هنا ، نقدم بروتوكولا لإدخال عضويات الدماغ البشري في مراحل نضج متعددة في غشاء المشيمية المشيمية (CAM). نمت عضويات الدماغ باتباع بروتوكولات موحدة غير موجهة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
النمذجة المبكرة غير الموجهة للدماغ البشري العضوي الوعائي العصبي في الغشاء المشيمي الجنيني المتساهل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أثبت إدخال المواد العضوية في الأنسجة الوعائية في النموذجية ، مثل غشاء الفأر أو جنين الفرخ المشيمي (CAM) ، فعاليته في نمذجة الأوعية الدموية الجديدة. الطب التكميلي والبديل هو غشاء خارج الجنين غني بالأوعية الدموية ، والذي يظهر تفاعلا مناعيا محدودا ، وبالتالي يصبح نموذجا ممتازا لاستضافة عمليات زرع الخلايا ذات الأصل البشري.
تصف هذه الورقة استراتيجية غرس عضويات الدماغ البشري المتمايزة في مراحل النضج المتعددة في CAM. يتغير التركيب الخلوي لعضويات الدماغ مع مرور الوقت ، مما يعكس معالم نمو الدماغ البشري. قمنا بتطعيم عضويات الدماغ في مراحل النضج ذات الصلة: التوسع العصبي الظهاري (18 DIV) ، وتكوين الخلايا العصبية المبكر (60 DIV) ، والتكون الدبقي المبكر (180 DIV) في الطب التكميلي والبديل لأجنة الدجاج الجنينية (E) 7. تم حصاد عضويات الدماغ المطعمة بعد 5 أيام وتم تحليل خصائصها النسيجية.
لم يتم الكشف عن أي علامات نسيجية للأوعية الدموية الجديدة في المواد العضوية المطعمة أو الأوعية الدموية غير الطبيعية المجاورة للطعوم. علاوة على ذلك ، لوحظت تغييرات ملحوظة في التركيب الخلوي للعضويات المطعمة ، أي زيادة في عدد الخلايا النجمية الحمضية الحمضية الليفية الدبقية. ومع ذلك ، كانت التغيرات المعمارية الخلوية تعتمد على مرحلة النضج العضوي. إجمالا ، تشير هذه النتائج إلى أن عضويات الدماغ يمكن أن تنمو في الطب التكميلي والبديل ، وتظهر اختلافات في البنية الخلوية اعتمادا على مرحلة نضجها عند التطعيم.
المقدمة
عضويات الدماغ البشري هي تقنية ناشئة تسمح لنا بتلخيص التطور المبكر للدماغ البشري في المختبر1،2،3. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لهذا النموذج هو نقص الأوعية الدموية ، والتي تلعب أدوارا لا غنى عنها ليس فقط في توازن الدماغ ولكن أيضا في نمو الدماغ4. بالإضافة إلى توصيل الأكسجين والمواد المغذية ، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن نظام الأوعية الدموية في الدماغ ينظم التمايز العصبي والهجرة وتكوين المشابك أثناء التطور 5,6. لذلك ، هناك حاجة ملحة لإنشاء نماذج موثوقة يمكنها توفير إشارات الأوعية الدم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت معالجة أجنة دجاج ليغورن الأبيض (جالوس جالوس) باتباع دليل رعاية واستخدام المختبر من معهد موارد المختبر ، لجنة علوم الحياة ، المجلس القومي للبحوث ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وتمت الموافقة على التجارب من قبل مجلس رعاية واستخدام التجارب من جامعة برشلونة.
1. إعداد عضوي غير موجه في الدماغ
- الحفاظ على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H9 (hESCs) في mTESR1 مسخنة مسبقا في درجة حرارة الغرفة (RT) تحت التقاء 70٪ في ألواح 6 آبار مغلفة ب Matrigel المذاب في DMEM (1:40) في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب حفظ Matrigel في الثلج حتى استخدامه كطلاء لمنع البلمرة. - توليد عضويات الد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
اختيار جدول نضج الجنين لعملية الزرع
تبدأ التجربة في D0 عندما يتم تحضين البويضات المخصبة عند 38 درجة مئوية ورطوبة نسبية 60٪. الغشاء المشيمي الألانتوي (CAM) هو غشاء خارج جنيني عالي الأوعية يتطور بعد حضانة البويضة. يتكون من اندماج الألانتوا والمشيمية. في D1 ، بعد 24 ساعة من الحضانة ، يتم ثقب غرفة الهواء لمنع CAM من الالتصاق بغشاء الغلاف الداخلي. يؤدي ثقب غرفة الهواء عند D1 إلى تحسين جودة غرفة الهواء مقارنة بالثقب في المراحل اللاحقة (D4). يستمر الطب التكميلي والبديل في النمو حتى D12 عندما يغلف محتوى البوي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة ، وصفنا بروتوكولا مفصلا يحتوي على العديد من الخطوات الرئيسية التي توفر نموا وتطورا إيجابيين لعضويات الدماغ البشري عند التطعيم دون الإخلال ببقاء أجنة الدجاج. أوصينا باستخدام الإبر المعقمة لثقب غرفة الهواء في البويضة بعد 24 ساعة من الحضانة (اليوم 1). بالإضافة إلى ذلك ، حاولنا أيضا إجراء ثقب في اليوم 4 (بعد التحقق من قشر البيض بالضوء لاختبار تطور الأوعية الدموية للتأكد من أننا نعمل فقط مع الأجنة السليمة). ومع ذلك ، أدى ذلك إلى انخفاض في صلاحية الجنين بسبب قرب أوعية الطب التكميلي والبديل من قشر البيض. تجدر الإ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور الكانتارا والدكتور أورتيغا من UB وبقية الأعضاء في مختبر الدكتور أكوستا على المناقشات الثاقبة. SA هو أستاذ مساعد زميل سيرا هنتر من Generalitat de Catalunya في جامعة برشلونة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Anti-TUBB3 [Tuj1], الماوس | BioLegend | 801201 | 1: 1,000 |
| Anti-GFAP ، أرنب | GeneTex | GTX108711 | 1: 500 |
| مضاد للأرانب AlexaFluor 488 ، ماعز. | Invitrogen | A-21206 | 1: 1,000 |
| AlexaFluor 594 المضاد للفأر ، الماعز | جاكسون ImmunoResearch | 715-585-150 | 1: 500 |
| بيض الدجاج الأبيض المخصب (Gallus gallus) بيض | Granja Gibert (Cambrils ، إسبانيا) DAPI | ||
| Invitrogen | D1306 | 1: 10،000 | |
| DPX | Sigma | 100579 | وسيط تركيب قائم على الزيلين ؛ |
| حل التفكك اللطيف | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | حل تفكك الخلايا |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 وسائط التركيب | Merk | 81381 | |
| منشفة ورقية ، | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 نانومتر |
| مقص جراحي حاد | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus التصاق المجهر ينزلق | Epredia | J1800AMNZ |
المراجع
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
