يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة

4.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65774

⸱

أكتوبر 20, 2023

 ,  ,  ,  , 
1National & Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, School of life science, Hubei University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. إلى جانب الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.

الملخص

شبكة الأنابيب الدقيقة هي عنصر أساسي في الجهاز العصبي. ترتبط الطفرات في العديد من البروتينات التنظيمية للأنابيب الدقيقة باضطرابات النمو العصبي والأمراض العصبية ، مثل بروتين تاو المرتبط بالأنابيب الدقيقة للأمراض التنكسية العصبية ، وبروتين قطع الأنابيب الدقيقة Spastin و Katanin 60 يسبب الشلل النصفي التشنجي الوراثي وتشوهات النمو العصبي ، على التوالي. يعد الكشف عن شبكات الأنابيب الدقيقة في الخلايا العصبية مفيدا لتوضيح التسبب في الاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فإن صغر حجم الخلايا العصبية والترتيب الكثيف لحزم الأنابيب الدقيقة المحورية يجعل تصور شبكات الأنابيب الدقيقة أمرا صعبا. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتشريح الوصلة العصبية العضلية اليرقية وخلايا العضلات ، وكذلك التلوين المناعي لبروتين α-tubulin والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة Futsch لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في ذبابة الفاكهة الميلانية. يسمح لنا التقاطع العصبي العضلي بمراقبة كل من الأنابيب الدقيقة قبل وبعد المشبكي ، ويسمح الحجم الكبير لخلايا العضلات في يرقة ذبابة الفاكهة بتصور واضح لشبكة الأنابيب الدقيقة. هنا ، من خلال تحور والإفراط في التعبير عن Katanin 60 في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، ثم فحص شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلة العصبية العضلية وخلايا العضلات ، نكشف بدقة عن الدور التنظيمي ل Katanin 60 في النمو العصبي. لذلك ، جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.

المقدمة

تلعب الأنابيب الدقيقة (MTs) ، باعتبارها أحد المكونات الهيكلية للهيكل الخلوي ، دورا مهما في العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك انقسام الخلايا ، ونمو الخلايا وحركتها ، والنقل داخل الخلايا ، والحفاظ على شكل الخلية. يتم تعديل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة ووظيفتها من خلال التفاعلات مع البروتينات الأخرى ، مثل MAP1 و MAP2 و Tau و Katanin و Kinesin1،2،3،4،5.

في الخلايا العصبية ، الأنابيب الدقيقة ضرورية لتطوير وصيانة المحاور العصبية والتغصنات. تشوهات في الأنابيب الدقيقة تؤدي إلى خلل وظيفي وحتى موت الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، في دماغ مرضى الزهايمر ، يقلل فرط فسفرة بروتين تاو من استقرار شبكة الأنابيب الدقيقة ، مما يسبب مخالفات عصبية6. وبالتالي ، فإن فحص شبكات الأنابيب الدقيقة سيساهم في فهم النمو العصبي والتسبب في الأمراض العصبية.

الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي المشبك المحيطي المتشكل بين طرف محور عصبي للخلايا العصبية الحركية والألياف العضلية ، وهو نظام نموذجي ممتاز وقوي لدراسة البنية والوظائف المشبكية7. Futsch هو بروتين في ذبابة الفاكهة متماثل مع البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة MAP1B الموجود في الثدييات8. يتم التعبير عنه فقط في الخلايا العصبية ويلعب دورا في تطوير الأزرار المشبكية ل NMJ 8,9. في النوع البري ، يتم تصور الحزم الخيطية التي تعمل على طول مركز عمليات NMJ عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام مضاد Futsch. عند الوصول إلى نهاية NMJ ، تتمتع هذه الحزمة إما بالقدرة على تكوين حلقة تتكون من الأنابيب الدقيقة أو فقدان هيكلها الخيطي ، مما يؤدي إلى ظهور منتشر ومنقط10. ترتبط حلقات الأنابيب الدقيقة بمخاريط النمو المتوقفة مؤقتا ، مما يشير إلى أن مجموعة الأنابيب الدقيقة مستقرة11. لذلك ، يمكننا بشكل غير مباشر تحديد تطور الأنابيب الدقيقة المستقرة في NMJ عن طريق تلطيخ Futsch. يسمح الحجم الكبير لخلايا العضلات في يرقة ذبابة الفاكهة بتصور واضح لشبكة الأنابيب الدقيقة. يمكن العثور على العوامل التي تؤثر على استقرار شبكة الأنابيب الدقيقة من خلال تحليل كثافة وشكل الأنابيب الدقيقة. في الوقت نفسه ، يمكن التحقق من حالة شبكة الأنابيب الدقيقة لخلايا العضلات بنتيجة NMJ للحصول على استنتاجات أكثر شمولا.

تم استخدام العديد من البروتوكولات للتحقيق في شبكة وديناميكيات الأنابيب الدقيقة. ومع ذلك ، فقد ركزت هذه الأبحاث في كثير من الأحيان على الدراسات في المختبر 12،13،14،15،16. بدلا من ذلك ، استخدمت بعض التجارب في الجسم الحي المجهر الإلكتروني للكشف عن الهيكل الخلوي17. وفقا للارتباط المحدد للأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية أو الأصباغ الكيميائية بالبروتينات أو الحمض النووي ، تسمح الطرق المعروضة هنا باكتشاف شبكات الأنابيب الدقيقة في NMJ على مستوى الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي ، مع النتائج التي تؤكدها الملاحظات في خلايا العضلات. هذا البروتوكول بسيط ومستقر وقابل للتكرار عند دمجه مع الأدوات الجينية القوية المتوفرة في ذبابة الفاكهة الميلانية ، مما يتيح مجموعة متنوعة من فحوصات النمط الظاهري والفحوصات الجينية لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تشريح اليرقات

ملاحظة: يتم استخدام محلول تشريح محلول ملحي يشبه الدملمف (HL3.1) 18 ومحلول التثبيت 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) 19،20في درجة حرارة الغرفة لأن الأنابيب الدقيقة تتبلمر عندما تكون درجة الحرارة منخفضة جدا.

  1. اختر يرقة 3 متجولة مع ملقط طويل حاد. اغسله باستخدام HL3.1 وضعه على طبق التشريح تحت المجهر المجسم.
    ملاحظة: يتم التعرف على اليرقة المتجولة 3الثالثة من خلال spiracle الأمامي المتفرع وتزحف حول الأنبوب عند حوالي 96 ساعة (25 درجة مئوية) 21.
  2. ضع اليرقة مع الجانب الظهري أو البطني لأعلى. حدد الجانب الظهري من القصبة الهوائية الطويلة والبطني بواسطة أحزمة الأسنان البطنية.
    1. اعتمادا على الأنسجة التي يجب مراقبتها ، اختر التشريح الظهري أو البطني. سيسمح ذلك بعرض أكثر دقة وتفصيلا لمجال الاهتمام المحدد. لمراقبة NMJ والخلايا العضلية ، قم بقطع المناطق الظهرية والبطنية اليرقية ، على التوالي.
  3. دبوس السنانير الفم والذيل. اضبط المسامير للحفاظ على اليرقة في حالة ممتدة. أضف قطرة من HL3.1 إلى اليرقة لمنعها من الجفاف.
    ملاحظة: يمكن استخدام HL 3.1 الخالي من الكالسيوم2+ لتقليل تقلص العضلات أثناء التشريح.
  4. استخدم مقص التشريح لعمل قطع عرضي صغير بالقرب من الطرف الخلفي ، لكن لا تقطع الطرف الخلفي. ثم قطع على طول خط الوسط البطني نحو الطرف الأمامي.
  5. أدخل أربعة دبابيس حشرة على الزوايا الأربع لليرقة. إعادة ضبط دبابيس الحشرات بحيث يتم تمديد اليرقة إلى أقصى حد في جميع الاتجاهات.
  6. استخدم الملقط لإزالة الأعضاء الداخلية مع عدم إتلاف العضلات.

2. التثبيت

  1. أضف 100 ميكرولتر من PFA (4٪) لغمر الذبائح لمدة 40 دقيقة بينما لا تزال الذبائح مثبتة على طبق التشريح.
    تنبيه: يتم اتخاذ تدابير حماية فعالة لتجنب الاتصال المباشر بالجلد أو الاستنشاق ، لأن PFA يشكل خطرا.
  2. قم بفك المسامير ونقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 مل. اشطف PFA بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x يحتوي على 0.2٪ Triton X-100 (0.2٪ PBST) لملء أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل لمدة 10 دقائق على شاكر إزالة اللون عند 15 دورة في الدقيقة. كرر عملية الغسيل 5x.

3. الكيمياء المناعية

  1. اغمر الذبائح في عامل مانع (5٪ مصل الماعز في 0.2٪ PBST) ومنعها لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بإزالة عامل الحجب واستبدله ب 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي (على سبيل المثال ، مضاد α توبولين ، 1: 1000 ؛ مضاد فويتش ، 1:50) مخفف ب 0.2٪ PBST عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تصور الأنابيب الدقيقة العضلية عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام مضاد α توبولين أحادي النسيلة. يمكن أن يعكس Anti-Futsch بشكل غير مباشر مورفولوجيا الأنابيب الدقيقة في NMJ.
  3. بعد حضانة الجسم المضاد الأساسي ، اغسل اليرقات بنسبة 0.2٪ PBST لمدة 10 دقائق. كرر 5x.
  4. احتضان اليرقات ب 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال ، الماعز المضاد للفأر 488 ، 1: 1000) المخفف بنسبة 0.2٪ PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة في الظلام.
  5. بعد ذلك ، أضف صبغة نووية مثل TO-PRO (R) 3 يوديد (T3605) بتركيز 1: 1000 في أنبوب الحضانة لمدة 30 دقيقة عند تلطيخ الأنابيب الدقيقة في الظلام20,22.
  6. اشطف الجسم المضاد الثانوي والصبغة النووية بنسبة 0.2٪ PBST لمدة 10 دقائق. كرر 5x في الظلام.

4. تصاعد

  1. ضع جثة اليرقات في 0.2٪ PBST على شريحة زجاجية واضبطها تحت المجهر المجسم. تأكد من أن السطح الداخلي لجثة اليرقات متجها لأعلى وأن جميع جثث اليرقات مرتبة حسب الرغبة.
  2. قم بامتصاص محلول PBST الزائد بمنديل وأضف برفق قطرة من وسيط التثبيت المضاد للتلاشي.
  3. ضع غطاء على الشريحة لتغطية اليرقات المشرحة ببطء ورفق لتجنب الفقاعات.
  4. ضعي طلاء الأظافر حول غطاء الغطاء. ضع الشريحة في المساحة المظلمة لتقليل التوهين الفلوري.

5. الحصول على الصور

  1. للحصول على الصور ، استخدم مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ، وحدد هدف غمر الزيت 60x (الفتحة العددية 1.42) أو ما شابه ذلك ، واضبط طاقة الليزر والطول الموجي بناء على التجربة.
  2. لتحديد NMJ ، التقط صورا في العضلات 4 في الجزء A3 (كما هو موضح في الموقع في الشكل 1F). حدد ليزر 488 نانومتر لتنشيط α-tubulin أو Futsch و 543 نانومتر لتنشيط مسار التصوير HRP. اضبط المعلمات على حجم إطار 800 بكسل × 800 بكسل ، وتكبير رقمي 2.0 ، وفاصل تصوير يبلغ 0.8 ميكرومتر في NMJs (الشكل 2).
  3. لتحديد الأنابيب الدقيقة في العضلات ، التقط صورا للعضلة 2 في الجزء A3-A5 (كما هو موضح في الموقع في الشكل 1G) لأنها تحتوي على عدد أقل من فروع القصبة الهوائية. اختر ليزر 488 نانومتر لتنشيط α توبولين وليزر 635 نانومتر لتنشيط مسار التصوير T3605. اضبط المعلمات على حجم إطار يبلغ 1024 بكسل × 1024 بكسل ، وتكبير رقمي 3.0 ، وفاصل تصوير يبلغ 0.4 ميكرومتر في خلايا العضلات (الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لقد أظهرنا إجراء خطوة بخطوة لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة في كل من الوصلات العصبية العضلية (NMJs) وخلايا العضلات. بعد التشريح وفقا للرسم التخطيطي (الشكل 1A-E) ، يتم إجراء تلطيخ مناعي ، ويتم بعد ذلك ملاحظة الصور وتجميعها تحت مجهر ليزر متحد البؤر أو مجهر مضان مجسم (الشكل 1F ، G).

يمكن تمييز كل من تنظيم الأنابيب الدقيقة قبل وبعد المشبكي ل NMJ بمضاد α توبولين ، ومن خلال اختيار سمك طبقة المجهر متحد البؤر للم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا يتم وصف بروتوكول للتشريح والمناعة من ذبابة الفاكهة اليرقات الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. هناك العديد من النقاط الأساسية التي يجب مراعاتها. أولا ، يعد تجنب إصابة العضلات المرصودة أمرا بالغ الأهمية أثناء عملية التشريح. قد يكون من المفيد إصلاح شرائح اللحم قبل إزالة الأعضاء الداخلية لمنع الاتصال المباشر بين الملقط والعضلات. لتجنب تلف العضلات أو الانفصال عن بشرة اليرقات ، من المهم التأكد من أن سرعة شاكر لا تتجاوز 15 دورة في الدقيقة أثناء الغسيل والحضانة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التحكم الدقيق في تمديد الج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور يينغ شيونغ على المناقشات والتعليقات على المخطوطة. يتم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (NSFC) إلى C. M. (31500839).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor Plus 405 phalloidininvitrogenA30104مخفف 1: 200
تصاعد محسن مضاد للتلاشي متوسطBeyotimeP0128M
FV10-ASW مجهر متحد البؤرأوليمبوس
الماعز الجسم المضاد للفأر ، Alexa Fluor 488 المترافقThermo FisherA-11001مخفف 1: 1،000
مجهر ليزر متحد البؤر LSM 710Zeiss
Micro Scissors66vision54138B
ماوس مضاد للأجسام المضادة للفوتشدراسات تنموية Hybridoma Bank   22C10تمييع 1:50
الفأر المضاد للجسم المضاد لألفا توبولينSigmaT5168تمييع 1: 1،000
بارافورمالدهيدواكو168-20955التركيز النهائي: 4٪ في PB عازلة
الفولاذ المقاوم للصدأ Minutien دبابيسEntomoravia0.1mm Diam
مجهر مجسم SMZ161مجسم
المجهر BX41أوليمبوس
تكساس الماعز الأحمر المترافق المضاد ل HRPجاكسون ImmunoResearchمخفف 1:100
TO-PRO (R) 3 يوديدInvitrogenT3605مخفف 1: 1,000
نقل شاكر إزالة اللون TS-8أدوات مختبر Kylin-BellE0018
TritonX-100BioFroxx1139
ملاقط  ؛دومون500342
مضان مجسم

المراجع

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224(2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
  3. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204(2005).
  4. Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
  5. Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
  6. Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
  7. Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
  8. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  9. Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
  10. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
  12. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  13. Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
  14. Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
  15. Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).
  16. Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488(2023).
  17. Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
  18. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  19. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
  20. Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
  21. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  22. Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
  23. Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
  24. Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202(2011).
  25. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  26. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  27. Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الوصلة العضلية العصبية في ذبابة الفاكهة (Drosophila)ديناميكيات الأنابيب الدقيقةكاتانين 60صبغ ألفا توبولينالمجهر البؤريالفرز الجينيبروتوكول الصبغ المناعياضطرابات النمو العصبي
استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.