نصف هنا بروتوكول هضم الخلايا المكون من خطوتين لإعداد تعليق أحادي الخلية للشرايين السباتية للفأر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحضير معلق أحادي الخلية من الشرايين السباتية للفأر لتسلسل الخلية الواحدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الشرايين السباتية هي أوعية دموية رئيسية في الرقبة تمد الدماغ بالدم والأكسجين، ولكن يحدث تضيق الشريان السباتي عندما تكون الشرايين السباتية مسدودة باللويحات. يعد الكشف عن التركيب الخلوي للشريان السباتي على مستوى الخلية الواحدة أمرا ضروريا لعلاج تصلب الشرايين السباتي. ومع ذلك ، لا يوجد بروتوكول جاهز للاستخدام لإعداد معلقات أحادية الخلية من الشرايين السباتية. للحصول على بروتوكول مناسب لتفكك الشرايين السباتية الطبيعية على مستوى الخلية الواحدة مع ضرر أقل للخلايا ، قمنا بتصميم طريقة هضم من خطوتين من خلال دمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتريبسين. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم الكشف عن متوسط ~ 2500 نسخة لكل خلية في كل خلية شريان سباتي. والجدير بالذكر أن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في الشريان السباتي الطبيعي ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، كانت قابلة للاكتشاف في وقت واحد. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإعداد تعليق خلية واحدة للأوعية الدموية من الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة.
المقدمة
تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن يرتبط بعوامل الخطر مثل ارتفاع ضغط الدم وفرط شحميات الدم وديناميكا الدم1. تشعبات الشريان السباتي عرضة للتغيرات الديناميكية الدموية وتؤدي إلى تكوين اللويحات السباتية. يمكن أن يكون العرض السريري لتصلب الشرايين السباتي حادا مثل السكتة الدماغية ونقص التروية الدماغية العابرة ، أو مزمنا مثل نقص التروية الدماغية العابر المتكرر والخرف الوعائي2. ميكانيكيا ، اللويحة السباتية هي نتيجة التفاعل بين خلايا جدار الأوعية الدموية المختلفة وخلايا الدم المختلفة في ظل الظروف المرضية. لذلك ، فإن الكشف عن أطلس الخلية الواحدة للأوعية السباتية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية مهم بشكل خاص لمنع وعلاج تطور البلاك السباتي.
يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أحد أقوى تقنيات البحث البيولوجي بسبب دقته الفائقة والكشف عن عدم تجانس الخلية من نفس نوع الخلية من الكائنات الحية 3,4. استخدم الباحثون تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لإجراء البحوث في العديد من المجالات ، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية5 والسرطان6. ومع ذلك ، لا يزال فصل الأنسجة بسرعة ودقة إلى خلايا مفردة أحد التحديات الرئيسية. التفكك الأنزيمي هو طريقة شائعة الاستخدام تشمل في الغالب كولاجيناز ، غراء ، تربسين ، DNase ، وهيالورونيداز. على وجه التحديد ، الكولاجين هي أنواع الإنزيمات الرئيسية لعملية الهضم أحادية الخلية ، وخاصة مكونات الكولاجين المائية في الأنسجة الضامة. أنواع مختلفة من الكولاجين قابلة للتطبيق لتفكك الأنسجة المختلفة ، مثل الغدة الثديية7 ، الكبيبة8 ، زاوية القزحيةالقرنية 9 ، مفصل الركبة 10 ، الشريان الأورطي11 ، والرئة12. نظرا للخصائص الفسيولوجية الفريدة للأنسجة المختلفة ، قد يسبب التفكك باستخدام نفس الطريقة العديد من المشاكل في الحصول على خلايا مفردة ، مثل انخفاض صلاحية الخلية ، وانخفاض عدد الخلايا ، وحطام الخلايا الكبيرة. لذلك ، فإن اختراع طرق الهضم للأنسجة المختلفة أمر ضروري لإعداد معلقات أحادية الخلية عالية الجودة.
يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة هضم خلوية من خطوتين لإعداد معلق أحادي الخلية للشريان السباتي للفئران البرية. وفقا لخصائص الشريان السباتي ، قمنا بدمج كولاجيناز / إنزيم مع التربسين للحصول على معلق أحادي الخلية عالي الجودة للشريان السباتي للفأر لأن كولاجيناز يمكن أن يتحلل الكولاجين في الأنسجة السباتية ، والذي تم هضمه بواسطة التربسين في معلق أحادي الخلية. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم تحديد أربعة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، في الشرايين السباتية الطبيعية للفأر بعد الهضم. مزايا هذا البروتوكول هي: 1) يمكن تحديد أنواع متعددة من الخلايا في الشريان السباتي ، 2) يتم الحفاظ على صلاحية الخلية بشكل جيد ، و 3) يمكن تكرارها بسهولة بدون معدات خاصة. هذا البروتوكول مناسب للباحثين المهتمين بدراسة تعدد الخلايا أحادية الخلية للشرايين السباتية للفأر. قد يكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا في تفكك الأوعية الدموية الأخرى مع التعديلات المناسبة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة سوشو.
1. الكواشف وإعداد المواد
- استخدم 1x PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم و 2.5 وحدة / مل من ملح الصوديوم الهيبارين لتحضير محلول التروية. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويبرد مسبقا على الثلج عند استخدامه.
- تحضير كاشف التفكك A الذي يحتوي على 125 CDU / mL كولاجيناز II و 60 U / mL DNase I عن طريق تخفيف 1250 CDU / mL كولاجيناز II و 3000 U / mL DNase I مع HBSS. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تحضير كاشف التفكك B الذي يحتوي على تركيز نهائي قدره 0.12٪ تربسين عن طريق تخفيف 1 مل من التربسين الخالي من EDTA بنسبة 0.25٪ (بدون الفينول الأحمر) إلى 1 مل من 1x PBS. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تحضير 10 مل من 1.5٪ FBS و 10 مل من 5٪ FBS في 1x PBS. استخدم 1.5٪ FBS لتجميع الشرايين السباتية والاحتفاظ بها على الثلج قبل الاستخدام. استخدم 5٪ FBS لتحييد الهضم وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).
- احصل على المواد التجريبية ، بما في ذلك محاقن 1 مل ، ومحاقن 20 مل مع إبر 26-G ، وألواح زراعة الخلايا الستة ، وأنابيب الطرد المركزي 1.5 مل ، ومصافي الخلايا المعقمة 40 ميكرومتر ، وحاويات الثلج.
2. إعداد المعدات
- تعقيم جميع المعدات الجراحية ، بما في ذلك المجهر المجسم ، ومقص التشريح ، ومقص التشريح الدقيق ، والملقط ذي الأطراف الدقيقة.
- قم بتشغيل عداد الخلايا الآلي واحتفظ به في RT.
- قم بتشغيل الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية مقدما.
- قم بتبريد جهاز الطرد المركزي الدقيق إلى 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
3. عزل الشريان السباتي الفأر
- تخدير الفأر باستخدام 1.25٪ ثلاثي برومو إيثانول عن طريق الحقن داخل الصفاق (0.24 مل لكل 10 جم من وزن الجسم) واقلب الماوس للتحقق مما إذا كان هناك رد فعل تصحيح بعد 3 دقائق. ثم ، القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم ووضعه على ظهره. رش جلد الفأر بنسبة 75٪ كحول.
- استخدم مقص تشريح معقم لفتح الجلد وكشف تجويف الصدر. قطع فتح الحجاب الحاجز.
- استمر في القطع لأعلى إلى الفك السفلي وقم بإزالة الأنسجة الضامة الزائدة والدهون بعناية ، مما يعرض الشريان السباتي.
- قطع الوريد الأجوف السفلي للفأر لجعل الدم يتدفق من الدورة الدموية المغلقة.
- حقن 20 مل من محلول التروية المبرد مسبقا في البطين الأيسر باستخدام حقنة ببطء وبشكل مستمر.
ملاحظة: إذا نجح التروية ، فإن الأعضاء الغنية بالدم مثل الكبد والطحال والكلى ستتحول إلى اللون الرمادي والأبيض. - انزع جميع الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة حول الشريان السباتي بمقص تشريح دقيق تحت مجهر مجسم.
ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة ببطء وحذر لمنع تلف الشريان السباتي. - اعزل الشريان السباتي عن الفأر ، واغسله باستخدام 1x PBS لطرد الدم مرة أخرى ، وانقله إلى ستة ألواح تحتوي على 1.5٪ FBS على الجليد.
4. هضم الشريان السباتي في تعليق خلية واحدة
- استخدم مقص التشريح الدقيق لتشريح الشريان السباتي طوليا ووضعه بشكل مسطح في لوحة أخرى لزراعة الخلايا مكونة من 6 آبار تحتوي على 1 مل من 1.5٪ FBS على الجليد.
- اغسل البطانة بعناية باستخدام 1.5٪ FBS لإزالة الدم المتبقي.
ملاحظة: يجب أن يكون التنظيف لطيفا وبطيئا لتجنب إصابة الخلايا البطانية. - قطع كل الشريان السباتي إلى ما يقرب من 2 مم2 قطعة الأنسجة باستخدام مقص التشريح المجهري في 1.5٪ FBS.
- انقل قطع الأنسجة هذه إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل مع أطراف تجويف عريضة سعة 1 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإغراق الأنسجة في القاع.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الأنسجة في 500 ميكرولتر من كاشف التفكك A.
- ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ماصة بلطف مع ماصة 1 مل كل 10 دقائق.
- أضف 500 ميكرولتر من 5٪ FBS في الأنبوب واخلطه جيدا مع ماصة 1 مل.
- قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية معقمة 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من كاشف التفكك B.
- ضعيها في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية واخلطيها لمدة 5 دقائق إضافية. ماصة بلطف كل 2 دقيقة أثناء الهضم لتنفصل تماما إلى تعليق خلية واحدة.
- استخدم 200 ميكرولتر من 5٪ FBS لإنهاء تفاعل الهضم ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1x PBS على الجليد.
5. فحص تعليق الخلية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية
- أضف 10 ميكرولتر من محلول AO / PI إلى 10 ميكرولتر من التعليق أحادي الخلية واخلطه برفق باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.
- ماصة 20 ميكرولتر من الخليط في شريحة الغرفة وانتظر لمدة 1 دقيقة.
- قم بتحميل الشريحة في أداة عداد الخلايا الآلية.
- حدد مقايسة جدوى AO / PI ، ثم انتظر تقرير الجودة.
- استخدم مجموعة كاشف أحادية الخلية 3 بوصة لتوليد حبات هلام أحادية الخلية في المستحلب على وحدة تحكم أحادية الخلية وتضخيم cDNA المشفر في دورة حرارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: هنا ، تم استخدام مجموعات كاشف الكروم أحادي الخلية 3ʹ v3. - قم بإجراء التسلسل على جهاز التسلسل باستخدام إستراتيجية قراءة مزدوجة النهاية 150 bp (PE150). استخدم تطبيقا برمجيا (Cell Ranger) لتحويل ملفات المكالمات الأساسية الأولية إلى ملفات fastq باستخدام خط أنابيب mkfastq . بعد ذلك ، استخدم خط أنابيب العد ل Cell Ranger لإجراء المحاذاة والتصفية وعد الباركود وعد المعرف الجزيئي الفريد (UMI) لإنشاء مصفوفات الباركود للمعالم13.
- قم بإجراء تقليل أبعاد البيانات والتصور باستخدام حزمة R Seurat14.
- أولا ، تقرأ الدالة Read10X () ل Seurat في إخراج خط أنابيب Cell Ranger ثم تستخدم مصفوفة العد لإنشاء كائن Seurat. بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا التي تحتوي على تعبير عن <200 أو >4000 جين أو نسبة جين الميتوكوندريا التي كانت أكثر من 10٪ بواسطة وظيفة subset () ل Seurat.
- استخدم NormalizeData () و FindVariableFeatures() لتسوية البيانات وتحديد 2000 معلم متغير للغاية، على التوالي.
- قم بإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) على البيانات المقاسة ، وقم بتجميع الخلايا ذات الخافتات = 30 والدقة = 0.5. أخيرا ، استخدم الدالة RunUMAP () لتصور مجموعات البيانات أحادية الخلية و FindAllMarkers () للعثور على كل علامة حيوية للمجموعة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف هذا البروتوكول طريقة هضم الخلايا المكونة من خطوتين لإعداد معلق أحادي الخلية للشرايين السباتية للفأر (الشكل 1). تجمع طريقة هضم الخلايا المكونة من خطوتين بين كولاجيناز / DNase مع التربسين لفصل جدار الأوعية الدموية السباتي للفأر بشكل فعال للحصول على معلقات أحادية الخلية عالية الجودة لتسلسل الخلية الواحدة. بعد التفكك ، تم حساب تركيز الخلية وصلاحيتها بواسطة عداد خلية آلي. أظهر الحقل اللامع مورفولوجيا الخلايا الوعائية السباتية بعد الهضم ، وكشف تلطيخ AOPI المزدوج في وقت واحد عن صلاحية الخلية (<...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لإعداد معلق أحادي الخلية عالي الجودة من الشريان السباتي للفئران البرية ، حيث تم إنشاء طريقة هضم من خطوتين تدمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتربسين. بعد فحص جودة التعليق أحادي الخلية ، وجدنا أنه يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز خلية مرتفع. علاوة على ذلك ، تم اكتشاف مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في الشريان السباتي ، بما في ذلك VSMCs ، والخلايا الليفية ، و ECs ، و Mφ / DCs ، بنجاح بعد معالجة البيانات أحادية الخلية.
لا تزال الطرق ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (82070450 إلى CT و 82170466 إلى L.Z.) وزمالة مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (7121102223 إلى F.L.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ التربسين الخالي من EDTA | Beyotime | C0205 | يخفف 1 مل من 0.25٪ من التربسين الخالي من EDTA إلى 1 مل من 1x PBS. |
| محلول ملحي 0.9٪ كلوريد الصوديوم | Beyotime | ST341 | يخفف محلول الهيبارين الصوديوم إلى تركيز نهائي يبلغ 10 مجم / مل |
| محاقن | ؛ SKJYLEAN | sk-r009 | لإجراء نضح القلب |
| 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي | KIRGEN | KG2211W | لطرد مركزي قطعة الأنسجة وتعليق الخلية |
| 20 مل محاقن | SKJYLEAN | sk-r013 | لأداء نضح القلب |
| 40 & micro; مصفاة الخلايا m | JETBIOFIL | css010040 | لتصفية شظايا الأنسجة غير المهضومة |
| مجموعة AO / PI | Hengrui | Biological RE010212 | لتحديد ما إذا كانت الخلية حية أو ميتة |
| عداد الخلايا الآلي | Countstar | Mira FL | لتحليل مورفولوجيا الخلية وصلاحية الخلايا الوعائية السباتية المهضومة |
| برنامج Cell Ranger | 10 & مرات ؛ علم الجينوم | 3.0.2 | لمعالجة إخراج الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الكروم وإجراء التجميع وتحليل التعبير |
| الجيني الكروم خلية واحدة 3'مجموعات الكاشف v3 | 10 & مرات ؛ علم الجينوم | 1000075 | لإعداد مكتبات الحمض النووي الريبي أحادية الخلية من معلق أحادي الخلية |
| الكولاجيناز II | سيجما-ألدريتش | C6885 | المخفف مع HBSS إلى تركيز نهائي من 125 CDU / مل |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | تمييع مع HBSS إلى تركيز نهائي من 60 U / مل |
| مصل الأبقار الجنينية ؛ | HyClone | SH30088.03 | إنهاء تفاعل الهضم |
| محلول الملح المتوازن هانك | 14175095 جيبكو | يخزن في الغرفة درجة حرارة | |
| الصوديوم الهيبارين | Solarbio Life Science | H8060 | مخفف مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي من 10 مجم / مل |
| طرد مركزي دقيق | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | يطبق لغزل الأنسجة وكريات الخلايا |
| NovaSeq 6000 & nbsp ؛ | Illumina | N / A | Sequencer |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات | Solarbio Life Science | P1000 | يستخدم في التروية القلبية وإعادة تعليق الخلايا |
| حزمة Seurat- R | Satija Lab | 3.1.2 | لإجراء تقليل الأبعاد والتصور وتحليل بيانات تسلسل scRNA |
| لوحات زراعة الخلايا ذات الستة آبار | NEST | 703002 | وضع أنسجة الأوعية الدموية |
| حمام مائي | Jinghong | DK-S22 | حافظ على درجة حرارة الهضم عند 37 درجة ؛ ج |
المراجع
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694(2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180(2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530(2020).
- Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426(2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321(2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832(2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266(2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339(2021).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152(2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128(2021).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
