يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus

2.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65631

⸱

يونيو 2, 2023

 ,  ,  , 
1Medicine School, Huaqiao University, 2Engineering Research Centre of Molecular Medicine of Ministry of Education

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم طريقة تنقية تقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus وهي بسيطة وغير مكلفة وفعالة.

الملخص

إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus (sFE) هو عامل تحلل الفيبرين الجديد الذي يمكنه تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين وتحلل الفيبرين مباشرة ، مما يظهر مزايا كبيرة على عوامل التخثر التقليدية. ومع ذلك ، نظرا لنقص المعلومات الهيكلية ، تعتمد جميع برامج تنقية sFE على عمليات تنقية كروماتوغرافية متعددة الخطوات ، وهي معقدة ومكلفة للغاية. هنا ، تم تطوير بروتوكول تنقية التقارب من sFE لأول مرة بناء على بنية بلورية من sFE. ويشمل تحضير العينة الخام وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين / أرجينين - أغاروز ، وتنقية التقارب ، وتوصيف sFE المنقى. بعد هذا البروتوكول ، يمكن تنقية مجموعة من sFE في غضون 1 يوم. علاوة على ذلك ، تزداد نقاء ونشاط sFE المنقى إلى 92٪ و 19200 وحدة / مل ، على التوالي. وبالتالي ، هذا نهج بسيط وغير مكلف وفعال لتنقية sFE. تطوير هذا البروتوكول له أهمية كبيرة لمواصلة استخدام sFE وغيرها من العوامل المماثلة.

المقدمة

يشكل تجلط الدم تهديدا كبيرا للصحة العامة ، خاصة بعد جائحة Covid-19 العالمية 1,2. سريريا ، تم استخدام العديد من منشطات البلازمينوجين (PAs) ، مثل منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة (tPA) و urokinase (المملكة المتحدة) ، على نطاق واسع كأدوية للتخثر. يمكن للمناطق المحمية تنشيط بلازمينوجين المرضى إلى بلازمين نشط لتحلل الفيبرين. وبالتالي ، فإن كفاءتها في التخثر مقيدة بشدة بحالة البلازمينوجين للمرضى 3,4. عوامل تحلل الفيبرين ، مثل بلازمين ميتالوبروتيناز وبلازمين سيرين ، هي نوع آخر من أدوية التخثر السريرية التي تشمل أيضا إنزيمات تحلل الفيبرين (FE) مثل البلازمين ، والتي يمكنها إذابة الجلطات مباشرة ولكن يتم تعطيلها بسرعة بواسطة مثبطات البلازمين المختلفة5. بعد ذلك ، تم الإبلاغ عن نوع جديد من عوامل تحلل الفيبرين يمكنه إذابة الجلطة ليس فقط عن طريق تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين ولكن أيضا عن تدهور الفيبرين مباشرة 6-إنزيم تحلل الفيبرين من دودة الفول السوداني القديمة Sipunculus nudus (sFE)6. تمنح هذه الوظيفة الثنائية مزايا أخرى على أدوية التخثر التقليدية ، خاصة من حيث حالة البلازمينوجين غير الطبيعية. بالمقارنة مع عوامل تحلل الفيبرين ثنائية الوظيفةالأخرى 7،8،9 ، يعرض sFE العديد من المزايا ، بما في ذلك السلامة ، على العوامل غير المشتقة من الأغذية لتطوير الأدوية ، وخاصة بالنسبة للأدوية الفموية. وذلك لأن السلامة البيولوجية والتوافق الحيوي ل Sipunculus nudus كانت راسخة10.

على غرار العوامل الطبيعية الأخرى المحللة للفبرين المعزولة من الكائنات الحية الدقيقة وديدان الأرض والفطر ، فإن تنقية sFE من S. nudus معقدة للغاية وتتضمن مراحل متعددة ، مثل تجانس الأنسجة ، وترسيب كبريتات الأمونيوم ، وتحلية المياه ، وكروماتوغرافيا تبادل الأنيون ، وكروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء ، والغربلة الجزيئية10،11،12. لا يعتمد نظام التنقية هذا على المهارات المتقنة والمواد باهظة الثمن فحسب ، بل يتطلب أيضا عدة أيام لإكمال الإجراء بأكمله. لذلك ، فإن برنامج تنقية بسيط من sFE له أهمية كبيرة لمزيد من التطوير ل sFE. لحسن الحظ ، بلورتان من sFE (PDB: 8HZP ؛ PDB: 8HZO) بنجاح (انظر الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2). من خلال التحليل الهيكلي وتجارب الالتحام الجزيئي ، وجدنا أن النواة التحفيزية ل sFE يمكن أن ترتبط على وجه التحديد بالأهداف التي تحتوي على بقايا الأرجينين أو اللايسين.

هنا ، تم اقتراح نظام تنقية التقارب لأول مرة ، بناء على البنية البلورية ل sFE. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن تنقية sFE عالي النقاء والنشط للغاية من المستخلصات الخام في مرحلة تنقية تقارب واحدة. البروتوكول الذي تم تطويره هنا ليس مهما فقط لإعداد sFE على نطاق واسع ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا لتنقية عوامل تحلل الفيبرين الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التحضير

  1. علاج العينة
    1. تشريح بعناية S. nudus الطازجة (100 غرام) وجمع الأمعاء والسوائل الداخلية.
    2. أضف 300 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، درجة الحموضة 7.4) للتجانس (1000 دورة في الدقيقة ، 60 ثانية).
    3. تجميد ذوبان الجليد المجانس 3x.
    4. أجهزة الطرد المركزي العينة (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) وجمع المادة الطافية. قم بتخزين العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  2. ترسيب البروتين
    1. امزج المادة الطافية مع محلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات) واترك الخليط يقف لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ومتابعته لاحقا.
    2. أجهزة الطرد المركزي (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) للحصول على راسب البروتين ؛ قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.
  3. إعادة تعليق البروتين
    1. أعد تعليق راسب البروتين ب 30 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 M ، الرقم الهيدروجيني 7.4). قم بتخزين محلول البروتين الخام هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.

2. كروماتوغرافيا التقارب

  1. ترشيح الحل
    1. قم بتصفية محلول البروتين الخام من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. احفظ هذه العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. تعبئة العمود
    1. قم بتعبئة عمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة أرجينين - أغاروز وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين - أغاروز عن طريق تحميل كمية مناسبة من وسط مصفوفة ليسين - أغاروز ووسط مصفوفة أرجينين - أغاروز في أعمدة كروماتوغرافيا فارغة سعة 5 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين العمود عند 2-8 درجة مئوية ، مع غمر المصفوفة في مخزن مؤقت (20٪ إيثانول).
  3. تنقية التقارب
    1. قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا التقارب مع ddH2O أولا (1 مل / دقيقة ، 10 أحجام أعمدة) ، متبوعا بالمخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 M ، pH 8.0 ، 1 مل / دقيقة ، 5 أحجام أعمدة).
    2. قم بتحميل عينة محلول البروتين على العمود المتوازن مسبقا (1 مل / دقيقة ، حجم 1/3 عمود).
      ملاحظة: يعتمد حجم تحميل العينة على تركيز sFE.
    3. اغسل العمود باستخدام المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، خمسة أحجام أعمدة).
    4. قم بتحريك العمود ب 0.15 M و 0.25 M و 0.35 M و 0.45 M و 0.55 M و 0.65 M NaCl (1 مل / دقيقة ، خمسة أحجام أعمدة) على التوالي.
    5. ابحث عن قمة الشطف التي يجب أن تظهر في شطف كلوريد الصوديوم 0.15 M ، ثم اجمع الكسور في أنابيب 5 mL.
    6. ركز عينة الشطف باستخدام مرشح طرد مركزي فائق 3 كيلو دالتون (3944 × جم ، 1.5 ساعة ، 4 درجات مئوية). قم بتخزين هذه العينة في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

3. تقييم النقاء

  1. الصوديوم دوديسيل سلفات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) إعداد هلام
    1. تحضير جل SDS-PAGE وفقا لطريقة ليملي باستخدام جل مركز 5٪ وجل فصل 12٪13.
  2. الكهربائي
    1. امزج العينة (15 ميكرولتر) مع مخزن مؤقت لتحميل البروتين SDS-PAGE 5x (حجم 1/4) ، وقم بتسخينه في الماء المغلي لمدة 5 دقائق ، وقم بتحميله على جل SDS-PAGE ، وقم بتشغيل الجل عند 80 فولت ، 60 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة.
  3. تحليل
    1. بعد الرحلان الكهربائي ، قم بتلطيخ الجل باستخدام Silver Stain Kit ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، ولاحظ الجل الملون باستخدام نظام تصوير كيميائي.
    2. تحليل نقاء البروتين المستهدف باستخدام الصيغة التالية: نقاء البروتين المستهدف = قيمة كثافة البروتين المستهدف / قيمة كثافة البروتين الكلي.

4. تقييم نشاط تحلل الفيبرين

  1. إعداد لوحة الفيبرين
    1. تحضير محلول الفيبرينوجين عن طريق خلط 25 ملغ من الفيبرينوجين مع 1.25 مل من المياه المالحة الفسيولوجية.
    2. تحضير محلول الثرومبين عن طريق خلط 100 وحدة من الثرومبين تماما مع 1.05 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي.
    3. تحضير محلول الأغاروز بإضافة 0.5 غرام من الأغاروز إلى 22.5 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 مول / لتر ، درجة الحموضة 7.4). اخلطي محلول الأغاروز وسخنيه على حرارة 100 درجة مئوية حتى يذوب تماما.
    4. قم بتبريد محلول الأغاروز إلى حوالي 50 درجة مئوية وأضف محلول الفيبرينوجين. ثم ، أضف محلول الثرومبين على الفور ، واخلطه بسرعة ، واسكبه في طبق استزراع 60 مم.
  2. تحميل
    1. لكمة الآبار 3 مم على ألواح الفيبرين المعدة باستخدام حفار معقم وملء الآبار بعينات 10 ميكرولتر.
  3. تحليل
    1. بعد 18 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بقياس نشاط تحلل الفيبرين عن طريق حساب حجم مناطقها المتحللة. نشاط تحلل الفيبرين = (حجم منطقة العينة / حجم منطقة يوروكيناز) × 100 وحدة حجم المنطقة = القطر × القطر.
      ملاحظة: تم استخدام المخزن الملحي الفسيولوجي والبروتين الخام (تم الحصول على العينة في خطوة البروتوكول 1.3.1) و urokinase للتحكم السلبي والتحكم الإيجابي ، على التوالي. بالمقارنة مع urokinase ، وجدنا أن النشاط التحلل للفبرين من sFE المنقى كان ~ 19200 وحدة / مل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باتباع هذا البروتوكول ، تم استخراج محللات الأنسجة الخام ، وتم بناء مصفوفة أرجينين-أغاروز وأعمدة كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين-أغاروز ، وتم الحصول على sFE المنقى ، وتم قياس النقاء والنشاط التحلل للفبرين ل sFE المنقى بواسطة SDS-PAGE وألواح الفيبرين ، على التوالي.

بعد الطرد المركزي ، كان الطافي الذي تم جمعه سائلا لزجا شفافا. بدأ هطول الأمطار عندما تم خلط هذا الطافع بمحلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات). بعد الوقوف لمدة 12 ساعة ، تم تشكيل راسب ثقيل في قاع الأنبوب. عندما تم إعادة تعليقه ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نظرا لعدم توفر التسلسل الجيني الدقيق ل sFE ، تم استخراج sFE المستخدم حاليا من S. nudus14 الجديد. علاوة على ذلك ، كانت إجراءات تنقية sFE المبلغ عنها في الأدبيات معقدة ومكلفة ، لأنها استندت إلى بعض السمات العامة ل sFE ، مثل الوزن الجزيئي ، والنقطة متساوية الكهربية ، والقوة الأيونية ، والقطبية15,16. لم يتم الإبلاغ عن أي بروتوكول تنقية تقارب sFE حتى الآن. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول تنقية تقارب sFE بنجاح بناء على معرفة بنيته ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (3502Z20227197) ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070 ، رقم 2021Y0027).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
30٪ أكريلاميد - بيساكريلاميد (29: 1)Biosharp
2-MercaptoethanolSolarbio
Agarose G-10Biowest
Ammonium persulfateSINOPHARM
كبريتات الأمونيومSINOPHARM
Arginine-Sepharose 4Bمصفوفة SolarbioArginine-agarose
برومكسيلينول أزرق (BPB)مجموعة وصمة عار Solarbio
Fast SilverBeyotime
FibrinogenMerck
GlycineSolarbio
حمض الهيدروكلوريكSINOPHARM
KinaseRHAWN
Lysine-Sepharose 4Bليسين أغاروز
N ، N ، N '، N '- تتراميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) علامةاللون Sigma-Aldrich
Prestained (10-170 kD) كلوريدالصوديوم Beyotime
SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)هيدروكسيد الصوديوم سيجما ألدريتش
سينوفارم
ثرومبينميلونبيو
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثانسولاربيو
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريدسولاربيو
<قوي > معدات < / قوي >
AKT نظام تنقيةالبروتين GE
النقيجهاز التعقيم بالبخار بالضغط العمودي الأوتوماتيكي MLS-3750نظام التصوير الكيميائي SANYO
GE BT-100QITE
حاضنة درجة حرارة ثابتةJINGHONG
جهاز طرد مركزي مبرد لسطح المكتب 3-30KSSIGMA
DHG سلسلة فرن التدفئة والتجفيف DGG-9140ADSENXIN
الخالط الزجاجي الكهربائي DY89-IISCIENTZ
الميزان التحليلي الإلكترونيدنفر
حمام مائي كهربائي ترموستاتي DK-S12SENXIN
شاكر إزالة اللون الأفقيKylin-Bell
آلة الثلج AF 103Scotsman
KQ-500E منظف بالموجات فوق الصوتيةShuMei
النمام المغناطيسيZhi wei
مايكرو المبردة الطرد المركزي H1650-Wفرن
Galanz
Milli-Q المرجعMillipore
الماصةالحرارية فيشر العلمية
مقياس الأس الهيدروجيني الدقة لسطح المكتبSartorious
مذبذب دوامة صغير الحجمنظام الرحلان الكهربائي العمودي Kylin-Bell
Bio-Rad
< قوي > المواد الاستهلاكية   ؛ < / قوي >
200 وميكرو ؛ L أنبوب PCR (200 & micro; L)Axygene
(1.5 مل) أنبوب
(5 مل) أنبوب
(50 مل) أنبوب
(7 مل) طبقBiosharp
(60 مم) غشاءNEST
(0.22 & micro; م)ميليكس جي بي
بارافيلمبيميس
(1 مل) طرفKIRGEN
(10 وميكرو ؛ L)Axygene
(200 & micro; L)من Axygene
تصفية الطرد المركزي الفائق TZAKZY
(4 مل 3 كيلو دالة) كاشف
Kit مصفوفة سولاربيو بروتين مضخة التدفق المستمر الميكروويف Cence أنبوب الطرد المركزي الطرد المركزي Biosharp الطرد المركزي Biosharp الطرد المركزي NEST ثقافة مرشح طرف ماصة ماصة طرف ماصة ورق المؤشر الخاص وحدة (15 مل 3 كيلو دالة) وحدة تصفية الطرد المركزي الفائق Millipore SSS لمؤشر الأس الهيدروجيني العالمي Millipore

المراجع

  1. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  2. Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
  3. von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
  4. Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
  5. Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
  6. Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).
  7. Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
  8. Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
  9. Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).
  10. Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).
  11. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
  12. Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
  13. Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
  14. Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
  15. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
  16. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
  17. Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
  18. Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
  19. Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
  20. Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
  21. Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

ترسيب البروتينأغاروز الأرجينينأغاروز الليسينكروماتوغرافيا الألفةمقايسة لوحة الفبرينالشطف المتدرجالنشاط المذيب للفبرين
تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.