مقالة منهجية

تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري جنبا إلى جنب مع تسلسل سانجر للكشف عن الطفرة الجسدية منخفضة التردد

DOI:

10.3791/65647

⸱

أغسطس 23, 2024

 ,  ,  , 
1Kindstar Global Technology Inc., 2Yongzhou Central Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة تطبيق طريقة الكشف منخفضة التردد على أساس تسلسل سانجر في سرطان الغدد الليمفاوية الوعائية. توفير أساس لتطبيق هذه الطريقة على الأمراض الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند مراقبة الحد الأدنى المتبقي من المرض (MRD) بعد علاج الورم ، هناك متطلبات أعلى للحد الأدنى للكشف مقارنة بالكشف عن طفرات مقاومة الأدوية وطفرات الخلايا السرطانية المنتشرة أثناء العلاج. يحتوي تسلسل سانجر التقليدي على اكتشاف طفرة من النوع البري بنسبة 5٪ -20٪ ، لذلك لا يمكن أن يلبي حد اكتشافه المتطلبات المقابلة. تشمل تقنيات الحجب من النوع البري التي تم الإبلاغ عنها للتغلب على هذا تضخيم إزاحة المانع (BDA) ، والحمض النووي المقفل غير القابل للتمديد (LNA) ، والمجسات الخاصة بالنقاط الساخنة (HSSP) ، وما إلى ذلك. تستخدم هذه التقنيات تسلسلات قليلة النوكليوتيدات المحددة لمنع النوع البري أو التعرف على النوع البري ثم دمج هذا مع طرق أخرى لمنع تضخيم النوع البري وتضخيم التضخيم الطافر ، مما يؤدي إلى خصائص مثل الحساسية العالية والمرونة والراحة. يستخدم هذا البروتوكول BDA ، وهو تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري جنبا إلى جنب مع تسلسل سانجر ، لتحسين الكشف عن الطفرات الجسدية منخفضة التردد RHOA G17V ، ويمكن أن تصل حساسية الكشف إلى 0.5٪ ، والتي يمكن أن توفر أساسا لمراقبة MRD لسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية الوعائية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحد الأدنى من المرض المتبقي (MRD) هو عدد قليل من الخلايا السرطانية التي لا تزال موجودة في الجسم بعد العلاج. نظرا لقلة عددهم ، فإنها لا تؤدي إلى أي علامات أو أعراض جسدية. غالبا ما لا يتم اكتشافها بالطرق التقليدية ، مثل التصور المجهري و / أو تتبع بروتينات المصل غير الطبيعية في الدم. تشير نتيجة اختبار MRD الإيجابية إلى وجود خلايا مريضة متبقية. النتيجة السلبية تعني أن الخلايا المريضة المتبقية غائبة. علاج ما بعد السرطان ، يمكن أن تصبح الخلايا السرطانية المتبقية في الجسم نشطة وتبدأ في التكاثر ، مما يتسبب في انتكاسة المرض. يشير اكتشاف MRD إلى أن العلاج لم يكن فعالا تماما أو أن العلاج لم يكن مكتملا. قد يكون السبب الآخر للنتائج الإيجابية ل MRD بعد العلاج هو عدم استجابة جميع الخلايا السرطانية للعلاج أو لأن الخلايا السرطانية أصبحت مقاومة للأدوية المستخدمة1.

سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية المناعية الوعائية (AITL) هو نوع فرعي من سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية المحيطية (PTCL) مشتق من الخلايا التائية المساعدة2. إنه النوع الأكثر شيوعا من سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية ، وهو ما يمثل حوالي 15٪ -20٪ من PTCL3. إنها مجموعة من الأورام الخبيثة ذات الصلة التي تؤثر على الجهاز اللمفاوي. الخلية الأصلية هي الخلية التائية المساعدة الجريبية. يصنفه تصنيف منظمة الصحة العالمية لعام 2016 على أنه سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائيةالمناعية الوعائية 4. في عام 2022 ، أعادت منظمة الصحة العالمية تسميته باسم سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا المساعدة العقدية T ، والنوع المناعي الوعائي (nTFHL-الذكاء الاصطناعي) ، جنبا إلى جنب مع سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا المساعدة العقدية T ، والنوع الجريبي (nTFHL-F) وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا المساعدة العقدية التائية ، غير المحددة بطريقة أخرى (nTFHL-NOS) ، والتي يشار إليها مجتمعة باسم سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية المساعدة الجريبية العقدية (nTFHL). وقد تم ذلك لتحديد سماته السريرية والمناعية الهامة وتوقيعات التعبير الجيني المساعد T (TFH) والطفرات. وراثيا ، يتميز nTFHL-الذكاء الاصطناعي بالاستحواذ التدريجي للطفرات الجسدية في الخلايا الجذعية المكونة للدم المبكرة من خلال طفرات TET2 و DNMT3A ، بينما توجد طفرات RHOA و IDH2 أيضا في الخلايا السرطانية TFH5. أظهرت العديد من الدراسات أن طفرة RHOA G17V تحدث في 50٪ -80٪ من مرضى AITL6،7،8،9. يتم تنشيط بروتين RHOA المشفر بواسطة جين RHOA عن طريق ربط جوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP) ويتم تعطيله بواسطة ربط ثنائي فوسفات الجوانوزين (GDP). عند تنشيطه ، يمكن أن يرتبط بمجموعة متنوعة من البروتينات المستجيبة وينظم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. من الناحية الفسيولوجية ، يتوسط RHOA هجرة الخلايا التائية وقطبية ، ويلعب دورا في تطور الخلايا الصعترية ، ويتوسط تنشيط إشارات مستقبلات الخلايا التائية السابقة (ما قبل TCR)10. طفرة RHOA G17V هي طفرة فقدان الوظيفة التي تلعب دورا دافعا في التسبب في سرطان الغدد الليمفاوية11. يعد اكتشاف طفرة التردد المنخفض مفيدا لمراقبة MRD ل AITL.

تم استخدام تسلسل سانجر لأكثر من 40 عاما كمعيار ذهبي للكشف عن الطفرات المعروفة وغير المعروفة. ومع ذلك ، فإن حد اكتشافه هو 5٪ -20٪ فقط ، مما يحد من تطبيقه للكشف عن الطفرات منخفضة التردد12,13. في تسلسل سانجر ، يمكن تقليل حساسية الكشف إلى 0.1٪ عن طريق استبدال تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي ب BDA ، وهي تقنية حظر البرية14. تضيف تقنية BDA بشكل أساسي برايمر غير متطابق مكمل للنوع الطافر عند تصميم الاشعال التقليدية للتنافس مع النوع البري وذلك لتحقيق الغرض من تضخيم النوع الطافر. مفتاح تصميم التمهيدي هو التمهيدي غير المتطابق والتعديل الطرفي. في الوقت نفسه ، وفقا للمبدأ الهيكلي للحمض النووي ، فإن الفرق بين طاقة جيبس الحرة للبادئين يتراوح بين 0.8 كيلو كالوري / مول و 5 كيلو كالوري / مول. خطوة رئيسية أخرى في هذه التقنية هي قمع التضخيم من النوع البري عن طريق ضبط نسبة البادئات من النوع البري وحظر14,15.

في الوقت الحاضر ، تشمل تقنيات الكشف عن الطفرات الجسدية الشائعة منخفضة التردد تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليل القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليل ، ASPCR) ، ونظام الطفرات المقاومة للتضخيم PCR (نظام الطفرات المقاومة للتضخيم - PCR ، ARMS-PCR) المستخدم في التنميط الجيني SNP بمساعدة الاشعال المقاومة للحرارة. يسمح تصميم البادئات للأليلات الطافرة والعادية بالتضخيم الانتقائي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (Droplet Digital PCR ، ddPCR) ، وهي طريقة لأداء تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي الذي يعتمد على تقنية قطرات مستحلب الماءوالزيت 16. يتم تجزئة العينة إلى 20000 قطرة ، ولكل قطرة ، يتم تضخيم PCR لجزيئات القالب بحساسية 1 × 10-5 ؛ تضخيم إزاحة المانع (BDA) هو أيضا طريقة تخصيب أليل نادرة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل تستخدم للكشف الدقيق والقياس الكمي ل SNVs و indels وصولا إلى 0.01٪ VAF في بيئة متعددة الإرسال ؛ تقنية الحمض النووي المقفلة (الحمض النووي المقفل غير القابل للتمديد ، LNA) ، هي فئة من نظائر الحمض النووي الريبي عالية التقارب حيث يتم قفل حلقة الريبوز في التشكل المثالي لربط Watson-Crick ؛ تتداخل المجسات الخاصة بالنقاط الساخنة (المسبار الخاص بالنقاط الساخنة ، HSSP) ، مع تسلسل التمهيدي المستهدف ، وتتضمن طفرة واحدة ، ويتم تعديلها باستخدام فاصل C3 في نهاية C3 لمنع التضخيم بواسطة qPCR14،16،17،18. عند وجود طفرة في التسلسل ، يرتبط HSSP بشكل تنافسي بالطفرة المستهدفة ويمنع التمهيدي من الارتباط بالتسلسل الطافر المستهدف الذي يوقف تضخيم التسلسل ؛ NGS (تسلسل الجيل التالي) - تسلسل عالي الإنتاجية للغلوبولين المناعي القائم (igHTS) التنميط الشخصي للسرطان عن طريق التسلسل العميق (CAAP-seq) ، وهي طريقة قائمة على التسلسل من الجيل التالي تستخدم لتحديد كمية الحمض النووي المتداول في الخلايا السرطانية (الحساسية هي 1 × 10-4) ؛ الخ. من بينها ، تعتمد معظم الطرق على تفاعل البوليميراز المتسلسل ويمكنها فقط اكتشاف عدد صغير من مواقع الطفرات ، ويمكن للطرق القائمة على NGS اكتشاف مواقع متعددة ، لكن التكلفة مرتفعة ، والعملية معقدة14،16،17،18. كانت هناك تقارير حول اكتشاف طفرات التردد المنخفض RHOA G17V بناء على qPCR ، لكن حد الكشف يمكن أن يصل فقط إلى حوالي 2٪ 19. لا يوجد تقرير عن اكتشاف طفرة التردد المنخفض RHOA G17V بناء على تسلسل سانجر. هنا ، نوضح الزيادة في الحساسية التي حققتها BDA ، وهي كتلة PCR من النوع البري جنبا إلى جنب مع تسلسل سانجر ، لتحسين الكشف عن الطفرات الجسدية منخفضة التردد RHOA G17V ، ويمكن أن تصل حساسية الكشف إلى 0.5٪. كما يتم توفير بيانات إضافية ل IDH2 و JAK1 .

توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لمخطط الكشف عن التردد المنخفض RHOA G17V بواسطة تسلسل سانجر وتوفر مرجعا لتطوير المزيد من الكشف عن الطفرات منخفضة التردد بناء على منصة تسلسل سانجر. يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن الطفرات المحتملة لمقاومة الأدوية ومراقبتها والحد الأدنى من المخلفات في الأورام.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات الطبية في مستشفى يونغتشو المركزي (رقم الموافقة: 2024022601). وقدم المشاركون موافقتهم المستنيرة.

1. تصميم التمهيدي

  1. تصميم التمهيدي التقليدي: تصميم الاشعال وفقا لقواعد تصميم التمهيدي المبلغ عنها20 ، تصميم التمهيدي بواسطة NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). بالنسبة لموقع طفرة RHOA G17V ، فإن جميع التسلسلات المرجعية لتصميم البدايات التقليدية هي تسلسل القاعدة المتحورة. تأكد من أن بادئات التضخيم العكسي المصممة تحتوي على تسلسل موقع الطفرة وأن درجة حرارة التلدين للبادئات حوالي 60 درجة مئوية.
  2. تصميم BDA التمهيدي
    1. صمم برايمر الحجب البري بطول حوالي 20-30 زوجا من القواعد (bp) ، يحتوي على 2-4 قواعد معدلة ، والقواعد المعدلة المكونة من A و T. تأكد من أن التمهيدي المانع يحتوي على 6-14 bp متداخلة مع التمهيدي لتضخيم الطفرة ، المستخدم للتنافس مع التمهيدي لتضخيم الطفرة.
    2. صمم البرايمر بدرجة حرارة التلدين لبادئات تضخيم التضخيم الطافرة المصممة النهائية وبادئات الحجب البري المحددة عند حوالي 60 درجة مئوية ، والفرق في طاقة جيبس الحرة بين 0.8-5 كيلو كالوري / مول. للحصول على قواعد حساب مفصلة ، راجع الأدبيات15.
      ملاحظة: عندما لا تفي البادئات المصممة بالشروط المذكورة أعلاه ، يمكن إضافة القواعد أو طرحها يدويا للتعديل. تظهر قائمة التمهيدي النهائية المصممة في الجدول 1 والجدول 2.

2. إعداد العينة واستخراج الحمض النووي

ملاحظة: يتم الحصول على جميع عينات التحقق التجريبية من الدم المحيطي لمرضى سرطان الغدد الليمفاوية البشرية أو نخاع العظام أو عينات الورم الصلب. كانت هناك 10 عينات إيجابية: 3 عينات ورم صلب ، و 4 عينات نخاع عظمي ، و 3 عينات دم محيطية. هناك 30 عينة سلبية من الأشخاص الأصحاء.

  1. استخراج نخاع العظم وعينات الدم المحيطية
    1. أضف 400 ميكرولتر من نخاع العظم أو عينة الدم المحيطية والكواشف إلى الأنابيب المقابلة وفقا للمتطلبات واستخلصها وفقا لإجراء الاستخراج الخاص بالشركة المصنعة.
    2. تحضير أنابيب عينة جديدة وأنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. ترقيم أنابيب العينة من 1-24. ضع علامة على أغطية الأنبوب سعة 1.5 مل باسم العينة وتاريخ الاستخراج بترتيب الأسماء الموجودة على أنابيب جمع الدم المقابلة. ضع علامة 1-24 على جانب أنبوب الطرد المركزي الدقيق لفحص المراسلات الفردية.
    3. أضف 40 ميكرولتر من محلول البروتيناز K إلى أنبوب العينة وأضف 400 ميكرولتر من عينة الدم الكاملة (للأحجام الأقل من 400 ميكرولتر ، املأ إلى 400 ميكرولتر باستخدام PBS).
    4. ضع أنبوب العينة (1-24) ، وطرف الماصة (بما في ذلك غطاء الماصة) ، وأنبوب التجميع في المواضع المقابلة. استخراج الحمض النووي وفقا لإجراء الشركة المصنعة.
  2. استخراج عينات البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE)
    1. ضع العينات والكواشف في الأنابيب المقابلة وفقا للمتطلبات واستخلصها وفقا لإجراء الاستخراج الخاص بالشركة المصنعة.
    2. أضف 1.1 مل من محلول تخزين البروتيناز K (محلول PK) إلى مسحوق البروتين K الجاف ، الدوامة ، واخلطه جيدا للحصول على محلول بروتيناز K بتركيز 10 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    3. أخرج محلول البروتيناز K وقم بإذابته تماما في درجة حرارة الغرفة. قم بتشغيل منظم الحرارة الجاف واضبط درجة الحرارة على 55 درجة مئوية.
    4. خذ أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واكتب اسم العينة عليه. خذ أقل من 30 ملغ من الأنسجة وضعها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول Deparaffin Buffer و 20 ميكرولتر من محلول بروتيناز K إلى الأنبوب.
    5. بعد خلط الدوامة لمدة 10 ثوان على الأقل ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق في ترموستات جاف واحتفظ به دافئا عند 55 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
    6. تأكد من أن عمود الدوران يناسب أنبوب المرشح. بعد اكتمال الحضانة ، انقل العينة ، بما في ذلك السائل والأنسجة ، إلى عمود الدوران. جهاز طرد مركزي عند 16500 × جم لمدة 5 دقائق لأجهزة الطرد المركزي كل السائل في أنبوب التصفية.
    7. خذ 1 أنبوب عينة (بدون غطاء) مضمن مع المجموعة واكتب اسم العينة عليها. انقل السائل من أنبوب المرشح 400 ميكرولتر إلى أنبوب العينة.
    8. بعد اكتمال المعالجة المسبقة للعينة وتحضيرها ، ضع المواد الاستهلاكية والكواشف المقابلة في المواضع المقابلة وقم بإجراء استخراج الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. مراقبة جودة الحمض النووي
    1. قم بقياس تركيز ونقاء الحمض النووي المستخرج وتأكد من أن تركيز الحمض النووي ≥ 25 نانوغرام / ميكرولتر. سجل تركيز الحمض النووي لكل عينة واستخدمه على الفور للكشف اللاحق أو التجميد عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: تستخدم قيم OD260 / OD280 بشكل عام لاختبار نقاء عينات الحمض النووي. تبلغ قيمة OD260 / OD280 العادية حوالي 1.7-1.9 ، مما يشير إلى أن نقاء الحمض النووي جيد ؛ إذا كانت قيمة OD260 / OD280 هي ≤1.7 ، فهذا يشير إلى أنه قد يكون هناك تلوث بالبروتين ؛ إذا كانت قيمة OD260 / OD280 هي ≥2.0 ، فهذا يشير إلى أنه قد يكون هناك تلوث بالحمض النووي الريبي أو أن الحمض النووي قد تحلل.

3. تضخيم PCR

  1. إعداد الاشعال
    1. إعداد حل الأسهم التمهيدي
      1. أخرج المسحوق الجاف التمهيدي وأجهزة الطرد المركزي عند 5400-8400 × جم لمدة 2-3 دقائق. تحقق من قيمة nmol للبرايمر وافتح الغطاء ببطء. باستخدام ماصة مع الحجم المقابل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) ، وهو 10x من قيمة نانومتر ، قم بإضافته ببطء على طول جدار الأنبوب التمهيدي.
      2. تحضير الاشعال عند محلول مخزون 0.1 نانومتر / ميكرولتر أو 100 ميكرومتر (على سبيل المثال ، قيمة نانومتر هي 21.1 ؛ في المقابل ، الماء المراد إضافته هو 211 ميكرولتر). تخلط الدوامة جيدا ، ثم أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لضمان وصول المحلول إلى قاع كل بئر. اكتب اسم التمهيدي وبيانات التكوين وشخص التكوين على غطاء الأنبوب. ضعه في موقع تخزين حل المخزون المقابل.
    2. إعداد حل العمل التمهيدي
      1. ماصة 5 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، 5 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، 50 ميكرولتر من محلول مخزون التمهيدي من النوع البري ، و 40 ميكرولتر من ddH2O في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف. ماصة مرارا وتكرارا 2x-3x ، دوامة للخلط ، وتدور على الفور.
      2. اكتب اسم التمهيدي وتاريخ التكوين والشخص الذي قام بتكوينه على غطاء الأنبوب وضعه في موقع التخزين المقابل لحل العمل.
  2. إجراء تضخيم PCR
    1. لكل تفاعل ، أضف 5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لإنزيم تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و 1 ميكرولتر من محلول العمل التمهيدي ، و 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (يجب أن تصل كمية إدخال القالب إلى 400 نانوغرام ، إذا كان تركيز الحمض النووي غير كاف ؛ قم بزيادة حجم الحمض النووي وتقليل حجم ddH2O المضافة) و 3 ميكرولتر من ddH2O. دوامة للخلط والدوران على الفور.
    2. ضع أنبوب تفاعل PCR على أداة PCR المحددة مسبقا لتضخيم PCR. اضبط برنامج الدورة الحرارية لأداة PCR على النحو التالي وقم بتشغيله:
      95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 20 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 68 درجة مئوية لمدة 15 ثانية (انخفاض 0.5 درجة مئوية لكل دورة) ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ؛ 16 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 58 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ؛ و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. إجراء هلام الكهربائي على المنتج PCR مع 2 ٪ agarose للتحقق مما إذا كان يتم تضخيم الجزء المستهدف.
  4. تنقية منتجات PCR
    1. أحضر purificase I و purificase II إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتدويرها على الفور. قم بإعداد تفاعل تنقية منتج PCR على النحو التالي: 1 ميكرولتر من purificase I ، 0.5 ميكرولتر من purificase II ، 3 ميكرولتر من منتج PCR ، و 3.5 ميكرولتر من ddH2O.
    2. ضع أنبوب تفاعل PCR على أداة PCR المحددة مسبقا لتضخيم PCR. اضبط برنامج الدورة الحرارية لأداة PCR على النحو التالي وقم بتشغيل الجهاز:
      37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

4. تسلسل منتجات PCR بعد التنقية

  1. التسلسل
    1. أحضر المزيج الرئيسي لإنزيم تضخيم التسلسل ، والمخزن المؤقت ، و ddH2O إلى درجة حرارة الغرفة. بعد تسييل الكاشف ، قم بتدويره على الفور.
    2. قم بإعداد نظام تفاعل التسلسل على النحو التالي: 1.8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتسلسل ، و 0.4 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لإنزيم تضخيم التسلسل ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي للتسلسل ، و 0.8 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى ، و 6 ميكرولتر من ddH2O.
    3. ضع أنبوب تفاعل PCR على أداة PCR المحددة مسبقا لتضخيم PCR. اضبط برنامج الدورة الحرارية لأداة PCR على النحو التالي وقم بالتشغيل: 96 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 28 دورة من 96 درجة مئوية لمدة 25 ثانية ، 56 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
    4. بعد الانتهاء من تفاعل التسلسل ، قم بإزالة المنتج من أداة PCR. تخزين منتجات التفاعل في الثلاجة ، محمية من الضوء.
  2. تنقية منتجات التسلسل
    1. دوامة الخرز المغناطيسي بدقة. أضف 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي و 40 ميكرولتر من الكحول بنسبة 80٪ إلى اللوحة المكونة من 96 بئرا وأغلق اللوحة بفيلم.
    2. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا مع حبات مغناطيسية وكحول على شاكر الدوامة لمدة 10 ثوان لتعليق وخلط الخرزات المغناطيسية بالكامل (لاحظ ما إذا كان هناك ترسيب حبة مغناطيسية في الأسفل واحرص على عدم الحصول على السائل على فيلم الختم). ضعه على مذبذب أفقي واربطه بشريط مطاطي ليهتز لمدة 3-5 دقائق (أقصى ترس).
    3. بعد التذبذب ، ضع لوحة PCR على الحامل المغناطيسي ، وانتبه للضغط عليها بإحكام. حافظ على الحامل عند 4 درجات مئوية للامتزاز الثابت لمدة 3 دقائق ، وبعد امتصاص جميع الخرزات المغناطيسية على الحائط ، قم بإزالة فيلم الختم واسكب سائل النفايات.
    4. أضف 40 ميكرولتر من الكحول بنسبة 80٪ إلى لوحة PCR ، واشطف الخرزات ، واسكب سائل النفايات. ضع اللوحة على ورق ماص وربت عليها برفق (لا تدع لوحة PCR تنفصل عن القرص). كرر 1x.
    5. ضع الورق الماص رأسا على عقب مع اللوحة المغناطيسية في جهاز الطرد المركزي عند 120 × جم لدوران سريع.
    6. ضع لوحة PCR التي تحتوي على الخرزات المغناطيسية بعد إزالة الكحول في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. تجفيف الخرز تماما.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك فرن ، ضع الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    7. أضف 40 ميكرولتر من الماء النقي بعد التجفيف. ضع فيلم الختم على اللوحة ورجه على شاكر دوامة لمدة 3-5 ثوان. ضع اللوحة على شاكر أفقي ، واربطها بإحكام ، ورجها لمدة 3-5 دقائق لإذابة منتج التسلسل المنقى.
    8. قم بتدوير منتج التسلسل المذاب عند 180 × جم واستخدم المنتج للتحليل الجينومي باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري21 (لاحظ أنه يجب إضافة القرص الداعم إلى لوحة العينة).
  3. تحليل نتائج التسلسل
    1. الحصول على نتائج التسلسل من البرنامج. راجع دليل البرنامج للحصول على إجراءات التشغيل التفصيلية. استخدم التسلسل المرجعي من NCBI.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قارن تسلسل عينة الاختبار بالتسلسل المرجعي للحصول على حالة طفرة عينة الاختبار. يمكن لتقنية WBT-PCR القائمة على BDA اكتشاف طفرة RHOA G17V المعروفة وغيرها من الطفرات منخفضة التردد في فترة التضخيم لبادئات المنبع والمصب. انظر الشكل 1. كما تم تحليل جينين إضافيين ، وهما IDH2 و JAK1 ، باستخدام هذه الطريقة ، الشكل 2 والشكل 3 ، على التوالي. تظهر النتائج أن هذه الطريقة حساسة للغاية في اكتشاف الطفرات منخفضة التردد.

مخطط كروماتوغرام تسلسل الحمض النووي. تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي مقابل WBT-PCR يظهر مقارنة الكشف عن طفرات RHOA.
الشكل 1: نتيجة التسلسل ل RHOA. من أعلى إلى أسفل ، يوضح الشكل الطفرة الأساسية لموقع RHOA G17 التي تم تضخيمها بواسطة WBT-PCR ونتائج التسلسل بعد تضخيم PCR التقليدي المقابل ل RHOA G17 من النوع البري. تظهر الصورة الوسطى نتائج تسلسل طفرة c.50G >T بعد التضخيم باستخدام بادئات WBT-PCR عندما تكون حساسية الكشف 0.5٪. تظهر الصورة السفلية نتائج التسلسل لطفرة c.49-50delinsTT بعد التضخيم باستخدام بادئات WBT-PCR عندما تكون حساسية الكشف 0.5٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

WBT-PCR ومقارنة كروماتوجرام PCR التقليدية ، c.515G>A اكتشاف الطفرة ، جين IDH2.
الشكل 2: نتيجة التسلسل ل IDH2. من أعلى إلى أسفل ، يوضح الشكل أعلاه الطفرة الأساسية لموقع IDH2 R172 التي تم تضخيمها بواسطة WBT-PCR ونتائج التسلسل بعد تضخيم PCR التقليدي المقابل ل IDH2 R172 من النوع البري. تظهر الصورة العلوية نتائج تسلسل طفرة c.515G>A بعد التضخيم باستخدام بادئات WBT-PCR عندما تكون حساسية الكشف 0.5٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مقارنة تسلسل الحمض النووي ، WBT-PCR مقابل تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي لمخطط تحليل طفرات JAK1.
الشكل 3: نتيجة التسلسل ل JAK1. من أعلى إلى أسفل ، يوضح الشكل أعلاه الطفرة الأساسية لموقع JAK1 S703 التي تم تضخيمها بواسطة WBT-PCR ونتائج التسلسل بعد تضخيم PCR التقليدي المقابل ل JAK1 S703 من النوع البري. تظهر الصورة العلوية نتائج التسلسل لطفرة c.2108G>T بعد التضخيم باستخدام بادئات WBT-PCR عندما تكون حساسية الكشف 0.5٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التمهيديتسلسل التمهيدي
روا-VFATAACCTTGGGTGCCAGGT
RHOA-VRGCTGAAGACTATGAGCAAGCA
روا-WTBAGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA
تسلسل التمهيديATAACCTTGGGTGCCAGGT

الجدول 1: القائمة التمهيدية النهائية المصممة ل RHOA.

IDH2 R172 التمهيدي
التمهيديتسلسل التمهيدي
IDH2-VFCTGGTTGAAAGATGGCGGCT
IDH2-VRTACCTGGTCGCCATGGGC
IDH2-WTBGCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT
تسلسل التمهيديCTGGTTGAAAGATGGCGGCT
JAK1 الجينات التمهيدي
التمهيديتسلسل التمهيدي
JAK1-VFACTCTGAGGCCGAGTAGTGT
JAK1-VRCCATTATGGACATCAGGACATTC
JAK1-WTBGGACATTCTCACCAAGTAGCAGAAAA
تسلسل التمهيديACTCTGAGGCCGAGTAGTGT

الجدول 2: القائمة التمهيدية النهائية المصممة ل IDH2 و JAK1.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم WTB-PCR المستند إلى تقنية BDA ، الموصوف في هذه المقالة ، برايمر غير متطابق مكمل للنوع الطافر عند تصميم الأوائل التقليدية للتنافس مع النوع البري ، وقمع النوع البري ، وتضخيم المنتج الطافر. بعد ذلك ، تم تسلسل منتجات WTB-PCR لتحليل الطفرة. فائدة WTB-PCR / Sanger هي بساطته وحساسيته العالية. وفقا لمخطط الكشف المحدد في هذه الورقة ، يمكن إضافة معظم المقايسات الحالية المستندة إلى سانجر مع بادئات مثبطة عبر BDA ، وبالتالي زيادة حساسية الكشف. تم تسلسل طفرة RHOA G17V التي تم تقديمها في هذه المقالة بواسطة تسلسل سانجر بعد WTB-PCR بناء على تقنية BDA. عندما تصل كمية إدخال الحمض النووي إلى 400 نانوغرام ، يمكن أن تصل حساسية الكشف إلى 0.5٪ أو حتى 0.1٪. يجب تأكيد حساسية الكشف عن الجينات المختلفة من خلال كمية مدخلات الحمض النووي وتسلسل الجينات وما إلى ذلك.

مفتاح WTB-PCR هو تصميم البادئات ، ويمكن لهذه التقنية اكتشاف الطفرات المعروفة فقط. توضح هذه المقالة تطبيقا لهذه التقنية في تسلسل سانجر. يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على تسلسل الجيل التالي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، وما إلى ذلك ، ويمكن استخدامها أيضا في اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد. يمكن أن يقلل WTB-PCR من الحد الأدنى لطرق الكشف هذه ويمكن تطبيقه بشكل أفضل على مراقبة MRD. يمكن لمعظم الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل اكتشاف عدد صغير فقط من مواقع الطفرات ، ويمكن للطرق القائمة على NGS اكتشاف مواقع متعددة ، لكن التكلفة مرتفعة ، والعملية معقدة14،15،16،17،18. يتميز WTB-PCR بخصائص الحساسية العالية والتكلفة المنخفضة والمرونة القوية ، مما يجعله خيارا مثاليا للكشف عن الطفرات منخفضة التردد ، والتي يمكن أن تحسن بشكل كبير من حساسية الكشف عن تسلسل سانجر وتطبيقه في اكتشاف MRD.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الانتهاء من هذا البحث بدعم مالي من شركة Kindstar Global Corporation وبمساعدة قادة مختبر البيولوجيا الجزيئية والزملاء ذوي الصلة. شكرا للشركة والقادة والزملاء المعنيين على دعمهم ومساعدتهم. تستخدم هذه المقالة فقط للبحث العلمي ولا تشكل أي نشاط تجاري.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مستخرج الحمض النووي الأوتوماتيكي9001301كاشف الحمض النووي Qiagen
DNA Q32854بيرمومير المتسلسل الحراري فيشر
P4600ميرك
PCRC1000 TouchBiorad
proteinase K محلولD3001-2-Aبروتيناز أبحاث
KD3001-2-Czymo Research
تسلسل مجموعة إنزيم تضخيمP7670-FINQiagen
طقم تضخيم أداة مخزن تخزين zymo

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd (2019).
  2. Xie, Y., Elaine, S. J. How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).
  3. Mariko, Y., et al. Angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).
  4. Daniel, A. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
  5. Rita, A., et al. The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms. Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).
  6. Hae, Y. Y., et al. A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).
  7. Lee, P. H., et al. RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment. Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).
  8. Mamiko, S. Y., et al. Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).
  9. Palomero, T., et al. Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas. Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).
  10. Fujisawa, M., et al. Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).
  11. Voena, C., et al. RHO family GTPases in the biology of lymphoma. Cells. 8 (7), 646(2019).
  12. Shendure, J., et al. DNA sequencing an 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
  13. Athanasios, C. T., et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications. J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).
  14. Wu, L. R., et al. Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification. Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).
  15. John, S. J., et al. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).
  16. Coren, A. M., et al. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  17. Eliza, M. L., et al. Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research. Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).
  18. Lee, H. J., et al. Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Biosensors. 12 (8), 597(2022).
  19. Matsubara, R. N., et al. Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR. PLoS One. 9 (10), e109714(2014).
  20. Dieffenbach, C. W., et al. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  21. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA

مقالات ذات صلة