يتم تقديم بروتوكول لإثراء بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) من المنتجات الدوائية (DP) والكشف عن الببتيدات باستخدام حبات إثراء البروتين. يتم عرض الطريقة باستخدام مادة دواء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb) المصنعة داخليا (DS) ، وهي مادة مرجعية جيدة المواصفات لتقييم ومقارنة الطرق المختلفة من حيث الأداء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل بروتين الخلية المضيفة باستخدام حبات التخصيب إلى جانب الهضم المحدود
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) هي شوائب يمكن أن تؤثر سلبا على البروتينات العلاجية ، حتى بكميات صغيرة. لتقييم المخاطر المحتملة المرتبطة بالمنتجات الدوائية ، تم تطوير طرق لتحديد HCPs منخفضة الوفرة. يتضمن النهج الحاسم لتطوير طريقة حساسة للكشف عن HCP إثراء HCPs مع إزالة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) في نفس الوقت قبل التحليل ، باستخدام قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS).
يقدم هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإثراء بروتينات الخلية المضيفة باستخدام حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا. تحتوي هذه الخرزات على مكتبة متنوعة من روابط سداسي الببتيد ذات صلات محددة للبروتينات المختلفة. يتضمن البروتوكول أيضا الهضم المحدود والكشف اللاحق عن الببتيد باستخدام NANO LC-MS / MS. من خلال استخدام هذه التقنيات ، يمكن إثراء HCPs ذات الوفرة المنخفضة بأكثر من 7000 ضعف ، مما يؤدي إلى حد اكتشاف مثير للإعجاب يصل إلى 0.002 جزء في المليون. بشكل ملحوظ ، يتيح هذا البروتوكول اكتشاف 850 HCPs بمستوى عال من الثقة باستخدام NIST mAb. علاوة على ذلك ، تم تصميمه ليكون سهل الاستخدام ويتضمن عرضا توضيحيا بالفيديو للمساعدة في تنفيذه. باتباع هذه الخطوات ، يمكن للباحثين إثراء واكتشاف HCPs بشكل فعال ، مما يعزز حساسية ودقة تقييم المخاطر للمنتجات الدوائية.
المقدمة
بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) هي شوائب يتم إطلاقها من زراعة الخلايا للكائن الحي المضيف ويتم تنقيتها بشكل مشترك باستخدام الجسم المضاد وحيد النسيلة (mAb)1،2،3،4. يمكن أن تؤثر مستويات التتبع من HCPs سلبا على جودة منتج الدواء5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ، وبالتالي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الاختصارات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في الجدول التكميلي 1.
1. إعداد الحلول والمخازن المؤقتة
ملاحظة: يتم سرد التفاصيل التجارية لجميع الكواشف في جدول المواد.
- قم بإعداد محلول 0.1 M Tris-HCl ، pH 8.0 بإضافة 1 مل من 1 M Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات في قنينة زجاجية ، واخلطها جيدا عن طريق الدوامة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- تحضير 24 mM deoxycholate الصوديوم (SDC) عن طريق إذابة 10 ملغ من SDC في 1 مل من 0.1 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0.
- تحضير 24 مليمتر الصوديوم لورويل ساركوسينات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قدم هذا البروتوكول سير عمل لإعداد العينة ، يسمى إثراء البروتين إلى جانب الهضم المحدود (PMLD) ، لتحليل بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) في عينة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb). يوضح الشكل 1 الإجراء التدريجي ل PMLD. قارن الباحثون نتائج تحليل HCP باستخدام الهضم المباشر (كما هو موضح في اللوحة العلوية من الشكل 2) و PMLD (كما هو موضح في اللوحة السفلية من الشكل 2). أشارت ملامح الكروماتوجرام الأيوني الكلي (TIC) إلى أن PMLD قلل بشكل كبي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك نسختان من حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا: واحدة بسعة أصغر والأخرى بسعة أكبر (انظر جدول المواد). يحتوي كلا الإصدارين من حبات التخصيب على عشرة تحضيرات في العبوة. تشير تعليمات الشركة المصنعة إلى أنه يمكن استخدام كل تحضير من مجموعة السعة الصغيرة لإثراء 10 ملغ من البروتين الكلي. ومع ذلك ، للحصول على الأداء الأمثل لتخصيب بروتين الخلية المضيفة (HCP) من DS ، يكون كل إعداد جيدا لخمس عينات DS. لذلك ، يمكن استخدام كل مجموعة لإثراء HCPs من خمسين عينة. لكل إعداد من مجموعة السعة الكبيرة ، من الجيد إثراء HCPs .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 16 جم ، إبرة محور معدني ، 2 بوصة ، نمط نقطة 3 | هاميلتون | 91016 | |
| عمود مصيدة PepMap 100 C18 (20 سم & مرات ؛ 0.075 مم) | ثيرمو فيشر | 164535 | |
| أسيتونيتريل | فيشر Scientific | A955 | |
| أسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الفورميك (v / v) ، Optima LC / MS Grade ؛ | المركزي Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 (0.075 مم ومرات ؛ 1.7 مو ؛ م & مرات; 30 سم ، 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| أجهزة الطرد المركزي 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) ؛ | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit لخراطيش SPE ، 9.5 مم ، 3 مل ، 100 / عبوة | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc ؛ | 7820-11201 | |
| ملي أمبير | ريجينيرون | 200 مجم / مل | |
| يودوأسيتاميد (30 × 9.3 مجم) | ثيرمو فيشر | A39271 | |
| إيزوبروبانول | فيشر ساینتفيك | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| الميثانول | فيشر العلمي | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 مل | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| بروتين LoBind 2.0 مل | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer البرمجيات 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner تخصيب البروتين طقم السعة الكبيرة | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner تخصيب البروتين طقم ذو سعة | صغيرة Bio-Rad | 1633006 | |
| ديوكسي كولات الصوديوم (SDC) | سيجما ألدريتش | D6750 | |
| ساركوسينات لورويل الصوديوم (SLS) ؛ | سيجما ألدريتش | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| خلاط حراري R | Eppendorf | 22670107 | |
| حمض ثلاثي فلور أسيتيك (TFA) | فيشر سينتيفيك | 28904 | |
| التربسين (تعديل درجة التسلسل) (5 × 20 ميكروغرام) | Promega | V5111 | |
| أنبوب مسدس دوار | ثيرمو فيشر | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC نظام نانو | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl درجة الحموضة 8.0 | ثيرمو فيشر | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| ماء مع 0.1٪ حمض الفورميك (v / v) ، Optima LC / MS Grade ؛ | فيشر ساينتفيك | LS118-4 |
المراجع
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
