشطف ، وتم تحديد تركيز الحمض النووي بواسطة مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية عند 260-280 نانومتر ، وتخزينه عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

تضخيم PCR
كانت أهداف تفاعل البوليميراز المتسلسل هي جينات 16S rRNA و lipL41 و lipL32 ، والتي تحدد الحمض النووي من جنس Leptospira وتسمح بالتمييز بين المجموعات الثلاث: المسببة للأمراض ، والرمية ، والمتوسطة. استندت كل من البادئات وتصميمات المسبار إلى الأعمال السابقة لأحمد وآخرون ، وأزالي وآخرون ، وبورهي وآخرون ، وفايس وآخرون ، وبرانجر وآخرون 33،34،35،36،37. يتم وصف تسلسل كل مسبار وتمهيد وجزء مضخم في الجدول 1 ، ويتم توفير مواءمتها مع التسلسلات المرجعية في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3 والملف التكميلي 4 والملف التكميلي 5. يتم وصف كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل وظروف التدوير الحراري في قسم البروتوكول.

تم تصور منتجات التضخيم عن طريق الفصل الكهربائي على هلام أغاروز 1٪ في TAE (قاعدة 40 mM Tris ، و 20 mM حمض الخليك ، و 1 mM EDTA ؛ درجة الحموضة 8.3) ، عند 60 فولت لمدة 45 دقيقة مع الكشف عن بروميد الإيثيديوم ، كما هو موضح في الشكل التكميلي 1. تم استخدام الحمض النووي الجينومي الذي تم الحصول عليه من كل مصل بتركيزات تتراوح من 6 × 106 إلى 1 × 104 نسخ مكافئة جينومية (GEq) في كل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بناء على حجم جينوم L. interrogans (4 ، 691 ، 184 bp)38 ل Leptospira الممرضة ، حجم الجينوم ل L. biflexa (3 ، 956 ، 088 bp)39 ل Leptospira الرمية ، وحجم الجينوم لسلالة L. fainei serovar Hurstbridge BUT6 (4،267،324 bp) مع رقم الانضمام AKWZ00000000.2.

تم تقييم حساسية المجسات باستخدام الحمض النووي من كل مصل ممرض ، سلالة L. biflexa serovar Patoc Patoc I ، وسلالة L. fainei serovar Hurstbridge BUT6 في كل تجربة. لتقييم خصوصية اختبار PCR وتهجين البقع النقطية ، تم تضمين الحمض النووي من البكتيريا غير ذات الصلة.

الجدول 1: بادئات ومجسات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم المنتجات لتحديد الكتل المسببة للأمراض ، والخلايا الرمية ، والوسيطة من Leptospira. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

مقايسة تهجين البقعة النقطية
تسمى هذه التقنية اللطخة النقطية لأن الثقوب التي توضع فيها عينة الحمض النووي لها شكل نقطة ، وعندما يتم امتصاصها لتثبيتها في مكانها عن طريق الشفط الفراغي ، فإنها تكتسب هذا الشكل. تم تطوير هذه التقنية بواسطة Kafatos et al.40. تسمح هذه التقنية بالقياس شبه الكمي لليبتوسبيرا في كل عينة إيجابية لتفاعل البوليميراز المتسلسل. يتكون البروتوكول من تمسخ مع NaOH 0.4 M في درجة حرارة الغرفة ، والعينات التي تحتوي على Leptospira DNA من 30 نانوغرام إلى 0.05 نانوغرام ، المقابلة ل 6 × 106 إلى 1 × 104 leptospires ، يتم مسحها على غشاء نايلون بجهاز نقطية 96 بئرا. بعد التثبيت ، يرتبط الحمض النووي بالغشاء عن طريق التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية 120 مللي جول. يتم اقتران كل مسبار DNA مع digoxigenin-11 dUTP بواسطة خطوة تحفيز ترانسفيراز طرفية في نهاية 3 '(Digoxigenin هو ستيرويد نباتي تم الحصول عليه من Digitalis purpurea ، يستخدم كمراسل41). بعد التهجين الصارم لمسبار الحمض النووي المسمى (50 pmol) عند درجة حرارة محددة على الحمض النووي المستهدف ، يتم تصور هجين الحمض النووي من خلال تفاعل التلألؤ الكيميائي مع الجسم المضاد للفوسفاتيز القلوي المضاد للديجوكسيجينين المترافق تساهميا مع الركيزة CSPD. يتم التقاط التلألؤ عن طريق التعرض لفيلم الأشعة السينية (الشكل 2).

figure-introduction-2
الشكل 2: خطوات إجراء فحص PCR-dot-blot. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البروتوكول

1. إعداد العينة

  1. تركيز كل عينة ماء في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة ، عدة مرات حسب الحاجة ، لتركيز العينة في حجم 250 ميكرولتر.
  2. استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  3. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المحدد وفقا لمسبار اللطخة النقطية الذي سيتم استخدامه (الجدول 1).
    1. إجراء التضخيمات في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل مع الحجم النهائي 25 ميكرولتر تحتوي على 1 X buffer ، 2.5 وحدة من Taq polymerase ، 1 μM من كل التمهيدي ، 0.2 mM من كل dNTP ، 1.5 mM MgCl2 ، و 100 نانوغرام من الحمض النووي المستهدف من كل عينة ماء أو الحمض النووي الجيني المرجعي.
    2. قم ببرمجة تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز تدوير حراري وفقا لظروف الدورة الحرارية (الجدول 2).
    3. قم بتخزين التفاعلات في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  4. ضع 10 ميكرولتر من كل منتج PCR ليتم نشافه في بئر منفصل من لوحة 96 بئر.
  5. أضف 40 ميكرولتر من TE إلى كل بئر واخلطها عن طريق الماصة.
    ملاحظة: يمكن إغلاق اللوحة المكونة من 96 بئرا وتخزينها عند 4 درجات مئوية طوال الليل. اتبع الإرشادات الواردة في الملف التكميلي 6 لإعداد المخازن المؤقتة والحلول للبروتوكول. يوضح الشكل 3 خطوات تحضير العينة.

الجدول 2: ظروف التدوير الحراري PCR لجينات 16S و lipL41 و lipL32. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

figure-protocol-1
الشكل 3: تفاعل البوليميراز المتسلسل وإعداد العينة. بتطبيق بروتوكول PCR المحدد ، تم نقل منتج PCR إلى لوحة عيار ميكرو ، وأضيف 40 ميكرولتر من TE إلى كل بئر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تجميع جهاز بقعة نقطة

ملاحظة: يظهر تجميع جهاز البقعة النقطية في الشكل 4. أثناء الإجراء ، ارتد قفازات للتعامل مع المحاليل القلوية وحماية غشاء النايلون من التلوث.

figure-protocol-2
الشكل 4: تجميع جهاز اللطخة النقطية. يجب ترتيب ورق الترشيح وغشاء النايلون (المبلل مسبقا في 10 X SSPE) بالترتيب الصحيح. يجب تأمين التجميع بالبراغي بإحكام قبل تطبيق الفراغ. يجب غسل كل بئر باستخدام TE ، ويتم تحميل منتجات PCR في الآبار الخاصة بها. بعد نقل منتج PCR عبر الغشاء ، يتم غسل كل بئر مرة أخرى باستخدام TE ويترك ليجف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قطع غشاء النايلون (انظر جدول المواد) وورق الترشيح إلى صفائح بحجم 12 × 8.5 سم.
  2. بمناسبة الغشاء مع علامة دائمة.
  3. اصنع درجة بمقص على حافة واحدة للإشارة إلى الاتجاه الصحيح. استخدم العلامة لتذكر ترتيب العينة.
  4. بلل الغشاء وورق الترشيح بمحلول 10 × فوسفات الصوديوم الملحي EDTA (SSPE ؛ 3 M NaCl ، 0.2 M NaH2PO4 ، و 0.02 M EDTA ، pH 7.4) (ملف تكميلي 6). تعامل مع الغشاء بملقط نظيف وغير حاد.
  5. تجميع غرفة بقعة نقطة. أولا ، ورقة الترشيح ، تليها الغشاء فوق الختم البلاستيكي. ثبت الغطاء بالبراغي بطريقة عرضية.
  6. قم بتوصيل الغرفة بالمكنسة الكهربائية ، ضع 100 ميكرولتر من TE في كل بئر ، وأمسك الفراغ لمدة 1 دقيقة ، ثم أوقفه.
  7. قم بتشغيل الفراغ بسرعة منخفضة وقم بتحميل 50 ميكرولتر من كل عينة في البئر المقابلة على غشاء جهاز البقعة النقطية (بعد توزيع الغشاء المحدد مسبقا).
    ملاحظة: قم بتجانس كل عينة في لوحة بئر 96 ذات التراص الدموي قبل وضعها في غرفة اللطخة النقطية.
  8. السماح للفراغ لتجفيف الغشاء. إذا لزم الأمر ، اضغط على الحجرة برفق لتحرير الفقاعات في العينة.
  9. اغسل كل بئر عن طريق وضع 100 ميكرولتر من TE فيه بفراغ مستمر وتركه يجف.
    ملاحظة: بعد الانتهاء من النقل ، من الضروري أولا إيقاف تشغيل المضخة وفصلها. قد يؤدي عدم القيام بذلك إلى دخول الارتجاع إلى الجهاز. لا يحتاج الحمض النووي إلى خطوة تمسخ إذا تم استخدام غشاء نايلون موجب الشحنة ، ولكن في حالة استخدام دعم خامل آخر ، قد تكون هناك حاجة إلى خطوة ما قبل التمسخ وتمسخ قلوي41.

3. تمسخ الحمض النووي وتثبيته

ملاحظة: يوضح الشكل 5 إجراء تثبيت غشاء الحمض النووي.

figure-protocol-3
الشكل 5: إجراء تثبيت غشاء الحمض النووي. يتم تغيير طبيعة الحمض النووي في محلول قلوي. بعد ذلك ، يتم تحييده باستخدام 10 X SSPE ، ويتم تجفيف الغشاء. بعد ذلك ، يتم نقل الغشاء. يتم إعادة ترطيب الغشاء باستخدام 2 X SSPE ويتم تهجينه مسبقا طوال الليل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. احتضان الغشاء ب 0.4 M NaOH لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بموازنة الغشاء مع 10 X SSPE لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. جفف الغشاء عند 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  4. تضيء مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية 120 مللي جول لمدة 3 دقائق. تأكد من توجيه العينات ووجهها لأسفل نحو مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. في حالة استخدام رابط متشابك للأشعة فوق البنفسجية ، تأكد من أن العينات متجهة لأعلى وكرر هذه الخطوة مرتين.
    ملاحظة: يجب أن يكون الغشاء جافا تماما قبل التشابك مع الأشعة فوق البنفسجية. يجمد الحمض النووي (DNA) بواسطة رابطة تساهمية بغشاء النايلون. يستغرق كل ربط متقاطع حوالي 18 بوصة إلى 1 بوصة مع جرعة تشعيع مثالية للأشعة فوق البنفسجية ، لمعظم تجارب التهجين ، تبلغ حوالي 0.6-0.8 كيلو جول / م2.
    التعرض للأشعة فوق البنفسجية ضار للعينين والجلد. ارتد معدات الحماية المناسبة وتجنب التعرض للجلد العاري.
  5. اغسل الغشاء ب 2 × SSPE لمدة 10 دقائق.
  6. قم بطي الغشاء بعناية وأدخله في أنبوب التهجين (استخدم أنبوب طرد مركزي صغير سعة 15 مل).
  7. أضف 10 مل من محلول ما قبل التهجين (الملف التكميلي 6) إلى الأنبوب واحتضانه عند 42 درجة مئوية طوال الليل. تأكد من أن الأنبوب قد تم إغلاقه بشكل صحيح لمنع أي تسرب.

4. التهجين

  1. قم بإزالة 5 مل من محلول ما قبل التهجين من أنبوب التهجين. لاستخدام 5 مل للمرة الثانية ، احتفظ بها في أنبوب آخر وقم بتخزينها في -4 درجة مئوية.
  2. أضف 15 ميكرولتر من المسبار المسمى (الجدول 1) إلى أنبوب التهجين. اشطف الطرف في المحلول للتأكد من غرس المسبار المسمى جيدا في التخفيف.
    ملاحظة: ارتباط مسبار الحمض النووي ليس قويا مثل ارتباط المستضد بالجسم المضاد. ومن ثم، يمكن أن تؤثر التغيرات في تركيز المسبار أو الحمض النووي في العينة على شدة التألق المنبعث. مجسات الحمض النووي متكافئة ، مما يعني أن عدد جزيئات المسبار المرتبطة بالحمض النووي يعادل عدد جزيئات الحمض النووي الموجودة في المحلول. يوضح الشكل 6 تهجين المسبار.
  3. احتضان في 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. أداء وضع العلامات DIG التحقيق الحمض النووي. اتبع التعليمات المحددة في الجدول 3 لخلط الكواشف ، ثم احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، أضف 80 ميكرولتر من الماء المقطر وقم بتخزين المسبار ذي الذيل عند 4 درجات مئوية.

figure-protocol-4
الشكل 6: تهجين المسبار. يتم ضبط حجم المخزن المؤقت للتهجين ، ويتم دمج المسبار المسمى ديجوكسيجينين للسماح بتهجين المسبار بين عشية وضحاها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 3: الكواشف لوسم المجسات بالديجوكسيجينين (DIG). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

5. التلألؤ الكيميائي (وضع العلامات المضادة للحفر)

  1. اغسل الغشاء مرتين باستخدام 2 × SSPE / 0.1٪ SDS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  2. احتضان الغشاء ب 5 × SSPE / 0.1٪ SDS عند درجة حرارة التلدين للمسبار لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، استخدم وعاءا بغطاء للحفاظ على درجة الحرارة لأطول فترة ممكنة. ضمان درجة حرارة موحدة وثابتة عبر الغشاء. الحجم التقريبي في كل غسلة هو 100 مل من المحلول المشار إليه.
  3. اغسل الغشاء مرة واحدة باستخدام المخزن المؤقت 1 (الملف التكميلي 6) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. اغسل الغشاء مرة واحدة باستخدام Buffer 2 (الملف التكميلي 6) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. اغسل الغشاء باستخدام Buffer 2 وأضف الجسم المضاد للديجوكسيجينين (15 ميكرولتر) (انظر جدول المواد) ، ثم احتضانه لمدة 45 دقيقة (قد يختلف وقت الحضانة من 30-60 دقيقة). يقوم هذا الجسم المضاد الثانوي بوضع علامات على المسبار لاكتشافه.
    ملاحظة: يمكن تخزين الغشاء في المخزن المؤقت 2 مع الجسم المضاد للديجوكسيجينين طوال الليل عند 4-8 درجة مئوية. تم تصوير العلامات المضادة للحفر لعملية التلألؤ الكيميائي في الشكل 7.

figure-protocol-5
الشكل 7: وضع علامات مضادة للحفر لعملية التلألؤ الكيميائي. تتم إزالة الأحماض النووية غير المرتبطة بمحلول عازل. يتم محاذاة المسبار مع الحمض النووي المستهدف ، ويتم إزالة الفائض. يتم حظر الغشاء باستخدام المخزن المؤقت 1 X المانع ، ويتم إضافة الجسم المضاد المضاد ل DIG (1: 10000). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. التلألؤ الكيميائي (تطبيق الركيزة)

  1. اغسل الغشاء مرتين في المخزن المؤقت 1 في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  2. اغسل مرة واحدة في المخزن المؤقت 3 (انظر الملف التكميلي 6) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، مما يسمح للغشاء بتصريف معظم المخزن المؤقت ، مما يجعله جافا تقريبا.
  3. أضف CSPD جاهزا للاستخدام (ثنائي الصوديوم 3- (4-ميثوكسي سبيرو {1،2-ديوكسيتان-3،2′-(5′-كلورو) ثلاثي سيكلو [3.3.1.13,7] عشر}-4-يل) فوسفات الفينيل ، انظر جدول المواد) ، واتركه لمدة 5 دقائق ، (بأصابع مبللة تجانس CSPD من جانب إلى آخر).
  4. ضع الغشاء في كيس بلاستيكي شفاف (12.5 × 9 سم) يناسب أبعاد الغشاء. قم بإزالة فقاعات الهواء بعناية ، وقم بتوزيع CSPD بالتساوي ، وأغلق الكيس بالحرارة.
  5. احتضان الغشاء في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (يمكن أن يصل إلى 30 دقيقة) ، وتأكد من وضع الغشاء مع العينات لأسفل بحيث يتم غمره جيدا. تأكد من أن درجة الحرارة تظل ثابتة وموزعة بشكل جيد على الغشاء.
  6. قم بتجفيف الكيس البلاستيكي وتثبيته بشريط سكوتش على فيلم إشعاعي مستخدم بالفعل. سيسمح ذلك بالتعامل السهل أثناء إجراء التعرض.
    ملاحظة: يوضح الشكل 8 تطبيق الركيزة لعملية التلألؤ الكيميائي.

figure-protocol-6
الشكل 8: تطبيق الركيزة لعملية التلألؤ الكيميائي. تتم إزالة الجسم المضاد الحر ، ويضاف الركيزة CSPD (1: 250) إلى الغشاء. يتم تنشيط التفاعل عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية ويتم ترتيب الغشاء لتسجيل التلألؤ الكيميائي في فيلم الأشعة السينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. التلألؤ الكيميائي (الكشف)

  1. تنفيذ إجراء التعرض. في الغرفة المظلمة ، قم بإعداد حلول المطور والمثبت (انظر جدول المواد) في الأدراج المعنية.
  2. في الظلام ، ضع الغشاء الثابت بعناية في مواجهة فيلم إشعاعي جديد وأدخله في شريط تصوير شعاعي (انظر جدول المواد).
  3. سجل وقت التعرض. قد يختلف وقت التعرض من 1 دقيقة إلى 30 دقيقة أو أكثر. ابدأ ب 5 دقائق واضبط الوقت وفقا لذلك.
  4. بلل فيلم الأشعة السينية في محلول المطور لمدة 1-3 دقائق واشطفه برفق بماء الصنبور (15-45 ثانية).
  5. بلل فيلم الأشعة السينية في محلول المثبت لمدة 1-3 دقائق واشطفه برفق بماء الصنبور (45 ثانية).
  6. اترك فيلم الأشعة السينية يجف في الهواء ووثق الفحص في صندوق ضوئي أبيض مرئي.
    ملاحظة: تجنب هز الغشاء أثناء وقت التعرض للأشعة السينية. عملية الكشف موضحة في الشكل 9.
  7. انتقل إلى تفسير النتيجة. في فيلم الأشعة السينية المكشوف ، يمكن تحديد موقع النقاط ذات الانبعاث بصريا وتتوافق مع شظايا الحمض النووي مع تهجين المسبار. تعتمد شدة الإشارة المنبعثة على التلألؤ ومدة التعرض.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأغشية جافة بين ورق الترشيح لعدة أشهر في درجة حرارة الغرفة.

figure-protocol-7
الشكل 9: الكشف عن عملية التلألؤ الكيميائي. في ظل الظروف المظلمة ، يتعرض الغشاء لفيلم الأشعة السينية داخل شريط الأشعة السينية. بعد ذلك ، سمح له بالوقوف خلال وقت المعرض ، ثم تم تطوير فيلم الأشعة السينية وإصلاحه. أخيرا ، تم تجفيفه بالهواء وتفسيره. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

8. إجراء إزالة التهجين الغشائي

  1. اغسل الغشاء مرتين لمدة 10 دقائق بالماء المقطر.
  2. اغسل الغشاء لمدة 20 دقيقة باستخدام 0.4 M NaOH عند 53 درجة مئوية (مرتين).
  3. اغسل الغشاء مرتين لمدة 10 دقائق باستخدام 2 × SSPE.
  4. اترك الغشاء يجف في درجة حرارة الغرفة.
  5. الحفاظ على الغشاء والعودة إلى الخطوة 3.5 من البروتوكول.
    ملاحظة: يمكن تخزين الغشاء في المخزن المؤقت قبل التهجين طوال الليل عند 4-8 درجة مئوية. في اليوم التالي ، أعد التشغيل مع حضانة عند 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، مما يسمح للمخزن المؤقت قبل التهجين بالوصول إلى درجة الحرارة. ثم انتقل إلى الخطوة 3.5 من البروتوكول.

النتائج

لتقييم فعالية هذه التقنية ، تم استخدام الحمض النووي الجينومي من الثقافات النقية لكل Leptospira serovar ، جنبا إلى جنب مع المسبار الخاص بالكليد. تم تحضير الأغشية ب 100 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي لكل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل مصل ، تليها ثمانية حمض نووي جينومي للبكتيريا غير ذات الصلة وتركيزات متغيرة من الحمض النووي الجينومي ل Leptospira serovars المخصصة. تضمن كل اختبار تحكما إيجابيا وسالبا وغير قالب. لم يظهر هذا الحمض النووي الجينومي غير المرتبط تقاربا لتحقيقات اللطخة النقطية. يظهر توزيع الغشاء وأغشية البقع النقطية في الشكل التكميلي 2 ، الشكل التكميلي 3 ، الشكل التكميلي 4 ، الشكل التكميلي 5 ، الشكل التكميلي 6 ، الشكل التكميلي 7. فيما يتعلق بزمرة الخلايا الرمية ، باستخدام DB_Saproprobe مع منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل البالغ 1059 نقطة أساس مضخم بالبادئات DB_16S PathoREVو DB_16SPathoFWD ، ومنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل البالغ 517 نقطة أساس مضخم بالبادئات DB_16SSapREV و DB_16SSapFWD مع الحمض النووي الجينومي لسلالة Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc I ، كان من الممكن اكتشاف ما بين 0.05-0.1 نانوغرام من الحمض النووي للخلايا الرمية (الشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3). وبالمثل ، للكشف عن المجموعة الوسيطة ، باستخدام DB_Interprobe مع منتج PCR البالغ 1059 bp المضخم مع الاشعال DB_16S PathoREVو DB_16SPathoFWD ، ومنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل 299-301 bp المضخم مع البادئات DB_16SInterREV و DB_16SInterFWD مع الحمض النووي الجينومي لسلالة Leptospira fainei serovar Hurstbridge BUT6 (الشكل التكميلي 4 والشكل التكميلي 5) ، كان من الممكن اكتشاف حوالي 0.1 نانوغرام من الحمض النووي الوسيط. وبالمثل ، بالنسبة للمجموعة المسببة للأمراض التي تستخدم DB_16SPathoprobe مع منتج PCR البالغ 1059 bp الذي تم تضخيمه بواسطة البادئات DB_16S PathoREVو DB_16SPathoFWD ، أو DBlipL41probe مع منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل البالغ 479 نقطة أساس مضخمة بواسطة البادئات DB_lipL41REV و DB_lipL41FWD مع مزيج الحمض النووي الجينومي من Leptospira serovars المسببة للأمراض ، كان من الممكن الكشف عن تركيزات الحمض النووي التي تتراوح بين 0.3-0.6 نانوغرام من الحمض النووي الممرض (الشكل التكميلي 6 والشكل التكميلي 7).

يمكن استخدام المقايسات المصممة لتحديد الفصائل الثلاث بشكل فردي لكل قطعة. ومع ذلك ، في حالة العينات القيمة والنادرة ، يمكن تحضير غشاء واحد باستخدام مواد أولية DB_16SPathoREV و DB_16SPathoFWD ، والتي تضخم منتج 1058-1069 bp. يمكن بعد ذلك تهجين هذا المنتج مع DB_Interprobe و DB_Saproprobe و DB_16SPathoprobe بشكل فردي ، مع خطوة إزالة التهجين (الخطوة 8) قبل كل واحد منهم. يسمح هذا النهج بتحديد جميع الكتل في نفس الغشاء.

في عينات المياه الميدانية ، تم تطبيق بروتوكول مسبار lipL32. تم استخدام الحمض النووي لكل عينة ماء بتركيز 100 نانوغرام لكل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. بالإضافة إلى ذلك ، تم تضمين التحكم في بروتوكول استخراج الحمض النووي ، والذي يتكون من ارتفاع 100 نانوغرام من الحمض النووي الجيني Leptospira في عينة ماء مقطر 15 مل. كما تم تضمين الضوابط السلبية والإيجابية (الشكل 10).

الجدول 4: وصف عينات المياه وعمقها. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

figure-results-1
الشكل 10: مقايسة اللطخة النقطية لكل عينة ماء. (أ) التوزيع الغشائي و(ب) اللطخة النقطية DB_lipL32probe وحاصل الضرب (262 bp) من البادئات DB_lipL32REV و DB_lipL32FWD عينات المياه الحقلية. يظهر سطح البركة 3 نتيجة إيجابية ، ولكل من التحكم في بروتوكول الاستخراج والضوابط الإيجابية إشارة شديدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يظهر وصف عينة الماء في الجدول 4 ، ويظهر توزيع غشاء البقعة النقطية والصورة في الشكل 9. توضح النقطة A7 أن الحمض النووي البريمبي كان موجودا على سطح البركة 3. من أجل تحديد تركيز الحمض النووي الذي كان موجودا في البركة 3 ، تم إجراء فحص نقطي مع تركيزات الحمض النووي المعروفة لمزيج من Leptospira serovars ومسبار lipL32 (الشكل 11). تم تحضير الغشاء باستخدام الحمض النووي الجينومي الموزع من 100 نانوغرام إلى 1 × 10-13 نانوغرام في كل نقطة. كان الحد الأدنى للتركيز الذي يمكن اكتشافه بلا شك حوالي 0.3 نانوغرام ، وهو ما يعادل 6 × 105 GEq في عينات المياه.

figure-results-2
الشكل 11: مقايسة اللطخة النقطية بتركيزات الحمض النووي المعروفة لمزيج من Leptospira serovars ومسبار lipL32. أ: التوزيع الغشائي و (ب) اللطخة النقطية ل DB_lipL32probe وناتج (262 bp) من البادئات DB_lipL32REV و DB_lipL32FWD مع التخفيفات (1: 2) لمزيج الحمض النووي الجينومي من Leptospira serovars المسببة للأمراض. يمكن اكتشاف إشارة المسبار بسهولة وصولا إلى 3.91 × 10-1 نانوغرام من مزيج الحمض النووي Leptospira . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: منتجات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المصورة عن طريق الفصل الكهربائي. حارة 1. علامة الوزن الجزيئي 100 bp سلم الحمض النووي. حارة 2. PCR على أساس الجين lipL32 مع مزيج الحمض النووي Leptospira المسببة للأمراض كقالب ؛ حارة 3. PCR على أساس الجين lipL41 مع مزيج الحمض النووي Leptospira المسببة للأمراض كقالب ؛ حارة 4. PCR على أساس الجين 16S rRNA مع مزيج الحمض النووي Leptospira الممرض كقالب ؛ حارة 5. PCR على أساس جين 16S rRNA مع الاشعال DB_16SSapREV و DB_16SSapFWD ، وسلالة Leptospira biflexa serovar Patoc I DNA كقالب ؛ حارة 6. PCR على أساس جين 16S rRNA مع الاشعال DB_16SPathoREV و DB_16SPathoFWD ، وسلالة Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc DNA كقالب ؛ حارة 7. PCR على أساس جين 16S rRNA مع البادئات DB_16SInterREV و DB_16SInterFWD ، و Leptospira fainei ، سلالة سيروفار هيرستبريدج BUT6 DNA كقالب ؛ حارة 8. يعتمد تفاعل البوليميراز المتسلسل على جين 16S rRNA مع البادئات DB_16SPathoREV و DB_16SPathoFWD ، و Leptospira fainei ، سلالة سيروفار هيرستبريدج BUT6 DNA كقالب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: (أ) التوزيع الغشائي و (ب) البقعة النقطية ل DB_Saproprobe وحاصل ضرب (1059 bp) من البادئات DB_16SPathoREV و DB_16SPathoFWD للحمض النووي الجينومي ل Leptospira biflexa serovar Patoc ، Patoc I. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: (أ) التوزيع الغشائي و (ب) اللطخة النقطية DB_Saproprobe مع حاصل ضرب (517 نقطة أساس) من البادئات DB_16SSapREV و DB_16SSapFWD للحمض النووي الجينومي ل Leptospira biflexa serovar Patoc ، Patoc I. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: (أ) توزيع الغشاء و (ب) البقعة النقطية DB_Interprobe مع ناتج (1059 bp) من البادئات DB_16SPathoREV و DB_16SPathoFWD والحمض النووي الجينومي لسلالة Leptospira fainei serovar Hurstbridge BUT6. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: (أ) توزيع الغشاء و ب) اللطخة النقطية ل DB_Interprobe والمنتج (299-301 bp) من البادئات DB_16SInterREV و DB_16SInterFWD مع الحمض النووي الجينومي لسلالة Leptospira fainei serovar Hurstbridge BUT6. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: (أ) التوزيع الغشائي و (ب) اللطخة النقطية لمسبار DB_16SPathoprobe والمنتج (1059 bp) من البادئات DB_16SPathoREV و DB_16SPathoFWD مع مزيج الحمض النووي الجينومي من Leptospira serovars المسببة للأمراض. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 7: (أ) التوزيع الغشائي و (ب) البقعة النقطية DB_lipL41probe مع ناتج (479 bp) من الأعداد الأولية DB_lipL41REV و DB_lipL41FWD مع مزيج الحمض النووي الجينومي من Leptospira serovars المسببة للأمراض. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: محاذاة أنواع Leptospira الرمية مع البادئات والمسبار بناء على تسلسل الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 16. يتم تمييز الاشعال بالخط العريض والأسود لتحديد هويتها ، مع الإشارة إلى اتجاهها بواسطة أسهم سوداء. يشار إلى المسبار بالخط العريض ومظلل باللون الرمادي ، ويتم تمييز موضعه بخط رمادي. يتم تمييز التسلسلات المحاذية باللون الرمادي الفاتح ، بينما تكون التسلسلات غير المقابلة بالأبيض والأسود. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: محاذاة أنواع Leptospira الوسيطة مع البادئات والمسبار بناء على تسلسل الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 16S . يتم تمييز الاشعال بالخط العريض والأسود لتحديد هويتها ، مع الإشارة إلى اتجاهها بواسطة أسهم سوداء. يشار إلى المسبار بالخط العريض ومظلل باللون الرمادي ، ويتم تمييز موضعه بخط رمادي. تظهر التسلسلات المحاذية باللون الرمادي الفاتح ، بينما تظهر التسلسلات غير المقابلة بالأبيض والأسود. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: محاذاة أنواع Leptospira المسببة للأمراض مع البادئات والتحقيق بناء على تسلسل جين lipL32. يتم تمييز الاشعال بالخط العريض والأسود لتحديد هويتها ، مع الإشارة إلى اتجاهها بواسطة أسهم سوداء. يشار إلى المسبار بالخط العريض ومظلل باللون الرمادي ، ويتم تمييز موضعه بخط رمادي. تظهر التسلسلات المحاذية باللون الرمادي الفاتح ، بينما تظهر التسلسلات غير المقابلة بالأبيض والأسود. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: محاذاة أنواع Leptospira المسببة للأمراض مع البادئات والمسبار بناء على تسلسل جين lipL41. لتحديد هويتهم ، تكون البادئات بالخط العريض ومظللة باللون الأسود ، مع الإشارة إلى اتجاهها بواسطة أسهم سوداء. يشار إلى المسبار بالخط العريض ومظلل باللون الرمادي الداكن ، ويتم تمييز موضعه بخط رمادي. تكون التسلسلات المحاذية باللون الرمادي الفاتح ، بينما تكون التسلسلات غير المقابلة بالأبيض والأسود. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: محاذاة أنواع Leptospira مع الاشعال التي تستهدف تسلسل الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 16S ومجسات الأنواع الرمية والمتوسطة والمسببة للأمراض. لتحديد هويتهم ، يشار إلى الاشعال بالخط العريض ويتم تمييزه باللون الأسود ، مع تحديد اتجاههم بأسهم سوداء. يشار إلى المجسات بالخط العريض ومظللة باللون الرمادي ، مع تمثيل مواقعها بخطوط رمادية. تكون التسلسلات المحاذية باللون الرمادي الفاتح ، والتسلسلات غير المناظرة باللونين الأبيض والأسود. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: المخازن المؤقتة والحلول لمقايسة اللطخة النقطية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تشمل الخطوات الحاسمة لتقنية اللطخة النقطية (1) تجميد الحمض النووي ، (2) حجب مواقع الارتباط الحرة على الغشاء بالحمض النووي غير المتماثل ، (3) التكامل بين المسبار والجزء المستهدف في ظل ظروف التلدين ، (4) إزالة المسبار غير المهجن ، و (5) الكشف عن جزيء المراسل41.

يحتوي PCR-Dot-blot على قيود معينة ، مثل أن التقنية لا توفر معلومات حول حجم الجزء المهجن37 ، فهي تتطلب إزالة التهجين من غشاء واحد قبل إعادة التهجين باستخدام مسبار ثان أو ثالث ، وتتطلب وقتا وجهدا كبيرين للوصول إلى النتيجة النهائية.

أظهرت هذه التقنية اتساقا مع التقنيات الجزيئية الأخرى42,43 وتطبيقاتها. تم استخدام اللطخة النقطية العكسية ، و nanogold dot-blot21 ، و dot-ELISA42 للكشف عن جينات معينة في الكائنات الحية مثل Treponema44 و Borrelia burgdorferi45 و E. coli46 و Helicobacter pylori47 و Mycobacterium tuberculosis48,49 بناء على 16S rRNA29,43 ، وللكشف عن الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي للنبات الفيروسات41. حد الكشف (LOD) المعرف بأنه أدنى تركيز للكائنات الحية الدقيقة التي يمكن قياسها باستمرار وموثوقية بواسطة هذه التقنية50 ، تراوحت من 100 بيكوغرام (5 × 104 بكتيريا) ل H. pylori47 ، إلى خلية واحدة من B. burgdorferi في العينات السريرية45 ، و fg ، وهو أقل من خلية ، من M. السل48,49.

أحد الجوانب القيمة لهذه المنهجية المدمجة هو قدرتها على تمديد حد الكشف بأمر واحد ، والتغلب على النتائج السلبية الخاطئة بسبب حالتين للعينة قد تؤدي إلى نتائج غير متسقة: (1) عينات ذات حمض نووي غير كاف ، أو (2) تلوث العينة ، مما يسمح باكتشاف العينات الإيجابية بنسبة 100٪25،45،47،48،49. يتمتع PCR-Dot-blot بالقدرة على اكتشاف كميات أقل من المنتجات المضخمة مقارنة بتلك التي يمكن اكتشافها في الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، ويتجنب التلوث نتيجة لخطوات التضخيم الثانية ، كما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل وشبه المتداخل. هذه المزايا مهمة بشكل خاص عند العمل مع العينات البيئية التي تحتوي على شحنة بكتيرية منخفضة ، والتي قد تحتوي على مجموعة واسعة من المثبطات والحمض النووي من مصادر غير ذات صلة قد تتداخل مع التقنيات الجزيئية.

تشير الأعمال السابقة إلى أنه يمكن التعرف على leptospires بواسطة مجسات الحمض النووي الموسومة ب photobiotin التي تصل إلى LOD من 5 pg (5 × 103 leptospires) 51. تكتشف المجسات ذات العلامات DIG 0.1-1 pg (102 leptospires) ، بينما يكتشف 32مجسا يحمل علامة P 1-5 pg (750 إلى 1000 leptospires) 51 ، وتكتشف المجسات التي تحمل علامة البيوتين 5 pg (2500 leptospires) 52. علاوة على ذلك ، وصل 32مسبارا يحمل علامة P للرمية Leptospira إلى LOD يبلغ 1.95 نانوغرام و Leptospira الممرض ، 3.9 نانوغرام53. في هذه الدراسة ، تم إنشاء LODs مماثلة للمجموعات الثلاث. كان LOD للأنواع المسببة للأمراض حوالي 0.3 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي (6-8 × 104 GEq) (الشكل 11) ، وبالنسبة للأنواع الرمية والمتوسطة ، انخفض إلى 0.1 نانوغرام (2 × 104 GEq). والجدير بالذكر أن الأبحاث السابقة أجريت باستخدام ثقافات Leptospira النقية51 والأمصال من الهامستر الذهبي المصاب تجريبيا ، بهدف الكشف عن Leptospira54,55 الممرض ، وتطبيق تهجين الحمض النووي مع 32P المسمى كأداة لتحديد وتصنيف Leptospira56. تظهر هذه المجسات خصوصية عالية ولا تظهر تهجينا متبادلا مع الحمض النووي غير المتماثل من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى19،51،54،55،56،57 ، ويمكن أن تميز حتى بين الأنواع ذات الصلة الوثيقة مثل Leptonema57. وبالمثل ، في هذا العمل ، لم يلاحظ أي تهجين مع الحمض النووي غير المتماثل. على الرغم من أن المجسات غير النظيرية ليست حساسة مثل المجسات النظيرية58 أو التقنياتالأخرى 43 ، يمكن توقع أن تركيبة PCR-Dot-blot تسمح بزيادة تصل إلى عشرة أضعاف في الحساسية مقارنة بالتقنيات الأخرى القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كما هو موضح في الكشف عن الليشمانيا وفيروس الهربس البقري 4 (BHV4) 24,26.

من ناحية أخرى ، تم استخدام مقايسة اللطخة النقطية لتحديد Leptospira بشكل متكرر مع الأجسام المضادة ، ومؤخرا مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة كبديل لتشخيص البشر والحيوانات في عينات البول59،60،61،62. في هذه الدراسات ، تتم معالجة العينة مباشرة على الغشاء دون خطوات مسبقة ، وتستهدف الأجسام المضادة بروتينات سطح Leptospira محددة مرتبطة بالتسبب في المرض. على سبيل المثال ، يظهر Mab-Dot-blot ELISA حساسية وخصوصية عالية ، حيث يكتشف أقل من 1 ميكروغرام من التجانس البكتيري62. يمكن مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من مقايسة Mab-Dot-blot بمقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتي تحتوي عادة على LOD حوالي 103 leptospires / ml من البول أو 9.3 نانوغرام من Leptospira homogenate63. كمية الحمض النووي الجينومي التي يمكن تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي 100 خلية (500 fg من الحمض النووي)61. استخدمت هذه الدراسات السابقة ثقافات نقية أو عينات سريرية دون إجراءات إثراء وكانت موجهة نحو تشخيص أفضل. بالنظر إلى أن الفئران المصابة يمكن أن تفرز ما يصل إلى 107 leptospires / مل من البول64 ، ويمكن للكلاب أن تفرز ما بين 102 إلى 106 leptospires / mL من البول65 ، بمثابة مصادر تلوث للمسطحات المائية ، تتطلب العينات البيئية إثراء leptospiral. يسمح تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في المختبر للحمض النووي المستهدف قبل النشاف بتحسين حساسية الإجراء حتى عشرة أضعاف 52,55. عادة ، لن يتم تصور المنتج الذي يتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في نقطة النهاية في رحلان كهربائي لهلام الأغاروز ؛ ومع ذلك ، يصبح واضحا من خلال التهجين المحدد للمسبار المسمى DIG في البقعة النقطية.

في حين أن الكثير من الأبحاث حول Leptospira و leptospirosis قد ركزت على تشخيص الأمراض ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل عن بيئتها في المسطحات المائية وتوزيعها داخلها. تضيف تقنية PCR-Dot-blot إلى صندوق الأدوات لدراسة Leptospira وداء البريميات ، مما يوفر ميزة فحص عدد كبير من العينات وتسريع النتائج والتفسير. PCR-Dot-blot هي تقنية منخفضة التكلفة نسبيا وبسيطة وغير مشعة يمكنها استيعاب مجسات متعددة على غشاء واحد. إلى جانب ذلك ، فإنه يلغي الحاجة إلى معدات متطورة وسير عمل معقد ، والذي يمكن أن يمثل تحديا في الإعدادات المحدودة الموارد.

يكمن تأثير هذه الدراسة في تطبيقها المستقبلي لدراسة المسطحات المائية الكبيرة على أعماق مختلفة ، بالإضافة إلى المنافذ البيئية الأخرى وأنواع العينات ، بما في ذلك التربة والمياه الراكدة والبراز والدم والأنسجة.

في الختام ، يوضح هذا العمل تطبيق تقنية PCR-Dot-blot ، بناء على وضع علامات digoxigenin لتحقيقات الحمض النووي لتحديد الفصائل الثلاث داخل جنس Leptospira. تعمل هذه الطريقة على تبسيط عملية تحديد الهوية عن طريق تقليلها إلى خطوة تضخيم واحدة وتسمح إما بثلاث عمليات تهجين متزامنة أو ثلاث عمليات تهجين متتالية باستخدام غشاء واحد. تتشابه حدود الكشف التي تم تحقيقها باستخدام هذه التقنية مع تلك التي تم تحقيقها باستخدام المجسات المشعة53 ، مما يجعلها أداة قيمة لتحديد Leptospira في عينات المياه من المصادر الطبيعية. وبالتالي ، توفر هذه التقنية حساسية متزايدة وتوفر نتائج دقيقة ومتسقة عند تقييم العينات بكميات قليلة من الحمض النووي البكتيري. إنه بمثابة نهج بديل لدراسة ديناميات Leptospira في المسطحات المائية وقد يساعد في تقييم ومراقبة العينات البيئية الأوسع ، مما يساعد في تنفيذ التدابير الوقائية ضد انتقال هذه الكائنات الحية الدقيقة.

في حالة وجود صعوبات في هذه التقنية ، ضع في اعتبارك النقاط البارزة التالية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها: (1) إذا كانت النقاط ذات أشكال غير منتظمة ، فتحقق من إغلاق نظام التفريغ بإحكام بالعرض ثم كرر النقل. (2) في حالة كسر أنبوب التهجين أثناء الإجراء الليلي ، مما تسبب في فقدان الغشاء للمخزن المؤقت للتهجين ، راجع قسم "إجراء إزالة التهجين" وأعد تشغيل العملية. (3) إذا لم تكن هناك نقاط مرئية ، فلا تتخلص من الغشاء ؛ انتقل إلى قسم "إجراء إزالة التهجين" لتكرار خطوات التهجين. (3) إذا لوحظت مناطق بيضاء غير مستوية على فيلم الأشعة السينية المطور ، فتأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة أثناء عملية إغلاق الكيس. (5) إذا لوحظت مناطق سوداء غير متساوية على فيلم الأشعة السينية المطور ، فتأكد من أن CSPD قد تم توزيعه بالكامل باستخدام أصابع مبللة. (6) إذا أظهر فيلم الأشعة السينية ظلال النقاط ، فتأكد من عدم تحريك الفيلم أثناء وقت التعرض.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نحن مدينون لمجموعة Leptospira التابعة لقسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة ، كلية الطب البيطري وعلم ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك. نحن ممتنون للتبرع السخي من سلالات Leptospira المرجعية. سلالة Leptospira fainei serovar Hurstbridge BUT6 و Leptospira biflexa serovar Patoc سلالة باتوك الأول للدكتور أليخاندرو دي لا بينيا موكتيزوما. نشكر الدكتور خوسيه أنطونيو أوكامبو سرفانتس ، منسق CIBAC ، والموظفين على دعمهم اللوجستي. كانت EDT في إطار برنامج مشروع المحطة الطرفية للطلاب الجامعيين في جامعة متروبوليتان المستقلة - الحرم الجامعي كواجيمالبا. ونقر بالبرنامج Biorender.com لإنشاء الأشكال 1 ومن 3 إلى 9.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > كواشف < / قوي >
طقم استخراج الحمض النووي PurelinkInvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (مجموعة البوليميراز PCR Taq End-Point) ورقPromegaM3001
Whatman ، درجة 1 ،Merk WHA1001325
، لفة مشحونة إيجابيا 30 سم × 3 مروش11417240001
Anti-Digoxigenin-AP ، شظايا Fab الأغنام متعددة النسيلة الأجسام المضادة الأوليةRoche11093274910
قاعدة متوسطة EMJHDifcoS1368JAA
Leptospira Enrichment EMJHDifcoBD 279510
كاشف حجبRoche11096176001
CSPD جاهز للاستخدام ثنائي الصوديوم 3- (4-ميثوكسيسيبيرو {1،2-ديوكسيتان-3،2 & رئيس ؛ - (5 & prime ؛ -chloro) tricyclo [3.3.1.13،7< / sup>] decan} 8< / sup>-4-yl) فوسفات فينيلميرك11755633001
حمض الديوكسي ريبونوكلييك من الرنجة المنويةSigma AldrichD3159
Developer CarestreamCarestream Health IncGBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTPRoche11363905910
EDTA ، ملح ثنائي الصوديوم (ثنائي الهيدرات) PromegaH5032
Ficoll 400Sigma AldrichF8016
Fixer CarestreamCarestream Health IncGBX 5158605
كبريتات اللوريل ملح الصوديوم (كبريتات دوديسيل الصوديوم. SDS) C12H2504SNaSigma AldrichL5750
N- Lauroylsarcosine ملح الصوديوم CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONaSigma AldrichL-9150هو مادة خافضة للتوتر السطحي أنيونية
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)Sigma AldrichPVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)Sigma Aldrich9005-64-5
كلوريد الصوديوم (NaCl)Sigma Aldrich7647-14-5
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)سيجما ألدريتش151-21-3
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)سيجما ألدريتش1310-73-2
القاعدة من فوسفات الصوديوم (NaH2< / sub>PO4) < / sub>Sigma-Aldrich7558-79-4
الطرفي ، المؤتلفRoche3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl) Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1Lيمكن أن يكون محلي الصنع بعد ملف تكميلي 6
بادئاتSigma-Aldrichعند الطلباتبع الجدول 1
مجساتSigma-Aldrichعند الطلباتبع الجدول 1
Equipment
Nanodrop & trade; مقياس الطيفالحراري العلميND-ONE-W
جهاز طرد مركزي دقيق مبرد Sigma 1-14K ، مناسب للطرد المركزي لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل عند 14,000 دورة في الدقيقةSigma-Aldrich1-14K
ماصات قابلة للتعديل مطهرة ، النطاق 2-20 وميكرو ؛ لتر ، 20-200 ومايكرو ؛ لجيلسونكود المنتج: F167360
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل يمكن التخلص منها (معقمة)AxygenMCT-150-SP
يمكن التخلص منها 600 وميكرو ؛ ل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (المعقمة)Axygen3208
أطراف الماصات التي يمكن التخلص منها 1-10 ومايكرو ؛ لAxygenT-300
أطراف ماصة يمكن التخلص منها 1-200 & مايكرو ؛ لجهاز AxygenTR-222-Y
Dot-Blot Bio-DotBIORAD1706545
صندوق شفط Hergom محمولHergom7E-A
(ضوء مرئي PH90-115V)HoeferPH90-115V
CrosslinkerHoeferUVC-500
Thermo Hybaid PCR Express ThermocyclerHybaidHBPX110
كاسيت التصوير الشعاعي مع لوحة IP14 × 17فوجي
ترشيح أغشية نايلون ثنائي النقل الضوئي

المراجع

  1. Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
  2. Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387, 65-97 (2015).
  3. Tripathy, D. N., Hanson, L. E. Leptospires from water sources at Dixon Springs Agricultural Center. Journal of Wildlife Diseases. 9 (3), 209-212 (1973).
  4. Smith, D. J., Self, H. R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water. The Journal of Hygiene. 53 (4), 436-444 (1955).
  5. Karpagam, K. B., Ganesh, B. Leptospirosis: a neglected tropical zoonotic infection of public health importance-an updated review. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 39 (5), 835-846 (2020).
  6. Casanovas-Massana, A., et al. Spatial and temporal dynamics of pathogenic Leptospira in surface waters from the urban slum environment. Water Research. 130, 176-184 (2018).
  7. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003898(2015).
  8. Mwachui, M. A., Crump, L., Hartskeerl, R., Zinsstag, J., Hattendorf, J. Environmental and behavioural determinants of Leptospirosis transmission: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003843(2015).
  9. Andre-Fontaine, G., Aviat, F., Thorin, C. Waterborne Leptospirosis: Survival and preservation of the virulence of pathogenic Leptospira spp. in fresh water. Current Microbiology. 71 (1), 136-142 (2015).
  10. Trueba, G., Zapata, S., Madrid, K., Cullen, P., Haake, D. Cell aggregation: A mechanism of pathogenic Leptospira to survive in freshwater. International Microbiology: the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology. 7 (1), 35-40 (2004).
  11. Smith, C. E., Turner, L. H. The effect of pH on the survival of leptospires in water. Bulletin of the World Health Organization. 24 (1), 35-43 (1961).
  12. Barragan, V. A., et al. Interactions of Leptospira with environmental bacteria from surface water. Current Microbiology. 62 (6), 1802-1806 (2011).
  13. Abdoelrachman, R. Comparative investigations into the influence of the presence of bacteria on the life of pathogenic and apathogenic leptospirae. Antonie van Leeuwenhoek. 13 (1), 21-32 (1947).
  14. Singh, R., et al. Microbial diversity of biofilms in dental unit water systems. Applied and Environmental Microbiology. 69 (6), 3412-3420 (2003).
  15. Kumar, K. V., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Coexistence and survival of pathogenic leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiology Ecology. 91 (6), 051(2015).
  16. Yanagihara, Y., et al. Leptospira Is an environmental bacterium that grows in waterlogged soil. Microbiology Spectrum. 10 (2), 0215721(2022).
  17. Gillespie, R. W., Ryno, J. Epidemiology of leptospirosis. American Journal of Public Health and Nation’s Health. 53 (6), 950-955 (1963).
  18. Bierque, E., et al. Leptospira interrogans retains direct virulence after long starvation in water. Current Microbiology. 77 (10), 3035-3043 (2020).
  19. Zhang, Y., Dai, B. Marking and detection of DNA of leptospires in the dot-blot and situ hybridization with digoxigenin-labeled probes. Journal of West China University of Medical Sciences. 23 (4), 353-435 (1992).
  20. Mérien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 30 (9), 2219-2224 (1992).
  21. Veerapandian, R., et al. Silver enhanced nano-gold dot-blot immunoassay for leptospirosis. Journal of Microbiological Methods. 156, 20-22 (2019).
  22. Junpen, S., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  23. Ishmael, F. T., Stellato, C. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology. 101 (4), 437-443 (2008).
  24. Boerner, B., Weigelt, W., Buhk, H. J., Castrucci, G., Ludwig, H. A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally. Journal of Virological Methods. 83 (1-2), 169-180 (1999).
  25. Curry, E., Pratt, S. L., Kelley, D. E., Lapin, D. R., Gibbons, J. R. Use of a Combined duplex PCR/Dot-blot assay for more sensitive genetic characterization. Biochemistry Insights. 1, 35-39 (2008).
  26. Pilatti, M. M., Ferreira, S. deA., de Melo, M. N., de Andrade, A. S. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Research in Veterinary Science. 87 (2), 255-257 (2009).
  27. Conrads, G., et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals. Journal of Periodontology. 67 (10), 994-1003 (1996).
  28. Langa, S., et al. Differentiation of Enterococcus faecium from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains by PCR and dot-blot hybridisation. International Journal of Food Microbiology. 88 (2-3), 197-200 (2003).
  29. Francesca, C., Lucilla, I., Marco, F., Giuseppe, C., Marisa, M. Identification of the unculturable bacteria Candidatus arthromitus in the intestinal content of trouts using dot-blot and Southern blot techniques. Veterinary Microbiology. 156 (3-4), 389-394 (2012).
  30. Arent, Z., Pardyak, L., Dubniewicz, K., Plachno, B. J., Kotula-Balak, M. Leptospira taxonomy: then and now. Medycyna Weterynaryjna. 78 (10), 489-496 (2022).
  31. Thibeaux, R., et al. Biodiversity of environmental Leptospira: Improving identification and revisiting the diagnosis. Frontiers in Microbiology. 9, 816(2018).
  32. Carrillo-Casas, E. M., Hernández-Castro, R., Suárez-Güemes, F., de la Peña-Moctezuma, A. Selection of the internal control gene for real-time quantitative RT-PCR assays in temperature treated Leptospira. Current Microbiology. 56 (6), 539-546 (2008).
  33. Azali, M. A., Yean Yean, C., Harun, A., Aminuddin Baki A, N. N., Ismail, N. Molecular characterization of Leptospira spp. in environmental samples from North-Eastern Malaysia revealed a pathogenic strain, Leptospira alstonii. Journal of Tropical Medicine. 2016, 2060241(2016).
  34. Ahmed, N., et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 5, 28(2006).
  35. Bourhy, P., Collet, L., Brisse, S., Picardeau, M. Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 64, 4061-4067 (2014).
  36. Weiss, S., et al. An extended Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), e0004996(2016).
  37. Branger, C., et al. Polymerase chain reaction assay specific for pathogenic Leptospira based on the gene hap1 encoding the hemolysis-associated protein-1. FEMS Microbiology Letters. 243 (2), 437-445 (2005).
  38. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  39. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLOS One. 3 (2), e1607(2008).
  40. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Research. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  41. Bhat, A. I., Rao, G. P. Dot-blot hybridization technique. Characterization of Plant Viruses. , Springer Protocols Handbooks. Humana, NewYork, NY. 303-321 (2020).
  42. Yadav, J. P., Batra, K., Singh, Y., Singh, M. Comparative evaluation of indirect-ELISA and Dot-blot assay for serodetection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae antibodies in poultry. Journal of Microbiological Methods. 189, 106317(2021).
  43. Malinen, E., Kassinen, A., Rinttilä, T., Palva, A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 149, 269-277 (2003).
  44. Wyss, C., et al. Treponema lecithinolyticum sp. nov., a small saccharolytic spirochaete with phospholipase A and C activities associated with periodontal diseases. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 1329-1339 (1999).
  45. Shah, J. S., I, D. C., Ward, S., Harris, N. S., Ramasamy, R. Development of a sensitive PCR-dot-blot assay to supplement serological tests for diagnosing Lyme disease. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 37 (4), 701-709 (2018).
  46. Niu, C., Wang, S., Lu, C. Development and evaluation of a dot-blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli. Folia microbiologica. 57 (6), 557-561 (2012).
  47. Wetherall, B. L., McDonald, P. J., Johnson, A. M. Detection of Campylobacter pylori DNA by hybridization with non-radioactive probes in comparison with a 32P-labeled probe. Journal of Medical Microbiology. 26 (4), 257-263 (1988).
  48. Kolk, A. H., et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. Journal of Clinical Microbiology. 30 (10), 2567-2575 (1992).
  49. Scherer, L. C., et al. PCR colorimetric dot-blot assay and clinical pretest probability for diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in smear-negative patients. BMC Public Health. 7, 356(2007).
  50. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  51. Zhang, Y., Dai, B. Detection of Leptospira by dot-blot hybridization with photobiotin- and 32P-labeled DNA. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 130-132 (1992).
  52. Terpstra, W. J., Schoone, G. J., ter Schegget, J. Detection of leptospiral DNA by nucleic acid hybridization with 32P- and biotin-labeled probes. Journal of Medical Microbiology. 22 (1), 23-28 (1986).
  53. Shukla, J., Tuteja, U., Batra, H. V. DNA probes for identification of leptospires and disease diagnosis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 35 (2), 346-352 (2004).
  54. Jiang, N., Jin, B., Dai, B., Zhang, Y. Identification of pathogenic and nonpathogenic leptospires by recombinant probes. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 26 (1), 1-5 (1995).
  55. Fach, P., Trap, D., Guillou, J. P. Biotinylated probes to detect Leptospira interrogans on dot-blot hybridization or by in situ hybridization. Letters in Applied Microbiology. 12 (5), 171-176 (1991).
  56. Huang, N., Dai, B. Assay of genomic DNA homology among strains of different virulent leptospira by DNA hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 122-125 (1992).
  57. Dong, X., Dai, B., Chai, J. Homology study of leptospires by molecular hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (1), 1-4 (1992).
  58. Komminoth, P. Digoxigenin as an alternative probe labeling for in situ hybridization. Diagnostic Molecular Pathology: The American Journal of Surgical Pathology, part B. 1 (2), 142-150 (1992).
  59. Saengjaruk, P., et al. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine. Journal of Clinical Microbiology. 40 (2), 480-489 (2002).
  60. Okuda, M., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein. The Journal of Veterinary Medical Science. 67 (3), 249-254 (2005).
  61. Suwimonteerabutr, J., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  62. Kanagavel, M., et al. Peptide-specific monoclonal antibodies of Leptospiral LigA for acute diagnosis of leptospirosis. Scientific reports. 7 (1), 3250(2017).
  63. Levett, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews. 14 (2), 296-326 (2001).
  64. Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. Proteomic analysis of Leptospira interrogans shed in urine of chronically infected hosts. Infection and Immunity. 76 (11), 4952-4958 (2008).
  65. Rojas, P., et al. Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 29 (10), 1305-1309 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DNA
تفاعل البلمرة المتسلسل وتهجين اللطخة النقطية للكشف عن Leptospira في عينات المياه
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.