العزلة ، التوسع في المختبر ، وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة من الأنسجة الدهنية في البربخ الفأر

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي خلايا بالغة متعددة الإمكانات تتمايز إلى خلايا مثل بانيات العظم والأرومة الغضروفية والخلايا الشحمية ^1,2. توجد هذه الخلايا في العديد من الأعضاء ، ولهذا السبب ، يمكن استخراجها من الأنسجة البالغة مثل نخاع العظام والعضلات والدهون وبصيلات الشعر وجذر الأسنان والمشيمة والأدمة و perichondrium والحبل السري^والرئة والكبد والطحال ^3,4.

تم الإبلاغ عن آثار MSCs على علم وظائف الأعضاء والجهاز المناعي ^5,6. كانت هذه الخلايا واعدة لعلاج العديد من الأمراض ، سواء في الطب البشري أو البيطري. يمكن ل MSCs التحكم في الالتهاب وتعزيز تكوين الأوعية الدموية وتوازن الأنسجة من خلال آليات مختلفة ، مثل ملامسة الخلايا الخلوية ، والعوامل القابلة للذوبان ، والحويصلات الصغيرة خارج الخلية^7،8،9،10. علاوة على ذلك ، فإن MSCs هي خلايا ذات امتيازات مناعية قادرة على البقاء على قيد الحياة في متلقي الزرع الخيفي غير المتوافق مناعيا لأن هذه الخلايا تظهر تعبيرا منخفضا عن جزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) وتستخدم في العلاج القائم على الخلايا للزراعة الخيفية^11,12. إن الاستمناع المنخفض جنبا إلى جنب مع إمكانات التجدد يجعل MSCs مرشحين مثاليين للعلاج بالخلايا ، مثل مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GvHD) ¹³ ، الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ¹⁴ ، والتصلب المتعدد¹⁵ ، من بين أمور أخرى^16,17.

على الرغم من حقيقة أن MSCs موجودة في العديد من الأنسجة البالغة ، فإن الأنسجة الدهنية توفر مزايا على المصادر الأخرى ، مثل إمكانية الوصول للحصاد ، مع الحد الأدنى من التدخل الجراحي. عدد كبير من الخلايا المتاحة مع معدل توسع مرتفع ؛ وتوسيع سهل في المختبر باستخدام بروتوكول سهل الأداء دون الحاجة إلى معدات محددة ومواد منخفضة التكلفة^18،19،20. بمجرد استخراجها ، يجب تمييز الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) على النحو الذي حددته الجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT)²¹. وبالتالي ، يجب أن تظهر MSCs مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية ، والالتزام بالثقافة البلاستيكية ، معبرة عن نسبة عالية (≥95٪) من علامات اللحمة المتوسطة مثل endoglin (CD105) ، ecto-5'-nucleotidase (CD73) و Thy-1 (CD90) ، ونسبة منخفضة (≤2٪) من علامات المكونة للدم مثل مستضد الكريات البيض المشترك (CD45) ، البروتين الفوسفوغليكولي عبر الغشاء (CD34) ، البروتين السكري الغشائي المرتبط بالجليكوليبيد (CD14) ، إنتغرين ألفا M (CD11b) ، سلسلة ألفا المرتبطة بالبروتين المرتبط بمستقبلات مستضد الخلايا البائية (CD79α) أو مستضد سطح الخلايا اللمفاوية B B4 (CD19) ومستضد الكريات البيض البشرية من الفئة الثانية (HLA-II). علاوة على ذلك ، يلزم توصيف وظيفي ، ويجب أن تكون الخلايا قادرة على التمايز إلى خلايا بانيات عظمية أو أرومة غضروفية أو خلايا أرومة دهنية²¹.

هنا ، نوضح كيفية الحصول على MSCs من الأنسجة الدهنية البربخية باستخدام التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي للدراسات في المختبر والتوصيف المورفولوجي الذي تم تحديده مسبقا بواسطة ISCT.

أجريت جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية لأخلاقيات وتمت الموافقة عليها من قبل اللجان المؤسسية للرعاية والاستخدام من جامعة ولاية سانتا كروز بموجب البروتوكول رقم 021/22. تم الحصول على ذكور الفئران السويسرية (6-8 أسابيع) من مختبر تربية وصيانتها وتجريبها - مرفق البحوث الحيوانية بجامعة ولاية سانتا كروز (LaBIO-UESC) ، والتي يتم الحفاظ عليها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ، وتتلقى الماء والغذاء حسب الطلب مع دورات الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة.

ملاحظة: يمكن استخدام سلالة الفئران الأخرى ؛ نوصي باستخدام الفئران البالغة (6-8 أسابيع) لأنها تحتوي على أنسجة وخلايا دهنية أكثر تطورا ذات نشاط تكاثري عالي.

1. التحضير

ملاحظة: قبل المتابعة ، قم بإعداد الكواشف التالية الموضحة أدناه. انظر جدول المواد للحصول على معلومات حول الكاشف ومورد المواد. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية مثل الأقنعة والقبعات ومعاطف المختبر والقفازات في جميع الإجراءات العملية.

1. استخراج الأنسجة الدهنية البربخ
   1. احتفظ بمواد الجراحة: ثلاث مجموعات من الملقط والمقصات المعقمة ، وخمس إبر ، وكأس يحتوي على 200 مل من الإيثانول بنسبة 70٪.
   2. تحضير مخدر نهائي ، وخلط الكيتامين (100 ملغ / كغ) والزيلازين (10 ملغ / كغ).
2. ثقافة ADSCs
   1. الوسط القاعدي: تحضير وسائط الجلوكوز عالية الجلوكوز المعدلة (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب ، 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 مجم / مل ستربتومايسين.
   2. محلول الهضم: تحضير 0.15٪ من كولاجيناز النوع الثاني في PBS معقم في مرشح 0.25 ميكرومتر.
      ملاحظة: ليس من الضروري استخدام المضادات الحيوية الأربعة الموصوفة في الوسط القاعدي. سيعتمد ذلك على ظروف زراعة الخلايا في المختبر حيث يتم تنفيذ ذلك.
3. توصيف النمط الظاهري ل ADSCs
   1. تحضير 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني.
   2. تمييع الأجسام المضادة للفأر كما هو مذكور في الجدول 1.
   3. إعداد 2 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
4. التمايز العظمي ل ADSCs
   1. وسط التمايز العظمي: تحضير DMEM المكمل بحمض الأسكوربيك 5.67 M ، 10 نانومتر ديكساميثازون ، 0.02 M β-glycerophosphate ، 10٪ FBS ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
   2. بالنسبة لتلطيخ Von Kossa ، قم بإعداد المحاليل التالية: 70٪ إيثانول في الماء ، 5٪ نترات فضة في الماء ، ماء مقطر ، 5٪ ثيوسلفات الصوديوم في الماء ، و 1٪ يوزين ب في الماء.
5. التمايز الأديبوجيني:
   1. وسط التمايز الأديبوجيني: تحضير DMEM المكمل ب 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine ، 200 μM إندوميتاسين ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون ، 10 ميكرومتر أنسولين ، 10٪ FBS ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
   2. بالنسبة للتلطيخ بالزيت الأحمر ، قم بإعداد المحاليل التالية: 10٪ فورمالين في ماء منزوع الأيونات ، 60٪ إيزوبروبانول في ماء منزوع الأيونات ، ليزوكروم (صبغة قابلة للذوبان في الدهون) صبغة ديازو (محلول Oil-Red O) في 60٪ إيزوبروبانول ، و 1٪ هيماتوكسيلين في ماء منزوع الأيونات.
6. التمايز الغضروفي:
   1. وسط التمايز الغضروفي: تحضير وسط غضروفي مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
   2. تحضير 10 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
   3. بالنسبة لتلطيخ البروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان ، قم بإعداد الحلول التالية: صبغة Heteroglycan (Alcian Blue 1٪) في حمض الأسيتيك ، درجة الحموضة 2.5 ، البارافين ، الهيماتوكسيلين ، تخفيف سلسلة الإيثانول في الماء (100٪ ، 96٪ ، 80٪ ، و 70٪).

الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة في توصيف النمط الظاهري ل ADSCs بواسطة مقياس التدفق الخلوي. قائمة الأجسام المضادة مع الفلوروكرومات الخاصة بها ، والتخفيفات ، والاستنساخ ، والتركيز النهائي وكذلك وظيفتها في الخلية التي يتم التعبير عنها.

2. الأساليب

ملاحظة: يتم توزيع الأنسجة الدهنية في جميع أنحاء الجسم في مواقع تحت الجلد أو داخل البطن. في الفئران ، تشمل الأنسجة الدهنية الأكثر شيوعا المستخدمة في التجارب البربخ تحت الجلد ، والمساريق ، وخلف الصفاق²². هنا ، يتم عرض خطوات الحصول على الأنسجة الدهنية البربخ (الشكل 1).

الشكل 1: تصميم تجريبي للحصول على الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية من الفئران السويسرية. (أ) باستخدام الإبر ، ضع على لوح الفلين أو الستايروفوم ؛ (ب) رفع الجلد باستخدام ملاقط ، وإجراء قطع في وسط منطقة البطن ، وفصل الجلد عن الصفاق ؛ (ج) تحديد النسيج الدهني الأبيض فوق البربخ؛ (د) نقل الأنسجة إلى وسط DMEM المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ من المضادات الحيوية ، وغسل الأنسجة الدهنية في البربخ جيدا باستخدام PBS ، ونقل الأنسجة إلى محلول الهضم ؛ (ه) ، تجزئة الأنسجة و (F) الاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تهتز بقوة كل 10 دقائق ؛ (ز) بعد عد الخلايا ، ضع صفيحة في 6 آبار ولاحظ مورفولوجيا الخلية تحت المجهر المقلوب. (F) سيتغير مورفولوجيا الخلية من دائرية إلى شبيهة بالخلايا الليفية. شريط المقياس = 22.22 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. استخراج الأنسجة الدهنية البربخ
   ملاحظة: كن على علم بأن جميع الإجراءات يجب أن تتم في ظل ظروف معقمة في خزانة تدفق رقائقي من أجل ضمان زراعة خلايا نقية وخالية من التلوث.
   1. القتل الرحيم للحيوانات باستخدام محلول الكيتامين والزيلازين (100 و10 ملغم/كغ، كما هو موضح في الخطوة 1-1-2) عن طريق الطريق داخل الصفاق.
      ملاحظة: يمكن استخدام طرق القتل الرحيم الأخرى²³. تأكد من موت من خلال تأكيد عدم وجود نبضات القلب.
   2. ضع مع توجيه الجانب البطني لأعلى على لوح من الفلين أو الستايروفوم مغطى بورق الألمنيوم وقم بتثبيته باستخدام إبر معقمة (الشكل 1 أ).
      ملاحظة: لتجنب التلوث ، رش 70٪ كحول في منطقة البطن. بدلا من ذلك ، حلق الشعر بمشرط.
   3. ارفع الجلد باستخدام ملاقط في وسط منطقة البطن وقم بعمل قطع بمقص معقم.
      ملاحظة: مجموعتان من الملقط والمقصات المعقمة ضرورية لتجنب التلوث. أول واحد يستخدم لفتح ، وقطع الجلد والطبقة البريتونية. يستخدم الثاني لالتقاط الأنسجة الدهنية البربخية. أيضا ، احتفظ ب 150 مل من الكحول بنسبة 70٪ في دورق لتنظيف المقص والملاقط بين الخطوات.
   4. أدخل المقص تحت جلد وافتحه لفصله عن الصفاق (الشكل 1 ب). ارفع الطبقة البريتونية باستخدام ملاقط وقطعها بمقص معقم.
   5. استخدم مجموعة أخرى من الملقط والمقصات المعقمة وحدد البربخ فوق الخصيتين والأنسجة الدهنية البيضاء فوق البربخ. اسحب الأنسجة الدهنية البربخية بأكملها باستخدام ملاقط معقمة ، بحجم 2 سم تقريبا ، وقطعها بالقرب من البربخ (الشكل 1C).
   6. ضع الدهون في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل يحتوي على وسط قاعدي وضعه على الثلج (الشكل 1 د). في غطاء المحرك ، انتقل إلى الخطوات التالية كما هو موضح أدناه.
2. عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs)
   ملاحظة: قم بمعالجة العينات في غطاء التدفق الصفحي البيولوجي من الفئة الثانية ، ويجب على الموظفين ارتداء معطف المختبر والقفازات والقناع الجراحي.
   1. اغسل الأنسجة الدهنية البربخية جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة الدم والجزيئات الأخرى من العينة. يمكن للدم أن يثبط إنزيم كولاجيناز من النوع الثاني ويضر بالتجربة.
   2. باستخدام ملقط معقم ، انقل الأنسجة الدهنية من البربخ إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 15-20 مل من محلول الهضم ، محضر كخطوة 1.2.2. تجزئة الأنسجة باستخدام مقص معقم واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (الشكل 1E ، F).
      ملاحظة: يمكن استخدام حمام مائي أو حاضنة عند 37 درجة مئوية في هذه الخطوة. كل 10 دقائق ، يجب هز التعليق بقوة لتسهيل عملية الهضم. لا تمدد وقت الحضانة 1h.
   3. قم بتعطيل كولاجيناز عن طريق تخفيف العينة 1: 1 في الوسط القاعدي وأجهزة الطرد المركزي المعلق عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على الجزء الوعائي من السدى. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسط القاعدي.
   4. تحقق من الصلاحية وعد الخلايا من خلال طريقة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء في غرفة نيوباور باستخدام تخفيف 1:10 أو 1: 100.
      ملاحظة: العائد المتوقع هو حوالي 0.5-1 مليون خلية / غرام من الأنسجة الدهنية المعالجة وصلاحية 80٪.
   5. صفيحة الخلايا المعزولة (0.3-0.5 مليون) في 3 مل من الوسط القاعدي في بئر واحد من صفيحة 6 آبار. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
   6. اليوم التالي: أخرج الوسط من البئر واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 3 مل من الوسط القاعدي. كرر هذه العملية كل 2 أيام حتى تصبح الخلايا 90٪ متقاربة.
      ملاحظة: لاحظ دائما مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر المقلوب ، وتتغير من الجولة إلى الخلايا الليفية (الشكل 1H).
3. توسع الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs)
   ملاحظة: بمجرد أن تنمو الخلايا ~ 90٪ متقاربة ، انتقل إلى الثقافة الفرعية كما هو موضح أدناه.
   1. أخرج الوسط من البئر واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 0.5 مل / بئر من التربسين / EDTA (0.05٪ تربسين ؛ 200 مجم / لتر EDTA) واحتضان اللوحة لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
      ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق في التربسين / EDTA. يجب التحقق من الانفصال الكامل للخلايا تحت المجهر المقلوب. يمكن تسريع العملية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل بعناية أو النقر على جانب اللوحة.
   2. قم بتعطيل الإنزيم عن طريق تخفيف العينة 1: 1 في DMEM المكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ومضادات حيوية بنسبة 1٪.
   3. قسم معلق الخلية إلى 2 بئر وأضف 3 مل من الوسط القاعدي (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ مضاد حيوي). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO₂.
   4. تغيير المتوسطة في اليوم التالي ، ثم كل 2 أيام حتى التقاء 90 ٪.
   5. كرر العملية حتى المقطع الثالث وانتقل إلى النمط الظاهري والتوصيف الوظيفي.
      ملاحظة: لاحظ دائما مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر المقلوب ، وتتغير من الجولة إلى الخلايا الليفية.
4. توصيف الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs)
   1. توصيف النمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي
      1. افصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA، كما هو موضح في الخطوات من 2-3-1 إلى 2-3-2.
      2. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي (50 مل) وأجهزة طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
      3. عد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.2.4 والبذور 0.5-1 × 10⁶ خلايا في 100 ميكرولتر من PBS في 96 لوحة بئر.
         ملاحظة: يعتمد عدد الآبار على لون مرافق الفلوروكروم والمرشحات / الليزر الخاصة بمقياس الخلايا.
      4. أضف الأجسام المضادة (الجدول 1) المخففة في 1٪ BSA في PBS.
         ملاحظة: ليس من الضروري استخدام كتلة Fc لتجنب الارتباط غير المحدد لأننا نستخدم بالفعل BSA لتخفيف الأجسام المضادة. حجز عينة من الخلايا دون تلقي الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها للسيطرة على تلطيخ. يمكن دمج الأجسام المضادة في نفس البئر وفقا لصبغة الفلوروكروم ومقياس الخلايا المتوفر في المختبر. يمكن إضافة جميع الأجسام المضادة الموضحة في الجدول 1 في نفس البئر ، باستثناء CD71 FITC و CD29 FITC ، والتي يجب أن تكون في آبار مختلفة بسبب نفس الفلوروكروم.
      5. احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
      6. اغسل الخلايا ، ثم أكمل الحجم إلى 200 ميكرولتر باستخدام PBS ، وطرد مركزي للوحة عند 252 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
      7. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر لكل بئر من 2 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. قم بتخزين الخلايا في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى يتم تحليلها في مقياس التدفق الخلوي.
         ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، احصل على الخلايا الموجودة على مقياس التدفق الخلوي في أسرع وقت ممكن. يتحلل سطوع مضان العلامات بشكل ملحوظ بعد 48 ساعة لمعظم الفلوروكرومات. لذلك ، لا تتجاوز 48 ساعة لقراءة اللوحة. يوصى بالاستحواذ على 30000 حدث.
      8. استخدم استراتيجية البوابات الموضحة في الشكل 2B لتحديد مجتمع ASC.
   2. التوصيف الوظيفي: التمايز العظمي
      1. فصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA (كما هو موضح في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-2)، وجمع الخلايا وطردها مركزيا (كما هو موضح في الخطوتين 2-4-1-2 و2-4-1-2)، وعدها (كما هو موضح في الخطوات 2-2-4).
      2. صفيحة ، في ثلاث نسخ ، 2 × 10⁵ خلايا لكل بئر في 6 ألواح جيدة في الإنسي القاعدي (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية) ؛ احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
         ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى لوحين من 6 آبار ، واحدة لكل وقت تمايز (14 و 21 يوما).
      3. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسيط إلى الوسط العظمي (الخطوة 1.4.1).
         ملاحظة: احتياطي 3 آبار يتم استزراعها فقط مع الوسط القاعدي ، والذي سيكون التحكم في التمايز.
      4. خلايا المزرعة لمدة 14 و 21 يوما في الوسط العظمي والخلايا الضابطة ، وتغيير الوسائط كل 3 أيام. انتقل إلى تلطيخ فون كوسا (الخطوة 1.4.2) لتقييم العقيدات المعدنية في نهاية كل فترة استزراع.
      5. نضح الوسط من كل بئر وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثبت الخلايا ب 2 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT). اغسل الخلايا بعناية في الماء الجاري.
      6. أضف 2 مل من محلول نترات الفضة بنسبة 5٪ واحتضان اللوحة في ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة. اغسل الخلايا بالماء المقطر. أضف 2 مل من ثيوسلفات الصوديوم 5٪ ، واحتضانها لمدة 5 دقائق. تغسل بالماء المقطر.
      7. كونترتستين مع 2 مل من اليوزين لمدة 40 ثانية. اغسل بالماء المقطر حتى تتم إزالة محلول التلوين ، وتصور التلوين باستخدام المجهر الضوئي.
   3. التوصيف الوظيفي: التمايز الأديبوجيني
      1. فصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA (كما هو موضح في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-2)، وجمع الخلايا وطردها مركزيا (كما هو موضح في الخطوتين 2-4-1-2 و2-4-1-2)، وعدها (كما هو موضح في الخطوات 2-2-4).
      2. لوحة 2 × 10⁵ خلايا لكل بئر في 6 ألواح جيدة في الإنسي القاعدي (DMEM تستكمل مع 10 ٪ FBS و 1 ٪ المضادات الحيوية) ؛ احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
         ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى لوحين من 6 آبار ، واحدة لكل وقت تمايز (14 و 21 يوما).
      3. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسط إلى الوسط الدهني المنشأ (الخطوة 2.5.1).
         ملاحظة: قم بحجز 3 آبار يتم استزراعها فقط باستخدام الوسط القاعدي كعنصر تحكم.
      4. خلايا الثقافة لمدة 14 و 21 يوما في وسط دهني المنشأ ، وتغيير الوسائط كل 3 أيام. في نهاية كل فترة استزراع ، انتقل إلى تلطيخ Oil-Red O (الخطوات 2.4.3.5-2.4.3.7) ، وهو مؤشر على تراكم الدهون داخل الخلايا.
      5. نضح وسائل الإعلام من كل بئر. اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا في 2 مل من 10 ٪ الفورمالين لمدة 1 ساعة. اغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ، ثم مرة واحدة بالماء.
      6. صبغ مع 2 مل من محلول Oil-Red O في 60٪ إيزوبروبانول لمدة 5 دقائق. تغسل مرة واحدة بالماء المقطر.
      7. كونترستاين مع 2 مل من 1٪ هيماتوكسيلين مخفف 1: 2 في الماء المقطر لمدة دقيقة واحدة. اغسل بالماء المقطر حتى تتم إزالة محلول التلوين ، وتصور العينات الملطخة باستخدام المجهر الضوئي.
   4. التوصيف الوظيفي: التمايز الغضروفي
      1. فصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA (كما هو موضح في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-2)، وجمع الخلايا وطردها مركزيا (كما هو موضح في الخطوتين 2-4-1-2 و2-4-1-2)، وعدها (كما هو موضح في الخطوات 2-2-4).
      2. ضع 5 × 10⁵ ADSCs في أربعة أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبيلين وأجهزة طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق لتشكيل حبيبات. تخلص من المادة الطافية.
      3. استزراع الكريات في أنبوب مخروطي في وسط غضروفي (الخطوة 1.6.1) أو وسط قاعدي فقط (التحكم في التمايز) لمدة 14 و 21 يوما عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂. قم بتغيير الوسيط كل 3 أيام وتجنب إزالة الكريات.
         ملاحظة: تشير كل حبيبة خلوية إلى كل وقت استزراع ، بالإضافة إلى عناصر التحكم الخاصة بها التي تزرع فقط باستخدام الوسط القاعدي.
      4. في نهاية كل نقطة زمنية للاستزراع ، اجمع الكريات باستخدام ملاقط ذات أطراف دقيقة وضعها في طبق من 24 بئرا. المضي قدما في التقسيم النسيجي وتلطيخ البروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان (الخطوات 2.4.4.5.-2.4.4.9).
         ملاحظة: تتم معالجة كل حبيبات في بئر منفصلة.
      5. ثبت الكريات في 2 مل من 10٪ من الفورمالديهايد المخزن لمدة 30 دقيقة. تخلص من محلول الفورمالديهايد ، وأضف 2 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. قم بإزالة الحبيبات من الأنبوب المخروطي باستخدام طرف وقم بتضمين الكريات في البارافين.
      6. باستخدام ميكروتوم البارافين الدوار ، قم بعمل أقسام نسيجية 5 ميكرومتر. احتضن الأقسام لمدة 15 دقيقة عند 60 درجة مئوية ، واغمرها مرتين في الزيلين (لمدة 5 و 15 دقيقة).
      7. أعد ترطيب العينات عن طريق غمر الأقسام النسيجية في حمامات الكحول بتركيزات متناقصة (100٪ و 96٪ و 80٪ و 70٪) لمدة 2 دقيقة لكل منها ، ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
      8. استمر في تلطيخ العينات بالأزرق Alcian 1٪ في حمض الخليك ، درجة الحموضة 2.5 ، لمدة 30 دقيقة.
      9. كونترستيك مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، ويغسل بالماء المقطر. قم بالتركيب باستخدام DPX (أداة تركيب للأنسجة) أو محلول تركيب آخر وتصور العينات باستخدام المجهر الضوئي.

أظهرت الخلايا المستخرجة من الأنسجة الدهنية وفقا للبروتوكول المقدم هنا مورفولوجيا مطابقة للحد الأدنى من معايير MSCs التي اقترحها ISCT. نظرة عامة على البروتوكول موضحة في الشكل 1. ومن الناحية الظاهرية، أظهرت كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) التصاق بالتشكل البلاستيكي والشبيه بالخلايا الليفية في الأيام الأولى لزراعة الخلايا (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك ، نمت بشكل متجانس وشكلت مستعمرات. علاوة على ذلك، أظهرت ADSCs تعبيرا منخفضا عن CD34 (2.12٪) و CD45 (1.81٪)، وكلاهما علامات المكونة للدم، وتعبيرا عاليا عن CD71 (42.6٪)، CD29 (74.2٪)، وCD90 (55.1٪)، وجميع علامات الخلايا المتوسطة (الشكل 2B).

الشكل 2: توصيف النمط الظاهري للخلايا المشتقة من الأنسجة الدهنية. (أ) تغير مورفولوجيا كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي من جولة إلى خلايا ليفية في الأيام 2 و4 و8 من الثقافة؛ شريط المقياس = 22.22 ميكرومتر. (B) الرسوم البيانية للعلامات المعبر عنها (CD71 و CD29 و CD90) أم لا (CD34 و CD45) بواسطة ASC. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من ميراندا وآخرين.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

من الناحية الوظيفية، أظهرت كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) تعدد القدرات للتمييز إلى بانيات العظم، والأرومات الشحمية، والأرومة الغضروفية عند استزراعها في وسائط مكيفة لكل سلالة لمدة 14 أو 21 يوما (الشكل 3). كشف تلطيخ فون كوسا عن عقيدات معدنية في المصفوفة خارج الخلية ، وهي سمة من سمات عملية تكوين العظم (الشكل 3). أظهر تلطيخ O باللون الأحمر الزيتي فجوات دهنية في سيتوبلازم ADSCs ، وأكد تلطيخ Alcian Blue وجود الجليكوزامينوجليكان في المصفوفة خارج الخلية (الشكل 3). معا ، أكدت الخصائص الظاهرية والوظيفية عدد الخلايا المستخرجة من الأنسجة الدهنية البربخية على أنها MSCs.

الشكل 3: التوصيف الوظيفي للخلايا المشتقة من الأنسجة الدهنية. إمكانات متعددة السلالات العظمية والدهنية والغضروفية المنشأ ل ADSC بعد 14 و 21 يوما من الثقافة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (اللوحة العلوية) ، 100 ميكرومتر (الألواح الوسطى والسفلية). وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من ميراندا وآخرين.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.