سير عمل تحليلي يعتمد على الكروماتوغرافيا السائلة ، ومطياف حركة الأيونات المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (LC-TIMS-ToF MS / MS) للحصول على ثقة عالية وتحليل "من أسفل إلى أعلى" قابل للتكرار للغاية لتعديلات الهستون وتحديد الهوية بناء على المعلمات الرئيسية (وقت الاحتفاظ [RT] ، المقطع العرضي للتصادم [CCS] ، ونسبة الكتلة إلى الشحنة الدقيقة [m / z]).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحص تعديل الهستون باستخدام اللوني السائل ، ومطياف حركة الأيونات المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بروتينات هيستون وفيرة للغاية ومحفوظة بين حقيقيات النوى وتلعب دورا كبيرا في تنظيم الجينات نتيجة للهياكل المعروفة باسم تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs). إن تحديد موضع وطبيعة كل PTM أو نمط من PTMs بالإشارة إلى العوامل الخارجية أو الوراثية يسمح بربط هذه المعلومات إحصائيا بالاستجابات البيولوجية مثل نسخ الحمض النووي أو التكرار أو الإصلاح. في العمل الحالي ، تم وصف بروتوكول تحليلي عالي الإنتاجية للكشف عن PTMs هيستون من العينات البيولوجية. يتيح استخدام الكروماتوغرافيا السائلة التكميلية ، ومطياف الحركة الأيونية المحاصرة ، وقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة (LC-TIMS-ToF MS / MS) فصل وتعيين PTM للتعديلات الأكثر صلة بيولوجيا في تحليل واحد. يستفيد النهج الموصوف من التطورات الأخيرة في الحصول على البيانات التابعة (DDA) باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل ، يليه التجزئة المتسلسلة والتفكك الناجم عن الاصطدام. يتم تعيين Histone PTMs بثقة بناء على وقت الاحتفاظ والتنقل ونمط التجزئة.
المقدمة
في الخلايا الحقيقية النوى، يحزم الحمض النووي (DNA) في صورة كروماتين في صورة كروماتين في وحدات وظيفية تسمى النيوكليوسومات. تتكون هذه الوحدات من ثماني من أربعة هيستون أساسية (اثنان من كل من H2A و H2B و H3 و H4) 1،2،3،4. تعد الهستونات من بين البروتينات الأكثر وفرة وحفظا في حقيقيات النوى ، والتي تكون مسؤولة إلى حد كبير عن تنظيم الجينات5. تلعب تعديلات هيستون بعد الترجمة (PTMs) دورا كبيرا في تنظيم ديناميكيات الكروماتين وتلاعب العمليات البيولوجية المختلفة مثل نسخ الحمض النووي والنسخ المتماثل والإصلاح6....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم استخراج عينات هيستون باستخدام طريقة مقتبسة من Bhanu et al. (2020) 12.
1. إعداد العينة
- حصاد الخلايا المستزرعة
- عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، تأكد من أنها قابلة للحياة باستخدام استبعاد التريبان الأزرق.
ملاحظة: تم استخدام خط خلايا HeLa S3 لهذه التجارب ، ولكن يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي خلايا مستزرعة. - نضح الوسائط ، ثم ضع 5 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) على كل لوحة.
- قم بتدوير اللوحة (اللوحات) لشطف جميع الوسائط المتبقية ، ثم قم بشفط PBS وتطبيق 5 مل من 1x PBS.
- افصل الخلايا برفق عن اللوحة عن طريق كشطها باستخدام رافع خلية يمك....
- عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، تأكد من أنها قابلة للحياة باستخدام استبعاد التريبان الأزرق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عادة ما يتضمن سير العمل البروتيني من أسفل إلى أعلى (الشكل 7) ما يلي: استخراج البروتين (البروتينات) المستهدف من عينة خام ، متبوعا بتحديد تركيز البروتين (البروتينات) ، ثم التجزئة ، عادة عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي أو اللوني السائل. بعد التجزئة ، يتم هضم البروتينات باستخدام إنزيم محلل للبروتين (غالبا التربسين) ، وأخيرا ، التحليل الطيفي الكتلي للببتيدات الناتجة وتحديد البروتين باستخدام قاعدة بيانات ثابتة18. تستمد معلومات التسلسل من أيونات السلائف ضمن نطاق الكتلة إلى.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الهستونات هي بروتينات أساسية تنظم بنية الكروماتين من خلال التفاعل مع الحمض النووي في شكل أوكتامرات تتكون من أربعة هيستون أساسية (اثنان من كل من H2A و H2B و H3 و H4)20. تحتوي الهستونات على العديد من بقايا اللايسين والأرجينين ، والتي يتم تعديلها بسهولة ، مما يؤدي إلى PTMs واسعة النطاق التي تغير كيمياء الكروماتين عن طريق التأثير على وظيفة الهستون أو عن طريق الارتباط بالبروتينات الخلوية الأخرى21. يمكن أن تثير PTMs استجابات بيولوجية من خلال العمل جنبا إلى جنب ، مع مجموعات محددة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ملفين أ. بارك وماثيو ويليتس موظفان في شركة Bruker Daltonics Inc. ، الشركة المصنعة لأداة timsTOF.
شكر وتقدير
تستند هذه المواد إلى العمل الذي تدعمه المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم. HRD-1547798 والمنحة رقم. HRD-2111661. تم منح منح NSF هذه إلى جامعة فلوريدا الدولية كجزء من برنامج مراكز التميز البحثي في العلوم والتكنولوجيا (CREST). هذه هي المساهمة رقم 1672 من معهد البيئة ، وهو برنامج بارز في جامعة فلوريدا الدولية. وقدم المعهد الوطني للصحة دعما إضافيا في إطار المنحة رقم. R21AI135469 إلى فرانسيسكو فرنانديز ليما وغرانت لا. R01HD106051 إلى بنيامين أ. غارسيا ، وكذلك من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم. CHE-2127882 إلى بنيامين أ. جارسيا. يود المؤلفون أن يشكروا الدعم الأولي للدكتور ماريو غوميز هيرنانديز خلال تطورات الطريقة الأولية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| -80 درجة ؛ C فريزر | |||
| 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin |
| Free 1 مل أطراف ماصة | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 & L ، غير معقمة ، غير مفلترة ، أطراف أرفف |
| 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | استخدم هذه الأنابيب للمعالجة البسيطة والآمنة لأحجام العينات حتى 1.5 مل |
| 10 & L ماصة نصائح | ثيرمو فيشر 94060100 | الفينيتيب فليكس ، 10 & L ، غير معقم ، غير مفلتر ، مغطى بأرفف | |
| 10٪ NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 محلول منظف Surfact-Amps |
| 10x Dulbecco ' s PBS بدون Ca2 + / Mg2 + | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 مل أنابيب مخروطية | Corning | 352196 | Falcon مخروطي أنابيب الطرد المركزي |
| 200 & micro ؛ L هلام تحميل أطراف الماصة | الحرارية فيشر العلمية | 02-707-138 | Fisherbrand نصائح تحميل الهلام ، 1 & ndash ؛ 200 مو ؛ L |
| 200 & micro; L نصائح الماصة | ثيرمو فيشر العلمي | 94060310 | Finntip Flex 200 & L ، غير معقمة ، غير مفلترة ، أطراف أرفف |
| 2x Laemmli عينة عازلة | Bio-Rad | 1610737 | عازلة عينة بروتين مخلوطة مسبقا ل SDS-PAGE |
| 50 مل أنابيب مخروطية | Corning | 352070 | Falcon مخروطية أنابيب الطرد المركزي |
| 96 بئر صفيحة مسطحة | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96 بئر ، V-Bottom 600 & L | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| الأسيتون | سيجما ألدريتش | 179124 | كاشف ACS, & ge; 99.5٪ |
| أسيتونيتريل (ACN) ثيرمو | فيشر Scientific | A998 | HPLC ، فيشر كيميكال |
| أسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الفورميك (v / v) ، LC / MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC / MS Grade ، Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF هيدروكلوريد ، 98٪ |
| بيكربونات الأمونيوم ، NH 4< / sub>HCO3 | سيجما ألدريتش | 09830 | BioUltra ، & ge 99.5٪ (T) |
| محلول هيدروكسيد الأمونيوم ، NH4< / sub>OH | Sigma Aldrich | AX1303 | يلبي مواصفات ACS ، ويلبي مواصفات الكاشف لاختبار دراسات USP / NF GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18< / sub> عمود HPLC | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 العمود ، 300 & Aring ؛ 5 وميكرو ؛ م ، 4.6 مم × 250 مم ، 1K & ndash ؛ |
| ألبومين مصل الأبقار 15K (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | جزء الصدمة الحرارية ، درجة الحموضة 7 ، & ge ؛ 98٪ |
| كلوريد الكالسيوم ، CaCl 2< / sub> | Sigma Aldrich | C4901 | اللامائية ، مسحوق ، & ge ؛ 97٪ |
| عازلة تفكك الخلية | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| رقاقة تسجيل السيراميك | Restek | 20116 | |
| تحليل بيانات البوصلة 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well ، 96 Well Microplate ، 2.0 مل | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| رافعات الخلايا القابل للتصرف | Thermo Fisher Scientific | nbsp ؛ 08100240 | رافعات خلية فيشربراند ؛ الرافعات التي تستخدم لمرة واحدة تزيل طبقات الخلايا |
| بسرعة بيدات بيليه يمكن التخلص | منها Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand بيليه بيستلز. إعادة تعليق كريات البروتين والحمض النووي أو طحن الأنسجة الرخوة في أنابيب الطرد المركزي |
| Dithiothreitol (DTT) Thermo | Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| حمض الفورميك (FA) Sigma | Aldrich | 695076 | كاشف ACS ، & ge ؛ 96٪ |
| السيليكا الشعرية المنصهرة 75 مو ؛ م معرف × 363 & م OD | (موليكس (بولي ميكرو) | TSP075375 | |
| حمض الخليك الجليدي | ثيرمو فيشر العلمي | A38S | حمض الخليك ، الجليدي (ACS المعتمد) ، ماصات فيشر الكيماوية |
| الزجاجية باستور | سيجما ألدريتش | BR747725-1000EA | |
| كروماتوجراف سائل عالي الأداء | ؛ Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 نظام HPLC UFLC | |
| حمض الهيدروكلوريك ، هيدروكلوريك | سيجما ألدريتش | 258148 | كاشف ACS ، 37٪ |
| هايبركربوريب 30-40 مو ؛ م الكربون 150 &ndash ؛ 300 & أرينج; | خرطوشة Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC / MS Calibration Standard ، ل ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| كلوريد المغنيسيوم ، MgCl 2< / sub> | Sigma Aldrich | M8266 | اللامائية ، & ge ؛ 98٪ |
| ميثانول ، ل HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima ل HPLC ، Fisher Chemical ؛ |
| محولات أنبوب الطرد المركزي الدقيقة | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences قارورة عينة Microcystin-LA |
| MS ، LaPhaPack ، Snap ، 12 مم × 32 مم | أجزاء LEAP PAL | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher | النموذج العلمي: ND3300 | |
| النيتروجين (N2< / sub>) Airgas | NI UHP300 | ||
| PEAKS Studio X + | Bioinformatic Solutions | ||
| شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني ، Instachek | Micro Essential مختبر | JR-113 | نموذج: هيدريون |
| كلوريد البوتاسيوم ، كاشف KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS ، 99.0٪ & ndash ؛ 100.5٪ |
| خلية حقن الضغط | Next Advance | الموديل: PC77 | |
| Propionic أنهيدريد | Sigma Aldrich | 8.00608 | لجهاز الطرد |
| المركزي المبرد للتخليق (700 & ndash; 18,000 × ز) | NuAire ، الموديل: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 & mu ؛ م ، 3 جم | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | أي هلام بولي أكريلاميد مسبقة الصب kD ، 8.6 سم & مرات ؛ 6.7 سم (W & Times; L) ، للاستخدام مع خلايا الرحلان الكهربائي Mini-PROTEAN |
| زبدات الصوديوم | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98 + ٪ |
| كلوريد الصوديوم ، كاشف NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS ، & ge ؛ 99.0٪ |
| قرص SPE ، قرص C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE ، C18 ، CDS تحليلي ، 90 مم × 0.5 مم ، 12 وميكرو ؛ m |
| SpeedVac + مضخة فراغ ودوار لوحة | نموذج سافانت | : SC210A | |
| السكروز | Millipore | 1.07651 | مناسب لعلم الأحياء |
| الدقيقة حمض الكبريتيك ، H2< / sub>SO4< / sub> ؛ | سيجما ألدريتش | 339741 | 99.999٪ |
| TIMS-ToF مطياف الكتلة | نموذج بروكر دالتونيكس | تيمس توف ms | |
| محلول حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ، TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 ؛ N |
| حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) | سيجما ألدريتش | 302031 | مناسب ل HPLC ، & ge ؛ 99.0٪ |
| Triversa Nanomate | Advion | الموديل: TR263 | |
| TrypsinProtease ، MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| أنبوب دوار | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex | Mixer Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water مع 0.1٪ حمض الفورميك (v / v) ، LC / MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC / MS الصف ، Thermo Scientific ؛ |
المراجع
- Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245(2019).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 25....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
