هنا ، نقدم طريقة تنقية تقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus وهي بسيطة وغير مكلفة وفعالة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus (sFE) هو عامل تحلل الفيبرين الجديد الذي يمكنه تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين وتحلل الفيبرين مباشرة ، مما يظهر مزايا كبيرة على عوامل التخثر التقليدية. ومع ذلك ، نظرا لنقص المعلومات الهيكلية ، تعتمد جميع برامج تنقية sFE على عمليات تنقية كروماتوغرافية متعددة الخطوات ، وهي معقدة ومكلفة للغاية. هنا ، تم تطوير بروتوكول تنقية التقارب من sFE لأول مرة بناء على بنية بلورية من sFE. ويشمل تحضير العينة الخام وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين / أرجينين - أغاروز ، وتنقية التقارب ، وتوصيف sFE المنقى. بعد هذا البروتوكول ، يمكن تنقية مجموعة من sFE في غضون 1 يوم. علاوة على ذلك ، تزداد نقاء ونشاط sFE المنقى إلى 92٪ و 19200 وحدة / مل ، على التوالي. وبالتالي ، هذا نهج بسيط وغير مكلف وفعال لتنقية sFE. تطوير هذا البروتوكول له أهمية كبيرة لمواصلة استخدام sFE وغيرها من العوامل المماثلة.
المقدمة
يشكل تجلط الدم تهديدا كبيرا للصحة العامة ، خاصة بعد جائحة Covid-19 العالمية 1,2. سريريا ، تم استخدام العديد من منشطات البلازمينوجين (PAs) ، مثل منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة (tPA) و urokinase (المملكة المتحدة) ، على نطاق واسع كأدوية للتخثر. يمكن للمناطق المحمية تنشيط بلازمينوجين المرضى إلى بلازمين نشط لتحلل الفيبرين. وبالتالي ، فإن كفاءتها في التخثر مقيدة بشدة بحالة البلازمينوجين للمرضى 3,4. عوامل تحلل الفيبرين ، مثل بلازمين ميتالوبروتيناز وبلازمين سيرين ، هي نوع آخر من أدوية التخثر السريرية التي تشمل أيضا إنزيمات تحلل الفيبرين (FE) مثل البلازمين ،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التحضير
- علاج العينة
- تشريح بعناية S. nudus الطازجة (100 غرام) وجمع الأمعاء والسوائل الداخلية.
- أضف 300 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، درجة الحموضة 7.4) للتجانس (1000 دورة في الدقيقة ، 60 ثانية).
- تجميد ذوبان الجليد المجانس 3x.
- أجهزة الطرد المركزي العينة (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) وجمع المادة الطافية. قم بتخزين العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
- ترسيب البروتين
- امزج المادة الطافية مع محلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات) واترك الخليط يقف لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا....
- امزج المادة الطافية مع محلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات) واترك الخليط يقف لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باتباع هذا البروتوكول ، تم استخراج محللات الأنسجة الخام ، وتم بناء مصفوفة أرجينين-أغاروز وأعمدة كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين-أغاروز ، وتم الحصول على sFE المنقى ، وتم قياس النقاء والنشاط التحلل للفبرين ل sFE المنقى بواسطة SDS-PAGE وألواح الفيبرين ، على التوالي.
بعد الطرد المركزي ، كان الطافي الذي تم جمعه سائلا لزجا شفافا. بدأ هطول الأمطار عندما تم خلط هذا الطافع بمحلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات). بعد الوقوف لمدة 12 ساعة ، تم تشكيل راسب ثقيل في قاع الأنبوب. عندما تم إعادة تعليقه .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظرا لعدم توفر التسلسل الجيني الدقيق ل sFE ، تم استخراج sFE المستخدم حاليا من S. nudus14 الجديد. علاوة على ذلك ، كانت إجراءات تنقية sFE المبلغ عنها في الأدبيات معقدة ومكلفة ، لأنها استندت إلى بعض السمات العامة ل sFE ، مثل الوزن الجزيئي ، والنقطة متساوية الكهربية ، والقوة الأيونية ، والقطبية15,16. لم يتم الإبلاغ عن أي بروتوكول تنقية تقارب sFE حتى الآن. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول تنقية تقارب sFE بنجاح بناء على معرفة بنيته ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (3502Z20227197) ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070 ، رقم 2021Y0027).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 30٪ أكريلاميد - بيساكريلاميد (29: 1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| كبريتات الأمونيوم | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | مصفوفة Solarbio | Arginine-agarose | |
| برومكسيلينول أزرق (BPB) | مجموعة وصمة عار Solarbio | ||
| Fast Silver | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| حمض الهيدروكلوريك | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | ليسين أغاروز | ||
| N ، N ، N '، N '- تتراميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) علامة | اللون Sigma-Aldrich | ||
| Prestained (10-170 kD) كلوريد | الصوديوم Beyotime | ||
| SINOPHARM | |||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | هيدروكسيد الصوديوم سيجما ألدريتش | ||
| سينوفارم | |||
| ثرومبين | ميلونبيو | ||
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان | سولاربيو | ||
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد | سولاربيو | ||
| <قوي > معدات < / قوي > | |||
| AKT نظام تنقية | البروتين GE | ||
| النقيجهاز التعقيم بالبخار بالضغط العمودي الأوتوماتيكي MLS-3750 | نظام التصوير الكيميائي SANYO | ||
| GE BT-100 | QITE | ||
| حاضنة درجة حرارة ثابتة | JINGHONG | ||
| جهاز طرد مركزي مبرد لسطح المكتب 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG سلسلة فرن التدفئة والتجفيف DGG-9140AD | SENXIN | ||
| الخالط الزجاجي الكهربائي DY89-II | SCIENTZ | ||
| الميزان التحليلي الإلكتروني | دنفر | ||
| حمام مائي كهربائي ترموستاتي DK-S12 | SENXIN | ||
| شاكر إزالة اللون الأفقي | Kylin-Bell | ||
| آلة الثلج AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E منظف بالموجات فوق الصوتية | ShuMei | ||
| النمام المغناطيسي | Zhi wei | ||
| مايكرو المبردة الطرد المركزي H1650-W | فرن | ||
| Galanz | |||
| Milli-Q المرجع | Millipore | ||
| الماصة | الحرارية فيشر العلمية | ||
| مقياس الأس الهيدروجيني الدقة لسطح المكتب | Sartorious | ||
| مذبذب دوامة صغير الحجم | نظام الرحلان الكهربائي العمودي Kylin-Bell | ||
| Bio-Rad | |||
| < قوي > المواد الاستهلاكية ؛ < / قوي > | |||
| 200 وميكرو ؛ L أنبوب PCR (200 & micro; L) | Axygene | ||
| (1.5 مل) أنبوب | |||
| (5 مل) أنبوب | |||
| (50 مل) أنبوب | |||
| (7 مل) طبق | Biosharp | ||
| (60 مم) غشاء | NEST | ||
| (0.22 & micro; م) | ميليكس جي بي | ||
| بارافيلم | بيميس | ||
| (1 مل) طرف | KIRGEN | ||
| (10 وميكرو ؛ L) | Axygene | ||
| (200 & micro; L) | من Axygene | ||
| تصفية الطرد المركزي الفائق TZAKZY | |||
| (4 مل 3 كيلو دالة) كاشف | |||
المراجع
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
