يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نافذة مستقرة للتصوير داخل الجسم للبنكرياس الفئران

2.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65498

⸱

أكتوبر 6, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا للزرع الجراحي لنافذة بصرية مستقرة للتصوير بدقة تحت الخلوية لبنكرياس الفئران ، مما يسمح بإجراء دراسات تسلسلية وطولية للبنكرياس السليم والمريض.

الملخص

علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية للبنكرياس معقدة. أمراض البنكرياس ، مثل التهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس الغدي (PDAC) لها معدلات مراضة ووفيات عالية. التصوير داخل الجسم (IVI) هو تقنية قوية تمكن من التصوير عالي الدقة للأنسجة في كل من الحالات الصحية والمريضة ، مما يسمح بمراقبة ديناميكيات الخلية في الوقت الفعلي. يمثل IVI لبنكرياس الفئران تحديات كبيرة بسبب الطبيعة الحشوية العميقة والمتوافقة للعضو ، مما يجعله عرضة بشدة للتلف والتحف المتحركة.

الموصوفة هنا هي عملية زرع Stabilized Window للتصوير Intravital للفأر Pancreas (SWIP). يسمح SWIP ب IVI لبنكرياس الفئران في الحالات الصحية الطبيعية ، أثناء التحول من البنكرياس السليم إلى التهاب البنكرياس الحاد الناجم عن السيرولين ، وفي الحالات الخبيثة مثل أورام البنكرياس. بالاقتران مع الخلايا الموسومة وراثيا أو إعطاء الأصباغ الفلورية ، يتيح SWIP قياس ديناميكيات الخلية الواحدة وتحت الخلوية (بما في ذلك الخلية المفردة والهجرة الجماعية) بالإضافة إلى التصوير التسلسلي لنفس المنطقة ذات الاهتمام على مدار عدة أيام.

تعتبر القدرة على التقاط هجرة الخلايا السرطانية ذات أهمية خاصة لأن السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في PDAC هو العبء النقيلي الهائل. يعد فهم الديناميات الفسيولوجية للورم الخبيث في PDAC حاجة حرجة لم تتم تلبيتها وحاسمة لتحسين تشخيص المريض. بشكل عام ، يوفر SWIP استقرارا محسنا للتصوير ويوسع تطبيق IVI في البنكرياس السليم وأمراض البنكرياس الخبيثة.

المقدمة

من المحتمل أن تكون أمراض البنكرياس الحميدة والخبيثة مهددة للحياة ، مع وجود فجوات كبيرة في فهم الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بها. التهاب البنكرياس - التهاب البنكرياس - هو السبب الرئيسي الثالث لدخول المستشفيات وإعادة الدخول إلى المستشفى المرتبط بأمراض الجهاز الهضمي في الولايات المتحدة ويرتبط بالمراضة الكبيرة والوفيات والعبء الاجتماعي والاقتصادي1. يحتل سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) المرتبة الثالثة كسبب رئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان 2 ، ويمثل معظم الأورام الخبيثة في البنكرياس3 وينذر بمعدل بقاء ضعيف لمدة 5 سنوات يبلغ 11٪ فقط 2. السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في PDAC هو العبء النقيلي الساحق. لسوء الحظ ، فإن معظم المرضى يعانون من مرض النقيلي. لذلك ، فإن فهم ديناميكيات ورم خبيث في PDAC هو حاجة ماسة لم تتم تلبيتها في مجال أبحاث السرطان.

الآليات التي يقوم عليها الالتهاب والشلال النقيلي للبنكرياس غير مفهومة بشكل جيد. أحد المساهمين الرئيسيين في هذه الفجوة في المعرفة هو عدم القدرة على مراقبة ديناميكيات خلايا البنكرياس في الجسم الحي. تعد المراقبة المباشرة لهذه الديناميات الخلوية بالكشف عن أهداف مهمة للاستفادة من تشخيص وعلاج المصابين بأمراض البنكرياس وتحسينها.

التصوير داخل الجسم (IVI) هو تقنية مجهرية تسمح للباحثين بتصور ودراسة العمليات البيولوجية في الحية في الوقت الفعلي. يسمح IVI بالتصور المباشر عالي الدقة لديناميكيات داخل الخلايا والبيئة الدقيقة في الجسم الحي وداخل البيئة الأصلية للعملية البيولوجية المعنية. لذلك ، يسمح IVI في الجسم الحي بمراقبة العمليات الصحية والمرضية.

توفر طرق التصوير المعاصرة لكامل الجسم مثل التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني والتصوير المقطعي المحوسب مناظر ممتازة للأعضاء بأكملها ويمكن أن تكشف عن الأمراض ، حتى قبل ظهور الأعراض السريرية4. ومع ذلك ، فهي غير قادرة على تحقيق حل خلية واحدة أو الكشف عن المراحل المبكرة من مرض التهاب البنكرياس أو الورم الخبيث.

استخدمت الأبحاث السابقة دقة IVI أحادية الخلية لمراقبة الأمراض الحميدة والخبيثة للجلد 5,6 ، والثدي7 ، والرئة8 ، والكبد9 ، والدماغ 10 ، وأورام البنكرياس 11 ، مما أدى إلى رؤى حول آليات تطور المرض 12. ومع ذلك ، فإن بنكرياس الفئران يشكل عقبات كبيرة أمام تحقيق دقة الخلية الواحدة باستخدام IVI ، ويرجع ذلك أساسا إلى موقعه الحشوي العميق والامتثال العالي. علاوة على ذلك ، فهو عضو متفرع وموزع بشكل منتشر داخل المساريق يتصل بالطحال والأمعاء الدقيقة والمعدة ، مما يجعل الوصول إليه صعبا. كما أن الأنسجة حساسة للغاية للحركة الناتجة عن التمعج والتنفس المجاورين. يعد تقليل حركة البنكرياس أمرا ضروريا للفحص المجهري أحادي الخلية ، حيث يمكن للقطع الأثرية الحركية حتى بضعة ميكرونات أن تطمس الصور وتشوهها ، مما يجعل تتبع ديناميكيات الخلايا الفرديةمستحيلا 13.

لإجراء IVI ، يجب زرع نافذة تصوير البطن (AIW) جراحيا 9,11. لزرع AIW جراحيا ، يتم خياطة إطار نافذة معدني في جدار البطن. بعد ذلك ، يتم توصيل العضو محل الاهتمام بالإطار باستخدام لاصق cyanoacrylate. في حين أن هذا يكفي لبعض الأعضاء الداخلية الصلبة (مثل الكبد والطحال والأورام الصلبة) ، فإن محاولات تصوير بنكرياس الفئران السليم تتعرض للخطر بسبب الاستقرار الجانبي والمحوري دون المستوى الأمثل بسبب نسيج الأنسجة المتوافق والبنية المعقدة14. لمعالجة هذا القيد ، طور Park et al.14 نافذة تصوير مصممة خصيصا للبنكرياس الصحي. تقلل نافذة تصوير البنكرياس (PIW) من تأثير حركة الأمعاء والتنفس من خلال دمج رف معدني أفقي داخل إطار النافذة ، أسفل غطاء الغطاء مباشرة ، مما يؤدي إلى استقرار الأنسجة والحفاظ على ملامستها لزجاج الغطاء. بينما يوفر PIW ثباتا جانبيا متزايدا ، وجدنا أن هذه النافذة لا تزال توضح الانجراف المحوري وتمنع بالإضافة إلى ذلك تصوير الأورام الصلبة الكبيرة بسبب الفجوة الضيقة بين الرف المعدني وغطاءالغطاء 15.

لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير Stabilized Window للتصوير Intravital للفأر Pancreas (SWIP) ، وهي نافذة تصوير قابلة للزرع قادرة على تحقيق تصوير مستقر طويل الأمد لكل من البنكرياس السليم والمريض (الشكل 1) 15. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا للإجراء الجراحي المستخدم لزرع SWIP. على الرغم من أن الهدف الأساسي كان دراسة الآليات الديناميكية التي ينطوي عليها ورم خبيث ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لاستكشاف جوانب مختلفة من بيولوجيا البنكرياس وعلم الأمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة باستخدام الفقارية ، بما في ذلك الموافقة المسبقة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في كلية ألبرت أينشتاين للطب (IACUC).

1. تخميل النوافذ

ملاحظة: تخميل الفولاذ المقاوم للصدأ ينظف المعدن من الملوثات ويخلق طبقة أكسيد رقيقة تزيد بشكل كبير من التوافق الحيوي للمعدن مع الأنسجة الرخوة ، حتى بعد التيتانيوم16.

  1. ابدأ عملية التخميل عن طريق غسل إطارات النوافذ البصرية بمحلول منظف نشط إنزيميا بنسبة 1٪ (وزن / حجم).
  2. اغمر الإطارات في محلول هيدروكسيد الصوديوم 5٪ (وزن / حجم) عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة داخل وعاء زجاجي.
  3. أخرج الإطارات واشطفها بالماء منزوع الأيونات.
  4. اغمر الإطارات في محلول حامض الستريك بنسبة 7٪ (وزن / حجم) عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق داخل وعاء زجاجي جديد.
  5. قم بإزالة الإطارات وشطفها بالماء منزوع الأيونات مرة أخرى.
  6. كرر الخطوة 1.2 ، وأخيرا ، اشطف إطارات النوافذ بالماء منزوع الأيونات مرة أخيرة.

2. التحضير لزرع الورم أو جراحة النافذة

ملاحظة: لدراسات أورام البنكرياس ، يجب زرع الخلايا السرطانية والسماح لها بالنمو إلى أورام علنية. لتصور الخلايا السرطانية في الجسم الحي ، يوصى باستخدام الخلايا التي تم تغييرها وراثيا للتعبير عن البروتينات الفلورية مثل Dendra2. سيؤدي استخدام ملصقات البروتين الفلوري الساطعة إلى التخفيف من المشكلات المحتملة المتعلقة بالتألق الذاتي للأنسجة. تمت مناقشة البروتينات الفلورية المحتملة الأخرى والأصباغ ونماذج الفئران الفلورية المشفرة وراثيا التي يمكن استخدامها في مكان آخر17،18. لمنع تلوث مجال الجراحة ، قم بإجراء العملية الجراحية في غطاء محرك السيارة أو خزانة التدفق الصفحي وتأكد من استخدام مناطق مميزة للتحضير والجراحة والتعافي.

  1. قبل الجراحة ، قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف ، وإذا لزم الأمر ، استخدم معقم حبة ساخنة للإجراءات اللاحقة. تأكد من أن الجراحة تستخدم تقنية النصائح فقط.
  2. قم بتشغيل الوسادة الجراحية الساخنة ومعقم الخرزة وانتظر حتى تصل إلى درجة حرارة التشغيل المناسبة. يجب مراقبة درجة حرارة وسادة التسخين باستخدام مقياس حرارة سطحي لتجنب الحروق المحتملة. ضع قطعة قماش معقمة فوق وسادة التدفئة إذا كان لا يمكن التحكم في درجة الحرارة بشكل كاف.
    ملاحظة: تتأثر درجة حرارة الجسم أثناء الإجراءات القصيرة (≤20 دقيقة) ، مثل الورم وزرع النافذة ، بشكل ضئيل أثناء استخدام وسادة جراحية ساخنة. ومع ذلك ، تتطلب فترات التخدير الأطول ، مثل التصوير بفاصل زمني ممتد ، وضع الماوس في غرفة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
  3. تخدير الماوس مع 5 ٪ isoflurane في غرفة التخدير.
  4. خطوة حاسمة: خفض التخدير إلى 2٪ بمجرد أن يكون الفأر فاقدا للوعي. راقب بعناية مستوى التخدير والعناصر الحيوية للفأر (على سبيل المثال، باستخدام مقياس التأكسج النبضي)19.
  5. ضع قطرة صغيرة من مزلق العين على كل عين من عيون الفأر لمنع جفاف القرنية.
  6. قبل الجراحة ، ضع كريم مزيل الشعر بسخاء على الجزء العلوي الأيسر من البطن لإزالة الشعر. بعد 20 ثانية ، استخدم المناديل الورقية المبللة لمسح الشعر وكريم إزالة الشعر بإحكام. كرر العملية حسب الحاجة حتى تتم إزالة كل الشعر من منطقة الجراحة.
  7. حقن 10 ميكرولتر من البوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ) مخفف في 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحت الجلد لضمان تسكين ما قبل الجراحة.

3. زرع ورم البنكرياس

  1. تحضير حصص الخلايا السرطانية بالتركيز المطلوب (بناء على وقت مضاعفة الخلايا السرطانية). ضع معلق الخلية في حقنة الأنسولين واحتفظ بها على الجليد. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم 106 خلايا سرطانية متزامنة ل KPC 20 معلقة بحد أقصى 50 ميكرولتر من PBS ، باتباع بروتوكول الحقن التقويمي المقتبس من Erstad etal.21
    ملاحظة: هذا الخط الخلوي الذي يتم حقنه بهذا التركيز ينتج بشكل روتيني أوراما واضحة أو كبيرة بشكل مناسب لمدة 10-14 يوما. يجب تقييم النسخ الفرعية لهذا الخط الخلوي وخطوط خلايا البنكرياس الأخرى للحصول على التركيزات والجداول الزمنية المناسبة لإنتاج أورام ذات حجم مناسب).
  2. اغسل يديك باستخدام صابون مطهر.
  3. قبل كل عملية جراحية جديدة ، ارتد قفازات معقمة جديدة.
  4. نقل الماوس إلى غطاء جراحي معقم ووضعه في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن الجزئي.
  5. تأمين الأطراف مع شريط ورقي.
    ملاحظة: الاستخدام السليم للأدوات مهم طوال الإجراء. يتم عرض أمثلة على كيفية حمل الملقط ومقص Castroviejo وأداة التقاط الفراغ في الشكل 2A-C.
  6. تعقيم البطن بمطهر (الشكل 2 د).
  7. تأكد من تخدير بالكامل عن طريق إجراء اختبار قرصة إصبع القدم.
  8. قم بعمل شق تحت الضلع الأيسر 10-15 مم في الجلد باستخدام ملقط ومقص Castroviejo (الشكل 2E).
  9. السيطرة على الإرقاء باستخدام مسحات القطن أو قلم الكي عند / عند الضرورة.
  10. قسم العضلات الأساسية بعناية بالملقط ومقص Castroviejo لدخول الصفاق (الشكل 2F).
  11. باستخدام مسحات القطن المعقمة ، قم بإخراج البنكرياس والطحال بشكل غير مؤلم.
  12. قم بتحريك البنكرياس للخارج حتى لا تكون هناك طيات (الشكل 2G).
  13. تحديد موقع حقن الورم المطلوب في الجسم أو ذيل البنكرياس (بعيدا عن الأوعية الدموية).
  14. الخطوة الحاسمة: بعد تحديد موضع البنكرياس بعناية ، استخدم الملقط لتوفير التوتر للأنسجة وأدخل طرف حقنة الأنسولين ، مع توجيه الشطبة لأعلى ، في الموقع المطلوب للبنكرياس على عمق 4-5 مم (الشكل 2H).
  15. حقن ببطء محلول الخلايا السرطانية. ابحث عن فقاعة صغيرة تؤكد الحقن الناجح (الشكل 2I).
  16. أعد البنكرياس بعناية إلى البطن دون إزعاج فقاعة حقن الخلايا السرطانية (الشكل 2J).
  17. باستخدام خيوط بوليديوكسانون قابلة للامتصاص 5-0 ، أغلق طبقة العضلات أولا ثم الجلد بخيوط متقطعة (الشكل 2K-N).
  18. قم بتغطية الشق بغراء cyanoacrylate (الشكل 2O) ، ثم أعد الماوس إلى قفص نظيف أسفل مصباح تسخين للتعافي. تطبيق المضادات الحيوية في مياه الشرب لمنع العدوى. مراقبة الفئران والسماح لهم بالشفاء التام من الجراحة.
    ملاحظة: تدار المضادات الحيوية كما هو مطلوب بموجب بروتوكول IACUC. يتم إيواء جميع بشكل فردي.
  19. اسمح للورم بالتطور لمدة 10-14 يوما حتى يصبح واضحا من خلال جدار البطن.

4. جراحة نافذة البنكرياس

  1. عندما تكون جاهزة للتصوير ، ابدأ جراحة زرع النافذة. للبدء ، اغسل يديك بالصابون المطهر.
  2. قبل كل عملية جراحية جديدة ، ارتد قفازات معقمة جديدة.
  3. على الحامل الجراحي الساخن ، ضع الماوس في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن لفضح البطن الأيسر.
  4. ثبت الأطراف الأمامية والخلفية للفأرة على المرحلة الجراحية الساخنة بشكل قحفي وذيلي باستخدام شريط ورقي. تأكد من أن الطحال (تحت الجلد) مرئي داخل المجال الجراحي (الشكل 3 أ).
  5. للحفاظ على العقم ، قم بفك جميع الأدوات الجراحية في الغطاء.
  6. تطهير موقع الجراحة عن طريق مسح جلد الماوس مع تطبيق سخي من مطهر.
  7. تأكد من تخدير بالكامل عن طريق إجراء اختبار قرصة إصبع القدم.
  8. خطوة حاسمة: ارفع جلد الربع العلوي الأيسر من البطن بالملقط وقم بعمل شق دائري ~ 10 مم في الجلد والعضلات باستخدام مقص Castroviejo (الشكل 3B ، C).
  9. السيطرة على النزيف والحفاظ على الارقاء باستخدام مسحات القطن أو قلم الكي، عند الحاجة.
  10. حدد موقع البنكرياس ، المتصل بالطحال ، وحدد الاتجاه الذي يضعه البنكرياس داخل الشق لتحديد مكان وضع الغرزة المتقاطعة الداعمة.
  11. باستخدام خياطة الحرير 5-0 ، ضع الغرزة الأولى في الموقع المطلوب في طبقة العضلات. اربط هذه النهاية ب 3-5 عقدة. (الشكل 3D ، E)
  12. استمر في الغرز مباشرة عبر الشق. قطع وترك ذيل ~ 5 سم (الشكل 3F).
  13. كرر الخطوتين 4.11 و 4.12 عموديا على الغرزة الأولى (الشكل 3G ، H).
  14. الخطوة الحاسمة: ارفع البنكرياس وضعه برفق فوق الغرزة المتقاطعة (الشكل 3I ، J). احرص على عدم إتلاف البنكرياس أثناء التلاعب.
  15. خطوة حاسمة: باستخدام خياطة الحرير 5-0 ، قم بإجراء غرزة سلسلة المحفظة ~ 1 مم من الحفرة ، محيطيا ، متشابكة الجلد وطبقة العضلات (الشكل 3K).
  16. ضع إطار النافذة بحيث تستقر حواف الشق الدائري داخل أخدود النافذة (الشكل 3L).
  17. اربط النافذة المزروعة عن طريق ربط الحرير 5-0 بإحكام.
  18. قم بتحميل 100 ميكرولتر من لاصق cyanoacrylate السائل في حقنة 1 مل.
  19. تجفيف الأنسجة عن طريق تطبيق تدفق دقيق من الهواء المضغوط لمدة ~ 10 ثوان.
  20. اربط إطار النافذة من حافته الخارجية بالملقط وارفعه برفق لضمان فصل البنكرياس عن السطح السفلي لإطار النافذة.
  21. الخطوة الحاسمة: قم بتوزيع طبقة رقيقة من لاصق cyanoacrylate السائل على طول تجويف النافذة (الشكل 3M). تأكد من عدم الحصول على أي من المادة اللاصقة على أنسجة البنكرياس.
  22. باستخدام الشاحنات المفرغة من الهواء ، ارفع غطاء الغطاء مقاس 5 مم.
  23. ضع غطاء الغطاء بعناية داخل التجويف في وسط إطار النافذة البصري. امسك بضغط خفيف ، مما يسمح للمادة اللاصقة cyanoacrylate بالتثبيت (~ 25 ثانية).
  24. افصل غطاء الغطاء عن الشاحنات المفرغة باستخدام الملقط.
  25. شد الغرز المتقاطعة لتثبيت البنكرياس بإحكام على غطاء الغطاء (الشكل 3N ، O). ملاحظة: لا تفرط في شد الغرزة المتقاطعة لأنها يمكن أن تسبب تلفا ونقص تروية البنكرياس.
  26. قطع نهايات خياطة.
  27. قم بإزالة الشريط من الماوس.
  28. قم بإيقاف تشغيل مبخر الأيزوفلوران.
  29. نقل الماوس إلى قفص نظيف أو مباشرة إلى المجهر داخل الجسم.
  30. إيواء بشكل فردي بعد جراحة النافذة ومراقبتها حتى الشفاء التام.
  31. ثم يتم إجراء التصوير على مجهر متعدد الفوتونات ثنائي الليزر كما وصفنا سابقا 22،23،24 بالنسبة لجلسات التصوير الطويلة ، يتم وضع الماوس في غرفة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم وتزويده بالسوائل الداعمة وفقا لمعايير IACUC.

5. علاج Cerulein لتحريض التهاب البنكرياس

  1. للتحقيق في بداية التهاب البنكرياس ، علاج الفئران السليمة مع cerulein بعد زرع SWIP. تأكد من صيام الفئران لمدة 14-18 ساعة وإعطائها الماء قبل إعطاء السيرولين.
  2. حقن 50 ميكروغرام/كغ من السيرولين في 100 ميكرولتر من 1x DPBS المعقم داخل الصفاق على فترات 1 ساعة لمدة تصل إلى ثماني حقن. إدارة حجم مكافئ من 1x DPBS وحده ، عن طريق الحقن داخل الصفاق ، إلى الفئران السيطرة.
  3. بعد التصوير ، التضحية بالفئران بعد 24 ساعة من الحقن الأول عن طريق خلع عنق الرحم وفقا لمعايير IACUC.
  4. قم بإجراء التصوير على مجهر متعدد الفوتونات ثنائي الليزر كما هو موضح سابقا22،23،24. لجلسات التصوير الطويلة ، ضع الماوس في غرفة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم وتزويده بالسوائل الداعمة وفقا لمعايير IACUC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 1 ، المقتبس من Du et al.15 ، صورا ثابتة من فيلم IVI بفاصل زمني لبنكرياس الفئران. يمكن ملاحظة بعض حركة الأنسجة خلال فترة الاستقرار الأولية (الساعة الأولى من التصوير ، الشكل 1 أ). ومع ذلك ، مع التصوير المستمر بعد فترة الاستقرار هذه (>75 دقيقة) ، لاحظنا زيادة في الاستقرار الجانبي والمحوري (الشكل 1 ب). تحدد مقارنة استقرار SWIP مع نوافذ التصوير AIW و PIW السابقة أن جميع النوافذ تتطلب فترة أولية للاست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر بروتوكول SWIP الموصوف هنا طريقة محسنة لتثبيت أنسجة البنكرياس من خلال استخدام تقنية سلة الغرزة المتقاطعة. مكنت نوافذ تصوير البطن المبكرة (AIWs) من التصوير داخل الجسم (IVI) للأعضاء الداخلية للبطن ولكنها لم تحد بشكل كاف من حركة الأنسجة الرخوة مثل البنكرياس. استجابة لذلك ، طور Park et al. نافذة تصوير البنكرياس (PIW) التي تتضمن رفا معدنيا أفقيا وتسمح بتحسين استقرار أنسجة البنكرياس مع الحفاظ على ملامسة الغطاء الزجاجي. في حين أن هذا النهج يحسن الاستقرار الجانبي ، فإنه يحد من تصوير أورام البنكرياس الصلبة لأن حجمها يتجاوز ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

مؤسسة إيفلين ليبر الخيرية ، ومركز جروس ليبر للفوتونات الحيوية ، وبرنامج التصوير المتكامل لأبحاث السرطان ، وزمالة NIH T-32 (CA200561) ، ومنحة برنامج أبحاث سرطان البنكرياس التابع لوزارة الدفاع (PCARP) PA210223P1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ (وزن / حجم) محلول من المنظفات النشطة للإنزيمAlconox IncNAمركز ، منظف أنيوني مع إنزيمات البروتياز للتنظيف اليدوي والموجات فوق الصوتية
5٪ (وزن / حجم) محلول هيدروكسيد الصوديومSigma-AldrichS8045كاشف التخميل
5 مم غطاءزجاجي علوم المجهر الإلكتروني72296-05أغطية زجاجية مستديرة   ؛
7٪ (وزن / حجم) محلول حامض الستريكسيجما ألدريتش   ؛كاشف 251275التخميل
28 جم 1 مل حقنة الأنسولين BDBD 329410حقنة لحقن الخلية
Baytril 100 (enrofloxacin) باير(سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية)sc-362890Rxالمضاد الحيوي
جبل مقاعد البدلاء مصباح حراريMcMaster-Carr3349K51مصباح حراري
بوبرينورفين 0.3 مجم / ملكوفيتروس أمريكا الشمالية059122بوبرينورفين تسكين
Castroviejo مقص منحنيالعالم أدوات الدقةWP2220مقص لقطع الأنسجة
C57BL / 6Jماوس مختبر جاكسون000664 C57BL / 6J ماوس
محلول الكلورهيكسيدينDurvet7-45801-10258-3محلول مطهر الكلورهيكسيدين
علبة الهواء المضغوطFalconDPSJB-12الهواء المضغوط لتجفيف الأنسجة
Cyano acrylate - جل SuperglueStaples234790-6غراء الجلد
Cyano acrylate -دبابيسالسائلة LOC1647358Coverslip
Glue DPBS 1xCorning21-031-CVDPBS لحقن السيرولين / الخلايا طقم
الجوزاء CauteryHarvard Apparatus726067Chiutery
Germinator 500CellPoint ScientificGER & nbsp ؛ 5287-120Vحبة معقم
Graefe ملقط تشريح دقيق ؛ مسنن; منحنى طفيف عرض الطرف 0.8 مم ؛ 4 "طولRoboz الجراحيةRS-5135  ملقط التشريح الدقيق Graefe
مجهر التصويرNANA انظر Entenberg et al. 2011 [27]
برنامج التصويرNANA انظر Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)Henry Schein Animal Health50033Isoflurane Anesthesia
Kim WipesFisher Scientific06-666-A & nbsp;مناديل كيم المبللة
شريط المختبرفيشر العلمي159015Rمختبر شريط
ماوس تشريح كيتالدقة العالميةموسكيتالأدوات الجراحية
الماوس مخلب نبض مقياس التأكسجمستشعر كينت العلمي كوربوMSTAT الاستشعار-MSEنبض مقياس التأكسج
الماوس Surgisuiteكينت ScientificSURGI-M04منصة ساخنة
ناير إزالة الشعر غسولأمازونB001RVMR7Kغسول مزيل الشعر
أكسجينTechAirOX TMOxygen
PERMA-Hand خيوط حريرية سوداء مضفرة ، ETHICON مقاس 5-0VWR95056-872خياطة الحرير
الفوسفات المخزنة محلول ملحي 1xLife Technologies10010-023PBS
نظام PhysioSuiteKent ScientificPhysioSuiteمنصة ساخنة مراقب
PuralubeHenry Schein زيوت تشحيم 008897صحة
بيوريتان مسحات قطنية غير معقمة   ؛فيشر Scientific867WCNOGLUEمسحات القطن
SHARP نصائح حاجز الدقة ، ل P-100 ، 100 & شركة إلدينفيل العلميةP1125100 ومايكرو ؛ L نصائح Pipet
Tetramethylrhodamine isothiocyanate &ndash ؛ Dextran:Sigma-AldrichT1287-500MGملصق الأوعية الدموية
لوحة تثبيت النوافذNANAلوحة مصنوعة حسب الطلب لوضع النافذة على مرحلة المجهر. اللوحة مصنوعة من 0.008 في مخزون الرقائق الفولاذ المقاوم للصدأ. لمعرفة أبعاد اللوحة ، انظر Entenberg et al. ، 2018 [8].
إطار النافذةNANAتتكون النافذة من إطار فولاذي بفتحة مركزية تقبل غطاء 5 مم. يوفر أخدود يبلغ 1.75 مم حول محيط الإطار مساحة للعضلات البريتونية وطبقات الجلد للالتصاق بها. انظر Entenberg et al. ، 2018 [8].
Superglue Kit Pen أدوات

المراجع

  1. Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
  3. Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338(2017).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
  5. Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
  6. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  7. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  9. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).
  10. Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
  11. Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773(2016).
  12. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  13. Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  14. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  15. Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273(2022).
  16. DeBold, T. A. M., James, W. How To Passivate Stainless Steel Parts. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563(2011).
  20. Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
  21. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793(2018).
  22. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  23. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
  24. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  25. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603(2016).
  26. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115(2018).
  27. Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
  28. Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
  29. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
  30. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  31. Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تثبيت البنكرياسسرطان البنكرياس الغدينموذج التهاب البنكرياسهجرة الخلايا الورميةتصوير الخلية الواحدةزرع النافذةالديناميكيات تحت الخلويةالتصوير المتسلسل
نافذة مستقرة للتصوير داخل الجسم للبنكرياس الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.