مقالة منهجية

العزلة ، التوسع في المختبر ، وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة من الأنسجة الدهنية في البربخ الفأر

DOI:

10.3791/65722

⸱

يناير 12, 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة الدهنية هي مصدر ممتاز للخلايا الجذعية الوسيطة. هنا ، نقدم عملية استخراج وزراعة وتوصيف الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) خطوة بخطوة من الأنسجة الدهنية للبربخ في الفئران السويسرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت دراسة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على نطاق واسع كنهج علاجي جديد ، وذلك أساسا لوقف الالتهاب المتفاقم بسبب قدرتها على تعديل الاستجابة المناعية. MSCs هي خلايا ذات امتيازات مناعية قادرة على البقاء على قيد الحياة في متلقي الزرع الخيفي غير المتوافق مناعيا بناء على التعبير المنخفض عن جزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) وفي استخدام العلاج القائم على الخلايا للزراعة الخيفية. يمكن عزل هذه الخلايا من عدة أنسجة ، وأكثرها استخداما هو نخاع العظم والأنسجة الدهنية. نحن نقدم بروتوكولا سهلا لعزل وزراعة وتوصيف MSCs من الأنسجة الدهنية للبربخ للفئران. يتم استئصال الأنسجة الدهنية البربخية جراحيا ، وتجزئتها جسديا ، وهضمها بمحلول كولاجيناز من النوع الثاني بنسبة 0.15٪. بعد ذلك ، يتم استزراع الخلايا الجذعية الأولية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) وتوسيعها في المختبر ، ويتم إجراء توصيف النمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي. كما نقدم الخطوات اللازمة للتمييز بين كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) إلى خلايا عظمية المنشأ، وخلايا دهنية، وخلايا غضروفية المنشأ، متبوعة بالتوصيف الوظيفي لكل سلالة خلية. يمكن استخدام البروتوكول المقدم هنا للتجارب في الجسم الحي وخارج الجسم الحي ، وكبديل ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون لتوليد خلايا خالدة تشبه MSCs.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي خلايا بالغة متعددة الإمكانات تتمايز إلى خلايا مثل بانيات العظم والأرومة الغضروفية والخلايا الشحمية 1,2. توجد هذه الخلايا في العديد من الأعضاء ، ولهذا السبب ، يمكن استخراجها من الأنسجة البالغة مثل نخاع العظام والعضلات والدهون وبصيلات الشعر وجذر الأسنان والمشيمة والأدمة و perichondrium والحبل السريوالرئة والكبد والطحال 3,4.

تم الإبلاغ عن آثار MSCs على علم وظائف الأعضاء والجهاز المناعي 5,6. كانت هذه الخلايا واعدة لعلاج العديد من الأمراض ، سواء في الطب البشري أو البيطري. يمكن ل MSCs التحكم في الالتهاب وتعزيز تكوين الأوعية الدموية وتوازن الأنسجة من خلال آليات مختلفة ، مثل ملامسة الخلايا الخلوية ، والعوامل القابلة للذوبان ، والحويصلات الصغيرة خارج الخلية7،8،9،10. علاوة على ذلك ، فإن MSCs هي خلايا ذات امتيازات مناعية قادرة على البقاء على قيد الحياة في متلقي الزرع الخيفي غير المتوافق مناعيا لأن هذه الخلايا تظهر تعبيرا منخفضا عن جزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) وتستخدم في العلاج القائم على الخلايا للزراعة الخيفية11,12. إن الاستمناع المنخفض جنبا إلى جنب مع إمكانات التجدد يجعل MSCs مرشحين مثاليين للعلاج بالخلايا ، مثل مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GvHD) 13 ، الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) 14 ، والتصلب المتعدد15 ، من بين أمور أخرى16,17.

على الرغم من حقيقة أن MSCs موجودة في العديد من الأنسجة البالغة ، فإن الأنسجة الدهنية توفر مزايا على المصادر الأخرى ، مثل إمكانية الوصول للحصاد ، مع الحد الأدنى من التدخل الجراحي. عدد كبير من الخلايا المتاحة مع معدل توسع مرتفع ؛ وتوسيع سهل في المختبر باستخدام بروتوكول سهل الأداء دون الحاجة إلى معدات محددة ومواد منخفضة التكلفة18،19،20. بمجرد استخراجها ، يجب تمييز الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) على النحو الذي حددته الجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT)21. وبالتالي ، يجب أن تظهر MSCs مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية ، والالتزام بالثقافة البلاستيكية ، معبرة عن نسبة عالية (≥95٪) من علامات اللحمة المتوسطة مثل endoglin (CD105) ، ecto-5'-nucleotidase (CD73) و Thy-1 (CD90) ، ونسبة منخفضة (≤2٪) من علامات المكونة للدم مثل مستضد الكريات البيض المشترك (CD45) ، البروتين الفوسفوغليكولي عبر الغشاء (CD34) ، البروتين السكري الغشائي المرتبط بالجليكوليبيد (CD14) ، إنتغرين ألفا M (CD11b) ، سلسلة ألفا المرتبطة بالبروتين المرتبط بمستقبلات مستضد الخلايا البائية (CD79α) أو مستضد سطح الخلايا اللمفاوية B B4 (CD19) ومستضد الكريات البيض البشرية من الفئة الثانية (HLA-II). علاوة على ذلك ، يلزم توصيف وظيفي ، ويجب أن تكون الخلايا قادرة على التمايز إلى خلايا بانيات عظمية أو أرومة غضروفية أو خلايا أرومة دهنية21.

هنا ، نوضح كيفية الحصول على MSCs من الأنسجة الدهنية البربخية باستخدام التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي للدراسات في المختبر والتوصيف المورفولوجي الذي تم تحديده مسبقا بواسطة ISCT.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية لأخلاقيات وتمت الموافقة عليها من قبل اللجان المؤسسية للرعاية والاستخدام من جامعة ولاية سانتا كروز بموجب البروتوكول رقم 021/22. تم الحصول على ذكور الفئران السويسرية (6-8 أسابيع) من مختبر تربية وصيانتها وتجريبها - مرفق البحوث الحيوانية بجامعة ولاية سانتا كروز (LaBIO-UESC) ، والتي يتم الحفاظ عليها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ، وتتلقى الماء والغذاء حسب الطلب مع دورات الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة.

ملاحظة: يمكن استخدام سلالة الفئران الأخرى ؛ نوصي باستخدام الفئران البالغة (6-8 أسابيع) لأنها تحتوي على أنسجة وخلايا دهنية أكثر تطورا ذات نشاط تكاثري عالي.

1. التحضير

ملاحظة: قبل المتابعة ، قم بإعداد الكواشف التالية الموضحة أدناه. انظر جدول المواد للحصول على معلومات حول الكاشف ومورد المواد. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية مثل الأقنعة والقبعات ومعاطف المختبر والقفازات في جميع الإجراءات العملية.

  1. استخراج الأنسجة الدهنية البربخ
    1. احتفظ بمواد الجراحة: ثلاث مجموعات من الملقط والمقصات المعقمة ، وخمس إبر ، وكأس يحتوي على 200 مل من الإيثانول بنسبة 70٪.
    2. تحضير مخدر نهائي ، وخلط الكيتامين (100 ملغ / كغ) والزيلازين (10 ملغ / كغ).
  2. ثقافة ADSCs
    1. الوسط القاعدي: تحضير وسائط الجلوكوز عالية الجلوكوز المعدلة (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب ، 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 مجم / مل ستربتومايسين.
    2. محلول الهضم: تحضير 0.15٪ من كولاجيناز النوع الثاني في PBS معقم في مرشح 0.25 ميكرومتر.
      ملاحظة: ليس من الضروري استخدام المضادات الحيوية الأربعة الموصوفة في الوسط القاعدي. سيعتمد ذلك على ظروف زراعة الخلايا في المختبر حيث يتم تنفيذ ذلك.
  3. توصيف النمط الظاهري ل ADSCs
    1. تحضير 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني.
    2. تمييع الأجسام المضادة للفأر كما هو مذكور في الجدول 1.
    3. إعداد 2 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
  4. التمايز العظمي ل ADSCs
    1. وسط التمايز العظمي: تحضير DMEM المكمل بحمض الأسكوربيك 5.67 M ، 10 نانومتر ديكساميثازون ، 0.02 M β-glycerophosphate ، 10٪ FBS ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    2. بالنسبة لتلطيخ Von Kossa ، قم بإعداد المحاليل التالية: 70٪ إيثانول في الماء ، 5٪ نترات فضة في الماء ، ماء مقطر ، 5٪ ثيوسلفات الصوديوم في الماء ، و 1٪ يوزين ب في الماء.
  5. التمايز الأديبوجيني:
    1. وسط التمايز الأديبوجيني: تحضير DMEM المكمل ب 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine ، 200 μM إندوميتاسين ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون ، 10 ميكرومتر أنسولين ، 10٪ FBS ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    2. بالنسبة للتلطيخ بالزيت الأحمر ، قم بإعداد المحاليل التالية: 10٪ فورمالين في ماء منزوع الأيونات ، 60٪ إيزوبروبانول في ماء منزوع الأيونات ، ليزوكروم (صبغة قابلة للذوبان في الدهون) صبغة ديازو (محلول Oil-Red O) في 60٪ إيزوبروبانول ، و 1٪ هيماتوكسيلين في ماء منزوع الأيونات.
  6. التمايز الغضروفي:
    1. وسط التمايز الغضروفي: تحضير وسط غضروفي مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    2. تحضير 10 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
    3. بالنسبة لتلطيخ البروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان ، قم بإعداد الحلول التالية: صبغة Heteroglycan (Alcian Blue 1٪) في حمض الأسيتيك ، درجة الحموضة 2.5 ، البارافين ، الهيماتوكسيلين ، تخفيف سلسلة الإيثانول في الماء (100٪ ، 96٪ ، 80٪ ، و 70٪).

الأجسام المضادة / الفلوروفورالتخفيفاستنساخالتركيز النهائي (ميكروغرام / مل)الوظيفة والخلية التي يتم التعبير عنها
CD34- PE1:100رام342عامل التصاق الخلية. الخلايا الجذعية المكونة للدم.
CD45- APC1:10030-F112المساعدة في تفعيل الكريات البيض. أعرب في الكريات البيض.
CD71- FITC1:100ج25يتحكم في امتصاص الحديد أثناء تكاثر الخلايا. الخلايا المتكاثرة والخلايا الشبكية وخلايا السلائف.
CD29- FITC1:100ها2/55الالتصاق والتنشيط ، التطور الجنيني ، الكريات البيض ، الخلايا المتغصنة ، الصفائح الدموية ، الخلايا البدينة ، الخلايا الليفية ، والخلايا البطانية.
CD90- بيرCP1:100الثور-72الإشارات والالتصاق. الخلايا الليمفاوية التائية ، NK ، وحيدات ، الخلايا الجذعية المكونة للدم ، الخلايا العصبية ، والخلايا الليفية.

الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة في توصيف النمط الظاهري ل ADSCs بواسطة مقياس التدفق الخلوي. قائمة الأجسام المضادة مع الفلوروكرومات الخاصة بها ، والتخفيفات ، والاستنساخ ، والتركيز النهائي وكذلك وظيفتها في الخلية التي يتم التعبير عنها.

2. الأساليب

ملاحظة: يتم توزيع الأنسجة الدهنية في جميع أنحاء الجسم في مواقع تحت الجلد أو داخل البطن. في الفئران ، تشمل الأنسجة الدهنية الأكثر شيوعا المستخدمة في التجارب البربخ تحت الجلد ، والمساريق ، وخلف الصفاق22. هنا ، يتم عرض خطوات الحصول على الأنسجة الدهنية البربخ (الشكل 1).

figure-protocol-1
الشكل 1: تصميم تجريبي للحصول على الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية من الفئران السويسرية. (أ) باستخدام الإبر ، ضع على لوح الفلين أو الستايروفوم ؛ (ب) رفع الجلد باستخدام ملاقط ، وإجراء قطع في وسط منطقة البطن ، وفصل الجلد عن الصفاق ؛ (ج) تحديد النسيج الدهني الأبيض فوق البربخ؛ (د) نقل الأنسجة إلى وسط DMEM المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ من المضادات الحيوية ، وغسل الأنسجة الدهنية في البربخ جيدا باستخدام PBS ، ونقل الأنسجة إلى محلول الهضم ؛ (ه) ، تجزئة الأنسجة و (F) الاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تهتز بقوة كل 10 دقائق ؛ (ز) بعد عد الخلايا ، ضع صفيحة في 6 آبار ولاحظ مورفولوجيا الخلية تحت المجهر المقلوب. (F) سيتغير مورفولوجيا الخلية من دائرية إلى شبيهة بالخلايا الليفية. شريط المقياس = 22.22 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. استخراج الأنسجة الدهنية البربخ
    ملاحظة: كن على علم بأن جميع الإجراءات يجب أن تتم في ظل ظروف معقمة في خزانة تدفق رقائقي من أجل ضمان زراعة خلايا نقية وخالية من التلوث.
    1. القتل الرحيم للحيوانات باستخدام محلول الكيتامين والزيلازين (100 و10 ملغم/كغ، كما هو موضح في الخطوة 1-1-2) عن طريق الطريق داخل الصفاق.
      ملاحظة: يمكن استخدام طرق القتل الرحيم الأخرى23. تأكد من موت من خلال تأكيد عدم وجود نبضات القلب.
    2. ضع مع توجيه الجانب البطني لأعلى على لوح من الفلين أو الستايروفوم مغطى بورق الألمنيوم وقم بتثبيته باستخدام إبر معقمة (الشكل 1 أ).
      ملاحظة: لتجنب التلوث ، رش 70٪ كحول في منطقة البطن. بدلا من ذلك ، حلق الشعر بمشرط.
    3. ارفع الجلد باستخدام ملاقط في وسط منطقة البطن وقم بعمل قطع بمقص معقم.
      ملاحظة: مجموعتان من الملقط والمقصات المعقمة ضرورية لتجنب التلوث. أول واحد يستخدم لفتح ، وقطع الجلد والطبقة البريتونية. يستخدم الثاني لالتقاط الأنسجة الدهنية البربخية. أيضا ، احتفظ ب 150 مل من الكحول بنسبة 70٪ في دورق لتنظيف المقص والملاقط بين الخطوات.
    4. أدخل المقص تحت جلد وافتحه لفصله عن الصفاق (الشكل 1 ب). ارفع الطبقة البريتونية باستخدام ملاقط وقطعها بمقص معقم.
    5. استخدم مجموعة أخرى من الملقط والمقصات المعقمة وحدد البربخ فوق الخصيتين والأنسجة الدهنية البيضاء فوق البربخ. اسحب الأنسجة الدهنية البربخية بأكملها باستخدام ملاقط معقمة ، بحجم 2 سم تقريبا ، وقطعها بالقرب من البربخ (الشكل 1C).
    6. ضع الدهون في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل يحتوي على وسط قاعدي وضعه على الثلج (الشكل 1 د). في غطاء المحرك ، انتقل إلى الخطوات التالية كما هو موضح أدناه.
  2. عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs)
    ملاحظة: قم بمعالجة العينات في غطاء التدفق الصفحي البيولوجي من الفئة الثانية ، ويجب على الموظفين ارتداء معطف المختبر والقفازات والقناع الجراحي.
    1. اغسل الأنسجة الدهنية البربخية جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة الدم والجزيئات الأخرى من العينة. يمكن للدم أن يثبط إنزيم كولاجيناز من النوع الثاني ويضر بالتجربة.
    2. باستخدام ملقط معقم ، انقل الأنسجة الدهنية من البربخ إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 15-20 مل من محلول الهضم ، محضر كخطوة 1.2.2. تجزئة الأنسجة باستخدام مقص معقم واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (الشكل 1E ، F).
      ملاحظة: يمكن استخدام حمام مائي أو حاضنة عند 37 درجة مئوية في هذه الخطوة. كل 10 دقائق ، يجب هز التعليق بقوة لتسهيل عملية الهضم. لا تمدد وقت الحضانة 1h.
    3. قم بتعطيل كولاجيناز عن طريق تخفيف العينة 1: 1 في الوسط القاعدي وأجهزة الطرد المركزي المعلق عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على الجزء الوعائي من السدى. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسط القاعدي.
    4. تحقق من الصلاحية وعد الخلايا من خلال طريقة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء في غرفة نيوباور باستخدام تخفيف 1:10 أو 1: 100.
      ملاحظة: العائد المتوقع هو حوالي 0.5-1 مليون خلية / غرام من الأنسجة الدهنية المعالجة وصلاحية 80٪.
    5. صفيحة الخلايا المعزولة (0.3-0.5 مليون) في 3 مل من الوسط القاعدي في بئر واحد من صفيحة 6 آبار. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    6. اليوم التالي: أخرج الوسط من البئر واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 3 مل من الوسط القاعدي. كرر هذه العملية كل 2 أيام حتى تصبح الخلايا 90٪ متقاربة.
      ملاحظة: لاحظ دائما مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر المقلوب ، وتتغير من الجولة إلى الخلايا الليفية (الشكل 1H).
  3. توسع الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs)
    ملاحظة: بمجرد أن تنمو الخلايا ~ 90٪ متقاربة ، انتقل إلى الثقافة الفرعية كما هو موضح أدناه.
    1. أخرج الوسط من البئر واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 0.5 مل / بئر من التربسين / EDTA (0.05٪ تربسين ؛ 200 مجم / لتر EDTA) واحتضان اللوحة لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
      ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق في التربسين / EDTA. يجب التحقق من الانفصال الكامل للخلايا تحت المجهر المقلوب. يمكن تسريع العملية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل بعناية أو النقر على جانب اللوحة.
    2. قم بتعطيل الإنزيم عن طريق تخفيف العينة 1: 1 في DMEM المكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ومضادات حيوية بنسبة 1٪.
    3. قسم معلق الخلية إلى 2 بئر وأضف 3 مل من الوسط القاعدي (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ مضاد حيوي). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2.
    4. تغيير المتوسطة في اليوم التالي ، ثم كل 2 أيام حتى التقاء 90 ٪.
    5. كرر العملية حتى المقطع الثالث وانتقل إلى النمط الظاهري والتوصيف الوظيفي.
      ملاحظة: لاحظ دائما مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر المقلوب ، وتتغير من الجولة إلى الخلايا الليفية.
  4. توصيف الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs)
    1. توصيف النمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي
      1. افصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA، كما هو موضح في الخطوات من 2-3-1 إلى 2-3-2.
      2. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي (50 مل) وأجهزة طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
      3. عد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.2.4 والبذور 0.5-1 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من PBS في 96 لوحة بئر.
        ملاحظة: يعتمد عدد الآبار على لون مرافق الفلوروكروم والمرشحات / الليزر الخاصة بمقياس الخلايا.
      4. أضف الأجسام المضادة (الجدول 1) المخففة في 1٪ BSA في PBS.
        ملاحظة: ليس من الضروري استخدام كتلة Fc لتجنب الارتباط غير المحدد لأننا نستخدم بالفعل BSA لتخفيف الأجسام المضادة. حجز عينة من الخلايا دون تلقي الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها للسيطرة على تلطيخ. يمكن دمج الأجسام المضادة في نفس البئر وفقا لصبغة الفلوروكروم ومقياس الخلايا المتوفر في المختبر. يمكن إضافة جميع الأجسام المضادة الموضحة في الجدول 1 في نفس البئر ، باستثناء CD71 FITC و CD29 FITC ، والتي يجب أن تكون في آبار مختلفة بسبب نفس الفلوروكروم.
      5. احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
      6. اغسل الخلايا ، ثم أكمل الحجم إلى 200 ميكرولتر باستخدام PBS ، وطرد مركزي للوحة عند 252 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
      7. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر لكل بئر من 2 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. قم بتخزين الخلايا في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى يتم تحليلها في مقياس التدفق الخلوي.
        ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، احصل على الخلايا الموجودة على مقياس التدفق الخلوي في أسرع وقت ممكن. يتحلل سطوع مضان العلامات بشكل ملحوظ بعد 48 ساعة لمعظم الفلوروكرومات. لذلك ، لا تتجاوز 48 ساعة لقراءة اللوحة. يوصى بالاستحواذ على 30000 حدث.
      8. استخدم استراتيجية البوابات الموضحة في الشكل 2B لتحديد مجتمع ASC.
    2. التوصيف الوظيفي: التمايز العظمي
      1. فصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA (كما هو موضح في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-2)، وجمع الخلايا وطردها مركزيا (كما هو موضح في الخطوتين 2-4-1-2 و2-4-1-2)، وعدها (كما هو موضح في الخطوات 2-2-4).
      2. صفيحة ، في ثلاث نسخ ، 2 × 105 خلايا لكل بئر في 6 ألواح جيدة في الإنسي القاعدي (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية) ؛ احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
        ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى لوحين من 6 آبار ، واحدة لكل وقت تمايز (14 و 21 يوما).
      3. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسيط إلى الوسط العظمي (الخطوة 1.4.1).
        ملاحظة: احتياطي 3 آبار يتم استزراعها فقط مع الوسط القاعدي ، والذي سيكون التحكم في التمايز.
      4. خلايا المزرعة لمدة 14 و 21 يوما في الوسط العظمي والخلايا الضابطة ، وتغيير الوسائط كل 3 أيام. انتقل إلى تلطيخ فون كوسا (الخطوة 1.4.2) لتقييم العقيدات المعدنية في نهاية كل فترة استزراع.
      5. نضح الوسط من كل بئر وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثبت الخلايا ب 2 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT). اغسل الخلايا بعناية في الماء الجاري.
      6. أضف 2 مل من محلول نترات الفضة بنسبة 5٪ واحتضان اللوحة في ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة. اغسل الخلايا بالماء المقطر. أضف 2 مل من ثيوسلفات الصوديوم 5٪ ، واحتضانها لمدة 5 دقائق. تغسل بالماء المقطر.
      7. كونترتستين مع 2 مل من اليوزين لمدة 40 ثانية. اغسل بالماء المقطر حتى تتم إزالة محلول التلوين ، وتصور التلوين باستخدام المجهر الضوئي.
    3. التوصيف الوظيفي: التمايز الأديبوجيني
      1. فصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA (كما هو موضح في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-2)، وجمع الخلايا وطردها مركزيا (كما هو موضح في الخطوتين 2-4-1-2 و2-4-1-2)، وعدها (كما هو موضح في الخطوات 2-2-4).
      2. لوحة 2 × 105 خلايا لكل بئر في 6 ألواح جيدة في الإنسي القاعدي (DMEM تستكمل مع 10 ٪ FBS و 1 ٪ المضادات الحيوية) ؛ احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
        ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى لوحين من 6 آبار ، واحدة لكل وقت تمايز (14 و 21 يوما).
      3. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسط إلى الوسط الدهني المنشأ (الخطوة 2.5.1).
        ملاحظة: قم بحجز 3 آبار يتم استزراعها فقط باستخدام الوسط القاعدي كعنصر تحكم.
      4. خلايا الثقافة لمدة 14 و 21 يوما في وسط دهني المنشأ ، وتغيير الوسائط كل 3 أيام. في نهاية كل فترة استزراع ، انتقل إلى تلطيخ Oil-Red O (الخطوات 2.4.3.5-2.4.3.7) ، وهو مؤشر على تراكم الدهون داخل الخلايا.
      5. نضح وسائل الإعلام من كل بئر. اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا في 2 مل من 10 ٪ الفورمالين لمدة 1 ساعة. اغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ، ثم مرة واحدة بالماء.
      6. صبغ مع 2 مل من محلول Oil-Red O في 60٪ إيزوبروبانول لمدة 5 دقائق. تغسل مرة واحدة بالماء المقطر.
      7. كونترستاين مع 2 مل من 1٪ هيماتوكسيلين مخفف 1: 2 في الماء المقطر لمدة دقيقة واحدة. اغسل بالماء المقطر حتى تتم إزالة محلول التلوين ، وتصور العينات الملطخة باستخدام المجهر الضوئي.
    4. التوصيف الوظيفي: التمايز الغضروفي
      1. فصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA (كما هو موضح في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-2)، وجمع الخلايا وطردها مركزيا (كما هو موضح في الخطوتين 2-4-1-2 و2-4-1-2)، وعدها (كما هو موضح في الخطوات 2-2-4).
      2. ضع 5 × 105 ADSCs في أربعة أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبيلين وأجهزة طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق لتشكيل حبيبات. تخلص من المادة الطافية.
      3. استزراع الكريات في أنبوب مخروطي في وسط غضروفي (الخطوة 1.6.1) أو وسط قاعدي فقط (التحكم في التمايز) لمدة 14 و 21 يوما عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2. قم بتغيير الوسيط كل 3 أيام وتجنب إزالة الكريات.
        ملاحظة: تشير كل حبيبة خلوية إلى كل وقت استزراع ، بالإضافة إلى عناصر التحكم الخاصة بها التي تزرع فقط باستخدام الوسط القاعدي.
      4. في نهاية كل نقطة زمنية للاستزراع ، اجمع الكريات باستخدام ملاقط ذات أطراف دقيقة وضعها في طبق من 24 بئرا. المضي قدما في التقسيم النسيجي وتلطيخ البروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان (الخطوات 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        ملاحظة: تتم معالجة كل حبيبات في بئر منفصلة.
      5. ثبت الكريات في 2 مل من 10٪ من الفورمالديهايد المخزن لمدة 30 دقيقة. تخلص من محلول الفورمالديهايد ، وأضف 2 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. قم بإزالة الحبيبات من الأنبوب المخروطي باستخدام طرف وقم بتضمين الكريات في البارافين.
      6. باستخدام ميكروتوم البارافين الدوار ، قم بعمل أقسام نسيجية 5 ميكرومتر. احتضن الأقسام لمدة 15 دقيقة عند 60 درجة مئوية ، واغمرها مرتين في الزيلين (لمدة 5 و 15 دقيقة).
      7. أعد ترطيب العينات عن طريق غمر الأقسام النسيجية في حمامات الكحول بتركيزات متناقصة (100٪ و 96٪ و 80٪ و 70٪) لمدة 2 دقيقة لكل منها ، ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
      8. استمر في تلطيخ العينات بالأزرق Alcian 1٪ في حمض الخليك ، درجة الحموضة 2.5 ، لمدة 30 دقيقة.
      9. كونترستيك مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، ويغسل بالماء المقطر. قم بالتركيب باستخدام DPX (أداة تركيب للأنسجة) أو محلول تركيب آخر وتصور العينات باستخدام المجهر الضوئي.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت الخلايا المستخرجة من الأنسجة الدهنية وفقا للبروتوكول المقدم هنا مورفولوجيا مطابقة للحد الأدنى من معايير MSCs التي اقترحها ISCT. نظرة عامة على البروتوكول موضحة في الشكل 1. ومن الناحية الظاهرية، أظهرت كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) التصاق بالتشكل البلاستيكي والشبيه بالخلايا الليفية في الأيام الأولى لزراعة الخلايا (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك ، نمت بشكل متجانس وشكلت مستعمرات. علاوة على ذلك، أظهرت ADSCs تعبيرا منخفضا عن CD34 (2.12٪) و CD45 (1.81٪)، وكلاهما علامات المكونة للدم، وتعبيرا عاليا عن CD71 (42.6٪)، CD29 (74.2٪)، وCD90 (55.1٪)، وجميع علامات الخلايا المتوسطة (الشكل 2B).

figure-results-1
الشكل 2: توصيف النمط الظاهري للخلايا المشتقة من الأنسجة الدهنية. (أ) تغير مورفولوجيا كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي من جولة إلى خلايا ليفية في الأيام 2 و4 و8 من الثقافة؛ شريط المقياس = 22.22 ميكرومتر. (B) الرسوم البيانية للعلامات المعبر عنها (CD71 و CD29 و CD90) أم لا (CD34 و CD45) بواسطة ASC. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من ميراندا وآخرين.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

من الناحية الوظيفية، أظهرت كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) تعدد القدرات للتمييز إلى بانيات العظم، والأرومات الشحمية، والأرومة الغضروفية عند استزراعها في وسائط مكيفة لكل سلالة لمدة 14 أو 21 يوما (الشكل 3). كشف تلطيخ فون كوسا عن عقيدات معدنية في المصفوفة خارج الخلية ، وهي سمة من سمات عملية تكوين العظم (الشكل 3). أظهر تلطيخ O باللون الأحمر الزيتي فجوات دهنية في سيتوبلازم ADSCs ، وأكد تلطيخ Alcian Blue وجود الجليكوزامينوجليكان في المصفوفة خارج الخلية (الشكل 3). معا ، أكدت الخصائص الظاهرية والوظيفية عدد الخلايا المستخرجة من الأنسجة الدهنية البربخية على أنها MSCs.

figure-results-2
الشكل 3: التوصيف الوظيفي للخلايا المشتقة من الأنسجة الدهنية. إمكانات متعددة السلالات العظمية والدهنية والغضروفية المنشأ ل ADSC بعد 14 و 21 يوما من الثقافة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (اللوحة العلوية) ، 100 ميكرومتر (الألواح الوسطى والسفلية). وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من ميراندا وآخرين.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخراج MSCs من أنسجة مختلفة. على الرغم من أن نخاع العظم يمثل مصدرا شائعا ل MSCs في كل من الفئران والبشر25,26 ، فقد اخترنا العمل مع الأنسجة الدهنية في هذه الدراسة بسبب ثرائها في MSCs ، وتوزيعها في الجسم ، وسهولة الوصول إليها. كبديل ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون لتوليد خلايا خلدة تشبهMSCs 27.

تستحق بعض نقاط الاستخراج اهتماما خاصا لنجاح البروتوكولات المشتركة هنا. أولا ، نسلط الضوء على الحرص على جمع الأنسجة التي يجب القيام بها في ظروف العقيم. لذا ، تأكد من تطهير الفئران بشكل صحيح بنسبة 70٪ كحول قبل بدء الجراحة. نقطة أخرى مهمة هي عدم استخدام نفس مجموعة الملقط والمقص لالتقاط الأنسجة الدهنية البربخية ، وبالتالي تجنب أي مصدر للتلوث.

الشاغل الثاني هو معالجة الأنسجة. يجب هز الشظايا الموجودة في الأنبوب المخروطي بشكل صحيح وقوي مع 10 دقائق من الحضانة عند 37 درجة مئوية. من المهم جدا تغيير الوسيط في اليوم التالي ثم كل 2-3 أيام. يوصى بمراقبة الثقافة يوميا ، والتحقق من اللون المتوسط وشكل الخلية وأي تدخل في بيئة الثقافة.

الشاغل الثالث يتعلق بأفضل وقت / مرور لتوصيف MSC. هنا ، نوصي بالقيام بذلك في الممر الثالث للخلايا ، لكن هذا ليس إلزاميا. ذلك يعتمد على الهدف من الدراسة. في المقطع الثالث ، لدينا حوالي 80٪ من الخلايا التي تتميز بأنها MSCs ، وهو ما يكفي لأهداف هذه الدراسة على سبيل المثال. يتم إجراء توصيف النمط الظاهري من خلال تحليل التعبير عن علامات المكونة للدم (CD34 و CD45 ، على سبيل المثال) وعلامات اللحمة المتوسطة (CD29 و CD73 و CD90 و CD105 ، على سبيل المثال). علاوة على ذلك، تسلط الجمعية الدولية للعلاج بالخلايا والجينات (ISCT)21 الضوء على أن ADSCs يجب أن يكون لها مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية وأن تلتزم بالبلاستيك الخاص بمنصة الاستزراع. يمكن ملاحظة التشكل تحت المجهر أثناء الثقافة المتنامية. يتم إجراء التوصيف الوظيفي من خلال تحليل إمكانات كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) إلى خلايا بانيات العظم، والخلايا الأرومية الشحمية، وخلايا الأرومة الغضروفية. في توصيف النمط الظاهري ، قد تختلف النسبة المئوية لعلامات اللحمة المتوسطة والمكونة للدم وفقا للأنواع الحيوانية ومصدر الخلية ، ولا تفي تماما بالأرقام الموصى بها من قبل ISCT. على سبيل المثال ، توصي ISCT ب MSCs البشرية ≥95٪ من CD105 و CD73 و CD90 و ≤2٪ من CD45 أو CD34 أو CD14 أو CD11b أو CD79a أو CD19 ، مستضد كريات الدم البيضاء البشرية - النمط المتماثل DR (HLA-DR) 21. علاوة على ذلك ، من المهم القيام بالتوصيف الوظيفي وتأكيد تعدد الخلايا التي تتمايز إلى بانيات العظم والخلايا الغضروفية وسلالات الخلايا الشحمية. يوصى باستخدام اثنين على الأقل من هذه السلالات لإثبات تعدد القدرات.

بالإضافة إلى هذه النقاط المميزة ، يمكن استبدال بعض المقايسات المقترحة هنا ، على سبيل المثال ، Alizarin Red S بدلا من تلطيخ Von Kossa ، و Periodic Acid Shiff بدلا من Alcian Blue ، وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بدلا من قياس التدفق الخلوي.

من بين الأنواع الثلاثة للأنسجة الدهنية الموصوفة في البشر (الأبيض والبني والبيج) ، تحتوي الأنسجة الدهنية البيضاء على أعلى مصدر ل MSCs28. يمكن الحصول على هذا النسيج من المناطق تحت الجلد والبطن والأربية ، مثل الدهون فوق البربخ المبلغ عنها هنا. إن التجزئة الفيزيائية والهضم الأنزيمي بواسطة الكولاجين المستخدم في البروتوكول المشترك هنا تستمد الجزء الوعائي اللحمي (SVF) المكون من العديد من أنواع الخلايا ، باستثناء الخلايا الشحمية ، التي يتم استنفادها أثناء المعالجة.

في الختام ، تشمل المزايا الرئيسية لاستخدام الأنسجة الدهنية كمصدر ل MSCs وفرتها وسهولة طرق عزل الخلايا ، المرتبطة بالإمكانات العلاجية ل MSCs كخصائص مضادة للالتهابات والتجدد.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بحث مدعوم بمنحة من المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجيا (480807/2011-6) ومؤسسة أمبارو في بيسكيسا دي ميناس جيرايس (APQ-01237-11). تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG و URS بفضل المنحة الدراسية التي تمنحها Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) ، و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ، على التوالي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
140 درجة ؛ C التعقيم عالي الحرارة CO2< / sub> حاضنةRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD ، الصينC180
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةI7018
حمض الخليك الجليديسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةA9186الكاشف الحيوي ، مناسب للكشف عن البروتينات السكرية. 1٪ في حمض الخليك ، درجة الحموضة 2.5
الكحول 70٪سيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية65350-M70٪ في الماء
الأمفوتريسين بسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةPHR1662
الأجسام المضادة للفأر المضادة CD29 FITC (استنساخ Ha2 / 5)BD Biosciences ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية555005الوظائف في الخلية: الالتصاق والتنشيط ، التطور الجنيني ، الكريات البيض ، التيار المستمر ، الصفائح الدموية ، الخلايا البدينة ، الخلايا الليفية والخلايا البطانية
الأجسام المضادة للفأر المضادة ل CD34 PE (استنساخ RAM34)BD Biosciences ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية551387وظائف في الخلية: عامل التصاق الخلية. الخلايا الجذعية المكونة للدم
الأجسام المضادة للفأر المضادة ل CD45 APC (استنساخ 30-F11)BD Biosciences ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية559864الوظائف في الخلية: يساعد في تنشيط الكريات
الأجسام المضادة للفأر المضادة للفأر المضادة ل CD71 FITC (استنساخ C2)BD Biosciences ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية553266الوظائف في الخلية: يتحكم في امتصاص الحديد أثناء تكاثر الخلايا. تكاثر الخلايا والخلايا الشبكية والسلائف
الأجسام المضادة للفأر المضادة ل CD90 PerCP (استنساخ OX-7)BD Biosciences ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية557266وظائف في الخلية: الإشارات والالتصاق. الخلايا الليمفاوية التائية ، NK ، أحادية الخلية ، HSC ، الخلايا العصبية ، الخلايا الليفية
حمض الأسكوربيكسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةPHR1008
الماصات الأوتوماتيكيةThermo Fisher Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية4700850NFinnpipette F1 مجموعات مختبر جيد السحب (GLP)
دورقغير قابل للتطبيق1 وحدة
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوريالولايات المتحدة الأمريكيةA7906
لوحات زراعة الخلايا (6 آبار)ميرك ، دارمشتات ، ألمانياZ70775907 وحدة معقمة. لوحات زراعة الأنسجة TPP
لوحات زراعة الخلايا (96 بئر. جولة أو V أسفل)ميرك ، دارمشتات ، ألمانياCLS35307701 وحدة معقمة. آبار ، 96 ، سطح معالج بثقافة الأنسجة (TC) ، آبار شفافة القاع المستديرة ،
غضروفيStem Pro Chondrogenesis Differentiation &ndash ؛ تقنيات الحياةA1007101TGF-& beta; 2 ، TGF- وبيتا ؛ 3 ، ديكساميثازون ، الأنسولين ، الترانسفيرين ، ITS ، الصوديوم - الأسكوربات ، بيروفات الصوديوم ، أسكوربات -2-فوسفات
كولاجيناز النوع الثانيلايف تكنولوجيز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية17101015
الفلين أو لوح الستايروفوم المغطى بالألمنيومغير قابل للتطبيق1 وحدة
قطنغير قابل للتطبيق50 جرام
ديكساميثازونسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةD4902
تشريح مقصغير قابل للتطبيق03 وحدات
معقمة DPX Mountant للأنسجةسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية6522
Dulbecco ' s النسر المعدل s medium (DMEM)Sigma-Aldrich ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةD5523مع 1000 مجم / لتر جلوكوز و L-جلوتامين ، بدون بيكربونات الصوديوم ، مسحوق ، مناسب لزراعة الخلايا
Eosin BSigma-Aldrich ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية861006
مصل الأبقار الجنيني (FBS)سيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةF4135
الفورمالديهايدسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية47608
الفورمالينسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةHT501128
جنتاميسينسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةG1397
هيماتوكسيلينسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةH3136
(0.3 مم × 13 مم)لا ينطبق5 وحدات
إندوميتاسينسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةI0200000
الأنسولينسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةI3536
IsopropanolSigma-Aldrich ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية56393570٪ في
محلول هيدروكلوريد H2O Ketamine-D4Sigma-Aldrich ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةK-0061.0 مجم / مل في الميثانول (كقاعدة مجانية) ، مادة مرجعية معتمدة ، Cerilliant & reg ؛
غرفة نيوباورسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةBR718620غرفة عد العلامات التجارية BLAUBRAND Neubauer. مع المشابك ،
أطراف ماصة Nichiryo مزدوجة الحكمة (0.1 – 10 و مو ؛ ل)ميرك ، دارمشتات ، ألمانياZ645540نطاق الحجم 0.1 & ndash ؛ 10 و مو ؛ L ، ممدود ، حزمة سائبة.
أطراف ماصة Nichiryo المعقمة (1 – 10 مل)ميرك ، دارمشتات ، ألمانياZ717401نطاق الحجم 1 & ndash ؛ 10 مل ، عالمي ، عبوة سائبة.
أطراف ماصة Nichiryo معقمة (200 مو ؛ ل)ميرك ، دارمشتات ، ألمانياZ645516الحد الأقصى للحجم 200 مو ؛ L ، تخرج ، ministack.
محلول O بالزيت الأحمرسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةO13910.5٪ في الأيزوبروبانول
البارافينسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية107.15146 & ndash ؛ 48 ، في شكل كتلة
البنسلين / الستربتومايسينسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةP4333، مع 10،000 وحدة بنسلين و 10 مجم من الستربتومايسين / مل ، 0.1 مو ؛ م مفلتر ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS).سيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةP3813، درجة الحموضة 7.4 ، لتحضير محاليل 1 لتر.
أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلين متوازنة ومعقمة (15 مل)فالكون ، فيشر سيانتيفيك14-959-53A
أنابيب مخروطية معقمة من مادة البولي بروبلين (50 مل)فالكون ، فيشر سينتيفك14-432-222 وحدة مشرط معقم
(اختياري)لا ينطبق1 وحدة
نترات الفضةسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية85228
ثيوسلفات الصوديومسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية72049
ملاقط جراحية (15 سم)غير قابل للتطبيق3 وحدات
فئران سويسرية معقمة (6 & ndash ؛ 8 أسابيع)Bioterium ، حقنة جامعة ولاية سانتا كروز021/22
(1 مل) غيرقابل للتطبيق1 وحدة
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةT81540.4٪ ، سائل ، مفلتر معقم ، مناسب لزراعة الخلايا
Trypsin / EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك)Sigma-Aldrich ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةT3924
زيلازينسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةPHR3263
بيتا ؛ هيدرات ملح ثنائي الصوديوم جليسيروفوسفاتسيجما ألدريتش ، سان لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةG9422BioUltra ، مناسب لزراعة الخلايا النباتية ، & ge ؛ 99٪ (معايرة بالتحليل الحجمي)
البيض متوسط معقم إبرة تحت الجلد المعقم استقر الحل مسحوق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Stem Cell IsolationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationAdipogenic DifferentiationChondrogenic DifferentiationCollagenase DigestionMouse Epididymal Tissue

مقالات ذات صلة