يصف هذا البروتوكول استخدام فرز الخلايا المنشطة بالتألق للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية باستخدام طريقة فرز الخلية الواحدة. على وجه التحديد ، يمكن أن يحقق استخدام الفرز أحادي الخلية نقاء 99٪ من الخلايا المناعية من مجموعة غير متجانسة عند دمجها مع نهج قائم على قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فرز الخلية الواحدة للخلايا الجذعية الوسيطة المناعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمتلك الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) للكائن الحي قدرة غير عادية على التمايز إلى سلالات متعددة من الخلايا البالغة في الجسم وهي معروفة بخصائصها المناعية والمضادة للالتهابات. يعد استخدام هذه الخلايا الجذعية نعمة لمجال البيولوجيا التجديدية ، ولكنه في الوقت نفسه لعنة على الطب التجديدي والعلاجات بسبب الغموض الخلوي المتعدد المرتبط بها. قد ينشأ هذا الغموض من التنوع في مصدر هذه الخلايا الجذعية ومن ظروف نموها في المختبر ، وكلاهما ينعكس على عدم تجانسها الوظيفي.
وهذا يستدعي منهجيات لتوفير مجموعات نقية ومتجانسة من MSCs للتطبيقات العلاجية. مكن التقدم في مجال قياس التدفق الخلوي من اكتشاف مجموعات الخلية المفردة باستخدام نهج متعدد المعلمات. يحدد هذا البروتوكول طريقة لتحديد وتنقية الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية (SHEDs) من خلال فرز الخلية المفردة بمساعدة الفلورة. حدد التعبير المتزامن للعلامات السطحية ، وهي CD90-fluorescein isothiocyanate (FITC) ، CD73-peridinin-chlorophyll-protein (PerCP-Cy5.5) ، CD105-allophycocyanin (APC) ، و CD44-V450 ، التعبيرات الإيجابية "الساطعة" ل MSCs باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات. ومع ذلك ، لوحظ انخفاض كبير في النسب المئوية للتعبيرات الرباعية لهذه العلامات الموجبة من المقطع 7 فصاعدا إلى المقاطع اللاحقة.
تم فرز المجموعات السكانية الفرعية ذات النمط المناعي باستخدام وضع الفرز أحادي الخلية حيث شكلت علامتان موجبتان وعلامة سلبية واحدة فقط معايير التضمين. ضمنت هذه المنهجية صلاحية الخلية للسكان الذين تم فرزهم وحافظت على تكاثر الخلايا بعد الفرز. يمكن استخدام تطبيق المصب لمثل هذا الفرز لتقييم التمايز الخاص بالنسب للمجموعات السكانية الفرعية المسورة. يمكن تطبيق هذا النهج على أنظمة الخلية المفردة الأخرى لتحسين ظروف العزل والحصول على معلومات علامات سطح الخلية المتعددة.
المقدمة
يمكن اعتبار الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا المناسبة للعلاجات القائمة على الخلايا ويمكن اعتبارها نظاما قياسيا ذهبيا في الطب التجديدي. يمكن عزل هذه الخلايا من مجموعة متنوعة من المصادر في الجسم بأصول أنسجة مختلفة1. اعتمادا على أنسجة المصدر ، يعرض كل نوع من أنواع MSC سلوكا غامضا في المختبر 2. ويلاحظ هذا بشكل جيد في خصائصها المورفولوجية والوظيفية3. أظهرت دراسات متعددة تباينا داخل النسيل في الأبعاد ، بما في ذلك تمايز الأنسجة البالغة ، والحالة الجينومية ، والبنية الأيضية والخلوية ل MSCs 2,4.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الموافقة الأخلاقية والموافقة على المشاركة: تم استلام عينات لب الأسنان المتساقطة المقشرة البشرية بعد الحصول على الموافقة المستنيرة والموافقة الأخلاقية الكاملة من قبل كلية ومستشفى سري راجيف غاندي لطب الأسنان (SRGCDS) قسم الفم والوجه والفكين ، بنغالورو ، وفقا للمعايير التي وضعتها لجنة التخليص الأخلاقي بالمستشفى ، SRGCDS. بعد ذلك تمت الموافقة على عزل وثقافة وصيانة وتطبيق SHEDs من قبل وامتثالا للإرشادات التي أوصت بها اللجنة المؤسسية لأبحاث الخلايا الجذعية (IC-SCR) في معهد مانيبال للطب التجديدي ، MAHE - بنغالورو. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إعداد الكواشف والمخا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تميزت SHEDs بمقايسات التألق المناعي القياسية التي تظهر التعبير عن vimentin (خيوط وسيطة من النوع الثالث) ، وخيوط الأكتين (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) ، والنوى الملطخة ب DAPI (الشكل 1 أ). لتقدير قدراتها التكاثرية وتشكيل المستعمرات ، تم إجراء فحوصات نمو الخلايا القياسية على المدى القصير. وقد تبين زيادة قدرها 14.3 ضعفا في معدل الانتشار من اليوم 2 إلى اليوم 8 في الشكل 1 باء. تم تحديد الخصائص المستنسخة ل SHEDs من فحوصات CFU-F الموضحة في الش.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، من بين مصادر ما بعد الولادة ، جذبت MSCs المشتقة من الأنسجة الفموية اهتماما عميقا بسبب الحد الأدنى من التزاماتها الأخلاقية وإمكانية التمايز الملحوظة متعددة السلالات21. حازت الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من الضرس الثالث المتأثر و SHEDs على أكبر قدر من الاهتمام بين MSCs للأسنان لإمكاناتها العلاجية في الأمراض التنكسية العصبية والصدمة22. يساعد البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة في توصيف SHEDs باستخدام نهج متعدد المعلمات وفرز المجموعات .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.
شكر وتقدير
نشكر مرفق خلايا التدفق في مركز جواهر لال نهرو للبحوث العلمية المتقدمة ، بنغالورو ، الهند ، على استخدام المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي. تم إجراء التقسيم بالتبريد لثقافة الحبيبات للخلايا المتمايزة في مختبر نيوبيرج أناند المرجعي ، بنغالورو ، الهند. تم دعم هذا العمل من خلال التمويل الداخلي لجامعة كاليفورنيا من أكاديمية مانيبال للتعليم العالي (MAHE) ، الهند. AG ممتنة لدعم منحة الدكتور T. M. A. PAI من MAHE.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus المضادة للماوس Ig ، & kappa ؛ / التحكم السلبي (BSA) تعويض Plus (7.5 & micro; م) مجموعة الجسيمات | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads ؛ | BD Biosciences | 345249 | لإعداد تأخير الليزر عند فتح وحدة الفرز. |
| BD FACS Aria Fusion Flow Cellular | Cellular BD Biosciences--- | ||
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS غمد السائل | BD Biosciences | 342003 | يستخدم كسائل غمد لكل من تجارب التحليل والفرز في BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS & حبات البحث T | BD Biosciences | 655050 | تستخدم لتكوين الأداة اعتمادا على حجم الفوهة. |
| BD Horizon V450 ماوس مضاد للإنسان CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 النمط المتماثل |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابه | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC النمط المتماثل |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI محلول مخزون من 1 مجم / مل |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC النمط المتماثل |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابه | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE النمط المتماثل |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 ماوس مضاد للإنسان CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابه | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 النمط المتماثل |
| BD Pharmingen منقى الفأر المضاد للفيمنتين | BD Biosciences | 550513 | |
| ألبومين مصل الأبقار | Hi-Media ؛ | TC548-5G | |
| كريستال البنفسجي | لطيف الكيميائية المحدودة ؛ | C33809 | |
| فوسفات Dulbecco مخزن محلول ملحي | Sigma-aldrich ؛ | D5652-50L | dPBS المستخدمة في أعمال الثقافة والصيانة. |
| الإيثانول | --- | --- | تستخدم للتعقيم العام. |
| مصل الأبقار الجنينية | Gibco من ThermoFisher | 10270-106 | |
| الماعز المضاد للفأر IgG (H+L) الجسم المضاد الثانوي المتصاص ، Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco بواسطة ThermoFisher | 10829018 | الوسط القاعدي ل hESCs غير المتمايزة ، يستخدم في تحضير وسائط الاستزراع |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco بواسطة ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol ، للبيولوجيا الجزيئية ؛ | مرحبا وسائل الإعلام | MB113 | |
| زيت أحمر O | هاي ميديا | CCK013-1KT | |
| بارافورمالدهايد | loba chemie | 30525-89-4 | |
| بنسلين ستربتومايسين (100x) | Gibco بواسطة ThermoFisher | 15140- 122 | |
| فالودين (كاشف ActinGreen 488 ReadyProbes) | Invitrogen ؛ | R37110 | |
| نترات الفضة | HiMedia | MB156-25G | |
| ثيوسلفات الصوديوم خماسي هيدرات | Chemport | 10102-17-7 | |
| جزيئات الفلورسنت Sphero Rainbow ، 3.0 - 3.4 & micro ؛ م | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | أعدت في MIRM | ---- | تم إعداده باستخدام 2٪ FBS في PBS & nbsp ؛ |
| StemPro Adipogenesis التمايز الوسائط القاعدية | Gibco من ThermoFisher | A10410-01 | الوسائط القاعدية للوسائط الشحمية |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco بواسطة ThermoFisher ؛ | A10065-01 | وسائط الحث للوسائط الشحمية |
| StemPro التكميلي الغضروفي | Gibco بواسطة ThermoFisher ؛ | A10064-01 | وسائط الحث للوسائط الغضروفية |
| StemPro ملحق تكوين العظم | Gibco بواسطة ThermoFisher ؛ | A10066-01 | وسائط الحث للوسائط العظمية |
| StemPro تكوين العظم / تمايز الغضروف الوسائط القاعدية ؛ | Gibco من ThermoFisher | A10069-01 | الوسائط القاعدية لكل من الوسائط العظمية والغضروفية |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | جيبكو من لايف تكنولوجيز | 15250-061 | |
| Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
المراجع
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
