التشخيص السريع القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لعدوى هيليكوباكتر بيلوري ومقاومة المضادات الحيوية

H. pylori هي بكتيريا حلزونية الشكل ، شديدة الحركة ، سالبة الجرام تعيش بشكل رئيسي في منطقة البواب في المعدة¹. إنه ممرض شائع يصيب ما يقرب من 50٪ من سكان العالم². معظم الأشخاص المصابين بعدوى الملوية البوابية ليس لديهم مظاهر سريرية ، ومعظمهم يصابون بأمراض مختلفة بعد عدة سنوات من العدوى ، بما في ذلك التهاب المعدة المزمن والقرحة الهضمية وقرحة المعدة وسرطان المعدة³. في العديد من الدراسات القائمة على مجموعات سكانية مختلفة ، تم إثبات فعالية القضاء على H. pylori للوقاية من سرطان المعدة والآفات السابقة للتسرطن ^4,5. لذلك ، نصحت الوكالة الدولية لبحوث السرطان التابعة لمنظمة الصحة العالمية (WHO) بالقضاء على بكتيريا الملوية البوابية كإجراء وقائي⁶.

يعد استخدام الطرق غير الباضعة لتحديد عدوى الملوية البوابية مكونا رئيسيا في علاج معظم الأفراد المصابين بعسر الهضم بدون أعراض. يعد اختبار تنفس اليوريا (UBT) واختبار مستضد البراز H. pylori (SAT) والاختبارات المصلية من التقنيات غير الباضعة الشائعة. من بين هؤلاء ، يعد UBT الإجراء الأقل تدخلا والأكثر دقة المتاح. يستخدم UBT اليوريا ، الموجود بكثرة في H. pylori ، لتحلل اليوريا الموسومة نظائريا إلى الأمونيا وثاني أكسيد الكربون (13C أو 14C). في المقابل ، فإن المقايسة الكروماتوغرافية المناعية (ICA)⁷ مريحة وبسيطة وغير جراحية لأخذ العينات. ومع ذلك ، تتأثر دقة الاختبار بعدة عوامل ، مثل جودة عينة البراز ودرجة الحرارة والفاصل الزمني بين جمع العينات والاختبار. اختبار آخر يعتمد على الاستجابة المناعية هو اختبار الأجسام المضادة H. pylori في المصل ، والذي يكتشف الأجسام المضادة في مصل المريض. ومع ذلك ، فإن هذا الاختبار غير مناسب لتحليل ما بعد العلاج لأن الأجسام المضادة تبقى لفترة طويلة بعد إزالة البكتيريا⁸. عيب رئيسي آخر هو أن هذه الطرق تشخص فقط عدوى الملوية البوابية ولا تسمح باختبار مقاومة الأدوية لتوجيه العلاج القائم على الحساسية.

بالنسبة لطرق الاختبار الغازية ، يجب أخذ أنسجة خزعة المعدة عن طريق التنظير الداخلي ثم إخضاعها للأنسجة واختبار اليورياز السريع والثقافة البكتيرية. طرق الاختبار هذه محدودة للغاية أيضا بسبب عدة عوامل. حاليا ، تقتصر هذه التقنيات على المرضى المسنين ، والمرضى المعرضين لخطر كبير للإصابة بمرض سرطاني أو خبيث ، والمرضى الذين فشلوا في علاج الخط الأول لمرض الجزر المعدي المريئي أو عدوى الملوية البوابية ⁹. ثانيا ، نظرا لخصائص النمو الفريدة ل H. pylori ، فإن معدل نجاح الثقافة البكتيرية يصل فقط إلى 50٪ ¹⁰. وبالتالي ، توفر طرق الكشف الجزيئي أملا جديدا للتغلب على المتطلبات العالية لطرق الكشف الغازية وتوجيه العلاج القائم على الحساسية. من بين طرق الكشف الجزيئي ، تطور تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بشكل كبير في السنوات الأخيرة. qPCR ، على عكس PCR التقليدي ، لا يتطلب رحلان كهربائي هلامي ويحدد بدقة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في العينات عن طريق إضافة الاشعال والمجسات في مرحلة التلدين. مجموعات qPCR للكشف عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية متاحة الآن تجاريا. ومع ذلك ، فإن كل طريقة لها حدودها. لذلك ، ينبغي النظر في التشخيص السريري للمريض وعلاجه بالاقتران مع الأعراض والعلامات والتاريخ والاختبارات المعملية الأخرى والاستجابة للعلاج.

حاليا ، الطريقة الأساسية لعلاج عدوى الملوية البوابية هي تناول المضادات الحيوية ، ولكن في الآونة الأخيرة ، أصبح من الصعب بشكل متزايد علاج هذه الالتهابات بسبب ارتفاع مقاومة المضادات الحيوية. وفي وقت لاحق، لوحظ انخفاض كبير في فعالية علاج بكتيريا الملوية البوابية على الصعيد العالمي، مما يجعل استئصال بكتيريا الملوية البوابية قضية صحية عمومية رئيسية¹¹.

كلاريثروميسين وليفوفلوكساسين هما منشطان واسعا الطيف يستخدمان لعلاج الالتهابات التي تسببها بكتيريا الملوية البوابية، لكن العديد من الدراسات أبلغت عن مقاومة واسعة النطاق ضد هذين العقارين في عزلات الملوية البوابية. A2143G و A2142G و A2142C هي ثلاث من الطفرات النقطية العديدة الموجودة في جين 2.9 kb 23S rRNA والتي تؤدي إلى مقاومة كلاريثروميسين عن طريق منع الماكرولايد من الارتباط. في الوقت نفسه ، توجد مواقع الطفرة في جين مقاومة الليفوفلوكساسين بشكل أساسي في مواقع الطفرات الستة (A260T ، C261A ، T261G ، G271A ، G271T ، A272G) من جين gyrA ¹². أدى اكتشاف آليات المقاومة هذه القائمة على الطفرات الجينية إلى تحول تدريجي في الكشف عن بكتيريا الملوية البوابية من خلال الدراسات القائمة على الثقافة إلى الاختبارات الجزيئية.

بشكل عام ، هناك حاجة سريرية ملحة لطريقة تشخيصية غير جراحية وفعالة ومتزامنة للكشف عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية. اعتمدنا اختبار سلسلة مشترك وطريقة qPCR للتغلب على صعوبات أخذ العينات وتحقيق هدف الكشف المتزامن عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية باستخدام مجسات أولية مختلفة.

أجريت هذه الدراسة وفقا للاعتبارات الأخلاقية التي وضعتها اللجنة الأخلاقية لمستشفى مقاطعة قوانغدونغ الشعبي ، الجامعة الطبية الجنوبية ، قوانغتشو ، الصين (رقم الموافقة: KY-Q-2022-384-02). تم تضمين المرضى في الفئة العمرية 18-60 سنة في هذه الدراسة. لم يتم تضمين المرضى الذين يتناولون المضادات الحيوية والأدوية الصينية المضادة للبكتيريا والأدوية مثل مثبطات مضخة البروتون (PPI) أو مضادات مستقبلات H₂ ، وما إلى ذلك ، في غضون أسبوعين قبل الاختبار في هذه الدراسة. كما تم استبعاد المرضى الذين تلقوا العلاج ضد H.pylori في الأشهر ال 3 الماضية من هذه الدراسة. كما لم يسمح لأولئك الذين يعانون من مشاكل خطيرة في القلب أو الكبد أو الكلى أو الاعتلال العصبي الحاد أو الأمراض العقلية بالمشاركة في هذه الدراسة. لم تكن هناك نساء حوامل وأمهات مرضعات مشمولات في هذه الدراسة. وترد تفاصيل الإمدادات (الكواشف والمواد الكيميائية والمعدات والبرمجيات) المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. اختبار السلسلة لأخذ عينات السائل المعدي

1. اطلب من المريض الصيام طوال الليل قبل جمع العينات.
2. في اليوم التالي ، افتح مجموعة اختبار السلسلة ، وخذ الكبسولة ، وأمسك الحلقة في نهاية السلسلة.
3. قم بلصق الخيط على خد المريض ، واطلب منه وضع الكبسولة على لسانه بالقرب من مؤخرة الحلق وابتلاعها برشفة من الماء.
4. السماح للكبسولة بالذوب في معدة المريض ، وبالتالي تعريض الخيط داخل الكبسولة لامتصاص مخاط المعدة.
5. اطلب من مساعد مدرب سحب الخيط بعناية بعد 1 ساعة من ابتلاع المريض للكبسولة.
6. قطع الطرف السفلي من الخيط (40 سم) المنقوع في سائل المعدة ، ووضعه في محلول حفظ عينة TSE (Tris / saline / EDTA) ، ثم أرسله إلى المختبر السريري في درجة حرارة الغرفة (RT) للكشف اللاحق عن H. pylori وتحديد ملامح مقاومة المضادات الحيوية باستخدام qPCR.

2. استخراج الحمض النووي

1. ضع أنابيب جمع العينات الحاملة على رف أنبوب اختبار ، مع تسميتها بشكل صحيح ، وقم بتدويرها لمدة 10 ثوان.
2. اقلب اللوحة المكونة من 32 بئرا (مجموعة استخراج الحمض النووي أو التنقية) رأسا على عقب عدة مرات لإعادة تعليق الخرزات المغناطيسية. بعد دوامة قصيرة لمدة 10 ثوان ، قم بإزالة ختم رقائق الألومنيوم بعناية من اللوحة.
3. نقل 200 ميكرولتر من سائل المعدة من كل عينة والحمض النووي لبكتيريا الملوية البوابية كعنصر تحكم إيجابي في الآبار المنفصلة.
4. ضع لوحة 32 بئرا في فتحة العينة المقابلة لآلة استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي تلقائيا.
5. بعد استخراج الحمض النووي وتأكيده ، ابدأ اختبار مقاومة المضادات الحيوية للكلاريثروميسين والليفوفلوكساسين من خلال qPCR على العينات الإيجابية.
6. ضع السائل المعدي الزائد وعينات الحمض النووي المستخرجة في -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل والاستخدام في المستقبل.
7. نفذ كل هذه الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية لتجنب أي تلوث.

3. qPCR للكشف عن H. بيلوري ومقاومة المضادات الحيوية (كلاريثروميسين وليفوفلوكساسين)

1. إجراء qPCR للكشف عن بكتيريا الملوية البوابية والطفرات المشتبه في مقاومة المضادات الحيوية في جينومها.
   1. قم بإذابة خليط تفاعل qPCR (مجموعة الكشف عن الحمض النووي H. pylori ) على الثلج ، واخلطه عن طريق النقر والغزل لمنع أي فقد للكاشف.
   2. لكل عينة على صفيحة 32 بئرا ، امزج 20 ميكرولتر من خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (تفاعل التنميط الجيني بريمكس [يحتوي على إنزيم Taq ، ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوسيد ، مخزن التفاعل ، وكلوريد المغنيسيوم] ، مع البادئات الأمامية والخلفية ureA ، ومسبار ureA) ، و 5 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج.
   3. قم بتشغيل لوحة qPCR ذات 32 بئرا على آلة qPCR. برمجة المدورة الحرارية: سيتفاعل خليط التفاعل أولا بالتتابع عند 42 درجة مئوية و 95 درجة مئوية (كلاهما لدورة واحدة) لمدة 2 دقيقة لكل منهما ؛ ثم ، 40 دورة عند 95 درجة مئوية ، تمسخ لمدة 10 ثوان ، والتلدين والتمديد عند 58 درجة مئوية لمدة 45 ثانية.
   4. اضبط اكتساب إشارة التألق على FAM (H. pylori) والحصول على البيانات على فترة تمديد التضخيم. بعد اكتمال التفاعل ، احفظ البيانات لتحليل النتائج المستقبلية.
   5. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج محدد ل qPCR ، حيث ستحدد الأداة تلقائيا عتبات خط الأساس.
   6. إذا كانت نتيجة اختبار H. pylori إيجابية ، فسيبدأ الجهاز تلقائيا في اختبار مقاومة الأدوية على العينة. استبدل مجموعة الكاشف بكواشف الكشف عن الطفرات الجينية 23S rRNA والطفرات الجينية gyrA في مجموعة H. Pylori (qPCR).
      ملاحظة: تتضمن مجموعة الكاشف (كواشف الكشف عن جين 23S rRNA وطفرات جين gyrA في هيليكوباكتر بيلوري [qPCR]) خليط تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (تفاعل التنميط الجيني بريمكس [يحتوي على إنزيم Taq ، ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوسيد ، مخزن التفاعل ، كلوريد المغنيسيوم] ، الاشعال ، والمجسات). جميع منتجات مراقبة الجودة السلبية هي مياه معقمة ونقية. منتج مراقبة الجودة الإيجابي في مجموعة الكشف عن الحمض النووي H. pylori هو خرز H. pylori القياسي المعطل (ATCC 43504). منتجات مراقبة الجودة الإيجابية القوية ل H. pylori والضعيفة في المجموعة (كواشف الكشف عن جين 23S rRNA وطفرات جين gyrA في H. pylori) هي الحمض النووي لسلالة H. pylori المعطلة التي تحتوي على الجين المستهدف والجين الطافر. وبالمثل ، بناء على الوضع الفعلي ، يتم تعيين جميع معايير التشخيص ، بما في ذلك وجود عدوى الملوية البوابية أو مقاومة الأدوية ، على CT ≤ 35 ولها منحنى نموذجي على شكل S. تركيز مراقبة الجودة الضعيفة هو 1.0 × 10³ نسخ / مل ، في حين أن تركيز مراقبة الجودة القوية هو 1.0 × 10⁸ نسخ / مل.

الكشف عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة المضادات الحيوية في سوائل المعدة بواسطة qPCR
أجرينا qPCR للكشف عن عدوى الملوية البوابية عن طريق تضخيم جين ureA وتحديد ملف مقاومته للمضادات الحيوية من خلال استهداف طفرات نقطية في جين 23S rRNA وجين gyrA (الجدول 1). كانت قيم التصوير المقطعي المحوسب لمراقبة الجودة في جميع المجموعات الثلاث لتجارب qPCR ضمن النطاق الموصى به ، مما يشير إلى أن العينات كانت جميعها في حالة طبيعية وقت التجربة وأن نتائج الاختبار كانت موثوقة. في هذه الدراسة ، تم اختيار خمس عينات بنتائج اختبار مختلفة (S1-S5) لتوصيف موثوقية البروتوكول التجريبي. يمثل S1 سلالة تمثيلية من H. pylori بدون عدوى ، في حين أن عينات S2-S5 هي تلك المصابة ب H. pylori مع نتائج مقاومة مختلفة (الشكل 1). قمنا بتعيين النظام على عدم إجراء مزيد من اختبارات المقاومة مع العينات غير المصابة ب H. pylori ، لذلك لم تدخل عينة S1 اختبار المقاومة بعد أن أظهر اختبار النظام نتيجة سلبية ل H. pylori. فيما يتعلق بالعينات الإيجابية لعدوى الملوية البوابية ، كانت قيم S2 CT كلها ضمن نطاق الكشف ، مما يشير إلى أن العينة كانت إيجابية H. pylori وأظهرت مقاومة مزدوجة للكلاريثروميسين والليفوفلوكساسين ، وأوصى الأطباء باختيار طرق أخرى للعلاج حسب تقديرهم. كانت قيم S3 CT ضمن نطاق الكشف عن عدوى H. pylori واختبار مقاومة الليفوفلوكساسين ، بينما لم يتم الكشف عن قيم CT في اختبار مقاومة كلاريثروميسين ، مما يشير إلى أن عينة S3 كانت من مريض مقاوم للليفوفلوكساسين. وبالمثل ، كانت قيمة التصوير المقطعي المحوسب لعينة S4 ضمن نطاق الكشف عن عدوى H. pylori ومقاومة كلاريثروميسين ، بينما لم يتم الكشف عن قيمة CT لمقاومة الليفوفلوكساسين ، مما يشير إلى أن هذا المريض كان مقاوما للكلاريثروميسين ، ويوصى بتناول الليفوفلوكساسين للعلاج. أخيرا ، أظهر اختبار عينة S5 قيم التصوير المقطعي المحوسب ضمن نطاق الكشف فقط للكشف عن عدوى H. pylori ، مما يشير إلى أن هذا المريض كان حساسا لكلا المضادات الحيوية ويمكن علاجه باستخدام أي من العقارين. بالمقارنة مع طريقة المزرعة البكتيرية التي تكتشف أيضا عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية ، فإن هذه الطريقة آمنة وفعالة في الكشف عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية دون التسبب في ضرر للمريض ويمكن استخدامها لتوجيه الطبيب في صياغة خطة العلاج المناسبة.

الشكل 1: الكشف عن بكتيريا الملوية البوابية ومقاومتها للمضادات الحيوية في سائل المعدة بواسطة qPCR.
(أ) تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لعدوى الملوية البوابية ، (ب) الكشف عن مقاومة كلاريثروميسين، ج: الكشف عن مقاومة الليفوفلوكساسين. "S" تعني عينة. "S1" هي عينة جاءت سلبية لعدوى الملوية البوابية وتم اختبارها أيضا لمقاومة المضادات الحيوية. "S2" هي عينة مصابة ببكتيريا الملوية البوابية مع مقاومة لكل من كلاريثروميسين وليفوفلوكساسين. "S3" هو أيضا عينة إيجابية H. بيلوري ولكنه حساس للكلاريثروميسين ومقاوم للليفوفلوكساسين. "S4" هو أيضا عينة إيجابية H. pylori ولكنه مقاوم للكلاريثروميسين وعرضة للليفوفلوكساسين. "S5" هي عينة إيجابية لبكتيريا الملوية البوابية ولكنها عرضة لكل من كلاريثروميسين وليفوفلوكساسين. تركيز مراقبة الجودة الضعيفة هو 1.0 × 103 نسخ / مل ، في حين أن تركيز مراقبة الجودة القوية هو 1.0 × 108 نسخ / مل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: جدول يوضح نتائج qPCR للكشف عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة كلاريثروميسين وليفوفلوكساسين. يعرض هذا الجدول النتائج النوعية لعدوى H. pylori ، والكشف عن طفرات جينية 23S rRNA التي تظهر أن العزلة مقاومة للكلاريثروميسين ، والكشف عن طفرات جينية gyrA تظهر أن العزلة مقاومة للليفوفلوكساسين. +/- ، نتيجة نوعية ؛ + ، نتيجة إيجابية ؛ - نتيجة سلبية.

اي.