يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصوير خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ بعد النزف تحت العنكبوتية

2.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65873

⸱

أغسطس 18, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, 2Clinical Medical Research Center, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

في هذه المقالة

ملخص

يؤكد التحقيق الأولي أن النزف تحت العنكبوتية (SAH) يسبب زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. يتطلب تقييم انقباض الخلايا المحيطة بعد SAH التمييز بين خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة. ومن ثم ، تم تطوير إجراء لتسمية pericytes الدماغ قابلة للحياة وغير قابلة للحياة في وقت واحد في أقسام الدماغ ، مما يسهل الملاحظة باستخدام مجهر متحد البؤر عالي الدقة.

الملخص

الخلايا المحيطة هي خلايا جدارية حاسمة تقع داخل دوران الأوعية الدقيقة الدماغية ، وهي محورية في تعديل تدفق الدم الدماغي بنشاط عن طريق تعديلات الانقباض. تقليديا ، يتم قياس انقباضها من خلال مراقبة التحولات المورفولوجية وتغيرات قطر الشعيرات الدموية القريبة في ظل ظروف محددة. ومع ذلك ، فإن تثبيت ما بعد الأنسجة ، وتقييم الحيوية وما يترتب على ذلك من انقباض pericyte للخلايا المحيطة بالدماغ المصورة يصبح معرضا للخطر. وبالمثل ، فإن وضع العلامات الوراثية على الخلايا المحيطة بالدماغ يقصر في التمييز بين الخلايا المحيطة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، لا سيما في الحالات العصبية مثل النزف تحت العنكبوتية (SAH) ، حيث يتحقق تحقيقنا الأولي من صحة زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. تم وضع بروتوكول موثوق للتغلب على هذه القيود ، مما يتيح وضع علامات الفلورسنت في وقت واحد لكل من pericytes الدماغ الوظيفية وغير الوظيفية في أقسام الدماغ. تسمح طريقة وضع العلامات هذه بتصور مجهر متحد البؤر عالي الدقة ، مع وضع علامة متزامنة على الأوعية الدموية الدقيقة لشريحة الدماغ. يوفر هذا البروتوكول المبتكر وسيلة لتقييم انقباض pericyte في الدماغ ، وتأثيره على قطر الشعيرات الدموية ، وهيكل pericyte. إن التحقيق في انقباض الخلايا المحيطة بالدماغ في سياق SAH يعطي فهما ثاقبا لآثاره على دوران الأوعية الدقيقة الدماغية.

المقدمة

تحيط الخلايا المحيطة بالدماغ ، التي تتميز بنتوءاتها النحيلة وأجسام الخلايا البارزة ، دوران الأوعية الدقيقة 1,2. في حين أن زيادة تدفق الدم الدماغي مدفوعة في الغالب بتمدد الشعيرات الدموية ، فإن الشرايين الأصغر تظهر معدلات تمدد أبطأ3. يمارس انقباض Pericyte تأثيرا على قطر الشعيرات الدموية ومورفولوجيا pericyte ، مما يؤثر على ديناميكيات الأوعية الدموية4. يؤدي تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ إلى انقباض الشعيرات الدموية ، وفي السيناريوهات المرضية ، قد يعيق الانكماش المفرط تدفق كرات الدم الحمراء5. يمكن لعوامل مختلفة ، بما في ذلك النورإبينفرين المنطلق من الموضع الأزرق ، أن تحفز تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ داخل الشعيرات الدموية6. مع دور تنظيمي في تدفق الدم الدماغي ، تظهر pericytes تخليق 20-HETE ، وتعمل كمستشعر للأكسجين أثناء فرط التأكسج7. يؤثر الانقباض التأكسدي النترجي الناجم عن الإجهاد في خلايا الدماغ بشكل ضار على الشعيرات الدموية5. على الرغم من التحقيقات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي في تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ 8 ، لا تزال المعرفة محدودة فيما يتعلقبتصوير خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة داخل شرائح الدماغ.

بشكل حاسم ، فإن التصوير بعد تثبيت الأنسجة للخلايا المحيطة بالدماغ يضر بحيويتها وتقييم الانقباض اللاحق. علاوة على ذلك ، في سيناريوهات مثل الاضطرابات العصبية (على سبيل المثال ، نزيف تحت العنكبوتية - SAH) ، يفشل وضع العلامات المعدلة وراثيا للخلايا المحيطة بالدماغ في التمييز بين الخلايا المحيطة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، كما أكدت دراستنا الأولية لموت الخلايا المحيطة بالدماغ التي يسببهاSAH 9.

للتغلب على هذه التحديات ، استخدمنا TO-PRO-3 لتسمية الخلايا المحيطة الحية ، بينما تم تلطيخ المتوفين بيوديد البروبيديوم (PI). استخدمنا تقنيات التصوير متحد البؤر عالية الدقة لتصور خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة في شرائح الدماغ مع الحفاظ على نشاط الشريحة أثناء التصوير. تهدف هذه المقالة إلى تقديم طريقة قابلة للتكرار لتصوير خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة في شرائح الدماغ ، والتي تعمل كأداة قيمة للتحقيق في تأثير pericytes الدماغ على دوران الأوعية الدقيقة الدماغية بعد SAH.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات واستخدام بجامعة كونمينغ الطبية (kmmu20220945). تم استخدام فئران Sprague-Dawley (SD) من كلا الجنسين ، 300-350 جم ، في هذه الدراسة.

1. تحفيز نموذج SAH

  1. تخدير الفئران باستخدام 2٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين. الحفاظ على التخدير عن طريق توفير التخدير المستمر بالاستنشاق مع الأيزوفلوران (1٪ -3٪). تأمين رأس الجرذ باستخدام جهاز تجسيمي (انظر جدول المواد).
  2. قم بإنشاء نموذج SAH باتباع الخطوات أدناه.
    1. أدخل إبرة الحقن المجهري في الصهريج فوق السيلار. بعد ذلك ، قم بحقن الدم الذاتي من شريان ذيل الفئران (بدون مضادات التخثر) في الخزان فوق السيلار باستخدام مضخة حقنة (انظر جدول المواد).
    2. زرع إبرة حقن مجهري في البطين الدماغي الجانبي الأيمن باستخدام الإحداثيات المذكورة: bregma ، −0.8 مم ؛ جانبي ، 1.4 مم ؛ العمق ، 4 مم9. بالنسبة لمجموعات SAH ، قم بحقن 0.2 مل من دم شريان ذيل الفئران. بالنسبة للمجموعات الوهمية ، يتم تطبيق نفس الحجم من محلول ملحي متساوي التوتر (الشكل 1 أ).

2. إعداد شريحة الدماغ وتحقيق الاستقرار

  1. تخدير الفئران بعمق باستخدام استنشاق إيزوفلوران 2٪. بعد قطع الرأس ، استخرج الأدمغة بأكملها واغمرها في السائل النخاعي الاصطناعي المثلج (ACSF).
    ملاحظة: استخدم محاليل ACSF المحضرة حديثا بالتركيب التالي: 134 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2.8 مللي مول KCl ، 29 مللي متر NaHCO3 ، 1.1 مللي متر NaH 2 PO 4 ، 1.5 mM MgSO4 ، 2.5 mM CaCl2 ، و 10.11 mM D-Glucose (انظر جدول المواد). الحفاظ على درجة الحموضة بين 7.3 و 7.4.
  2. استخدم اهتزازا (انظر جدول المواد) لتحضير شرائح الدماغ الحادة بسمك 200 ميكرومتر من فئران SD في ACSF المثلج البارد الذي يتم تهويته بنسبة 5٪ CO 2 و 95٪ O 2 (الشكل 2).
  3. ضع شرائح الدماغ الحادة التي يبلغ سمكها 200 ميكرومتر في غرفة تخزين على شبكة نايلون مغمورة في ACSF. قم بموازنة محلول ACSF مع 95٪ O 2 و 5٪ CO2 ، مع الحفاظ على نطاق درجة حرارة 35-37 درجة مئوية. اسمح لشرائح الدماغ بالاستقرار لمدة 2 ساعة ، مما يمنحها الوقت للتكيف (الشكل 3).

3. وضع العلامات على pericytes في شرائح الدماغ الحادة باستخدام TO-PRO-3

ملاحظة: تم تصنيف الخلايا المحيطة من شرائح الدماغ الحادة بشكل فلوري باستخدام التتبع TO-PRO-310.

  1. أضف صبغة الفلورسنت TO-PRO-3 إلى ACSF ، وتحقيق تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. احتضان شرائح الدماغ الحادة في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة باستخدام ACSF المحتوي على TO-PRO-3 لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: تذكر ارتداء قفازات اللاتكس أثناء التعامل مع TO-PRO-3 للحماية.
  2. انقل مصفاة شبكة النايلون ، التي تحمل شرائح الدماغ ، من غرفة التحميل إلى غرفة شطف الألواح المكونة من 6 آبار (انظر جدول المواد). اترك شرائح الدماغ تبقى في غرفة الشطف لمدة 10 دقائق (الشكل 4 د).
    ملاحظة: تنهي خطوة الشطف هذه عملية التلوين ، وتقلل من وضع العلامات على الخلفية ، وتمنع تلطيخ غير محدد.
  3. اشطف المستحضرات لمدة 15 دقيقة باستخدام محلول ACSF المتوازن مع خليط من 5٪ CO 2 و 95٪ O2. توقف خطوة الشطف هذه امتصاص الصبغة وتقلل من وضع العلامات على الخلفية (الشكل 4C).

4. تلطيخ الخلايا غير الحيوية من دوران الأوعية الدقيقة الدماغية في شرائح الدماغ الحادة

  1. احتضان شرائح الدماغ محملة مسبقا ب TO-PRO-3 عند 37 درجة مئوية مع إيزولكتين B4 مترافق مع Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4 ؛ 5 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في بيئة مظلمة. بعد الحضانة ، شطف شرائح الدماغ لمدة 15 دقيقة في ACSF (الشكل 4E).
  2. احتضان شرائح الدماغ في ACSF بالغاز مع 5٪ CO 2 و 95٪ O2 كالمعتاد. أضف يوديد البروبيديوم (PI) بتركيز 37 ميكرومتر إلى كلا المحلولين عند 37 درجة مئوية. سيؤدي ذلك إلى تسمية خلايا الدماغ غير الحيوية. احتضن المستحضرات في محلول ACSF لمدة 60 دقيقة في الظلام (الشكل 4F).
  3. بعد ذلك ، اشطف المستحضرات لمدة 15 دقيقة باستخدام محاليل ACSF لوقف امتصاص الصبغة وتقليل وضع العلامات على الخلفية.

5. تصوير خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ الحادة

  1. انقل شرائح الدماغ برفق إلى أطباق متحدة البؤر ذات قاع زجاجي (انظر جدول المواد) باستخدام ماصات باستور البلاستيكية. املأ الأطباق بمحلول ACSF تمت موازنته مسبقا مع 5٪ CO 2 و 95٪ O2. استخدم شبكة حديدية لتثبيت شرائح دماغ الفئران في مكانها.
  2. نقل الأطباق البؤرية ذات القاع الزجاجي إلى مرحلة المجهر متحد البؤر. ضع شريحة الدماغ الحادة في قاع الطبق وقم بإعطائها9 بمحلول ACSF متوازن بمزيج من 95٪ O 2 و 5٪ CO2 أثناء التصوير المجهري متحد البؤر (الشكل 5A والشكل 5Ab).
  3. تصور خلايا جدار الأوعية الدموية الدماغية القشرية باستخدام هدف 40x. التقط حزم الصور باستخدام برامج متوافقة (انظر جدول المواد). استخدم المرشحات المناسبة ل IB4 (الإثارة / الانبعاث 460 نانومتر / 520 نانومتر) ، PI (الإثارة / الانبعاث 545 نانومتر / 595 نانومتر) ، و TO-PRO-3 (الإثارة / الانبعاث 606 نانومتر / 666 نانومتر) (الشكل 5D).
    ملاحظة: التقط صورا بالتفاصيل التالية: عدسة DIC N1 موضوعية 40× ، 3 × 12 بت: 512 × 512 بكسل (0.22 × 0.22 مم) ، المعايرة: 0.42 ميكرومتر / بكسل.
  4. تحديد الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة والخلايا المحيطة بناء على شبكتها ومورفولوجيتها. حدد موقع منطقة معينة تحتوي على شبكة الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة على كل شريحة دماغية والتقط الصور.
  5. لاحظ بعناية موقع التصوير لضمان الاتساق في اللقطات اللاحقة (الشكل 5B ، C). لمزيد من المعالجة والتحليل ، استخدم برنامج تحليل الصور (ImageJ) وبرنامج تحرير الصور (انظر جدول المواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في ظل الظروف الفسيولوجية الطبيعية ، لا تخضع خلايا الدماغ عموما لموت الخلايا. يوضح الشكل 6 هذه الظاهرة ، حيث يشير اللون الأصفر إلى وجود خلايا محيطية حيوية في الدماغ. لا تظهر الخلايا المحيطة بالدماغ أي تلطيخ مع PI ، مما يشير إلى صلاحيتها. لمزيد من التحقيق فيما إذا كانت الخلايا المحيطة تظل مرتبطة بالأوعية الدموية الدقيقة بعد موت الخلية ، تم استخدام طرق في نموذج الفئران SAH ، وتم إجراء التصوير اللاحق.

تم تطوير طرق لتصوير كل من خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تطوير تقنيات تصوير متحدة البؤر عالية الدقة لتصور خلايا الدماغ الحيوية ، وخلايا الدماغ غير الحيوية ، والأوعية الدموية الدقيقة في شرائح الدماغ. في شرائح دماغ الفئران الحادة ، تستلزم العملية وضع العلامات الأولية على الخلايا المحيطة ب TO-PRO-311 ، تليها الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة مع IB412. في وقت لاحق ، يتم تحديد pericytes المتوفى باستخدام PI. هذا البروتوكول واضح ومباشر وقابل للتكرار وقابل للتطبيق بدرجة كبيرة على البحث الوظيفي.

لتتبع الخلاي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81960226,81760223); مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة يوننان (202001AS070045،202301AY070001-011)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6 آبار لوحةABC الكيمياء الحيويةABC703006RT
أدوبي فوتوشوبأدوبيالمصور CS6 16.0.0RT
رقائق الألومنيومMIAOJIE225 مم × 273 ممRT
CaCl 2< sub> middot ؛ 2H2< / sub>OSigma-AldrichC3881RT
برنامج التصوير متحد البؤرنيكونNIS-Elements 4.10.00RT
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرنيكونN-SIM / C2siRT
خزان الغاز (5٪ CO2< / sub> ، 95٪ O2< / sub>)PENGYIDA40LRT
أطباق زجاجية متحدة البؤرBeyotimeFCFC020-10 قطعRT
الجلوكوزSigma-AldrichG5767RT
الغراءEVOBONDKH-502RT
آلة صنع الثلجXUEKEIMS-20RT
برنامج تحليل الصورالمعاهد الوطنية للصحةصورة JRT
التخدير بالاستنشاقSCIENCEQAF700RT
Isolectin B 4- FITCSIGMAL2895 &ndash ؛ 2MGمتجر aliquots في – 20 درجة ؛ C
KClSigma-Aldrich7447 &ndash ؛ 40 & ndash ؛ 7RT
KH2PO4Sigma-AldrichP0662RT
MgSO4Sigma-AldrichM7506RT
NaClSigma-Aldrich7647 & ndash; 14 – 5RT
NaH2PO4· H2< / sub>OSigma-Aldrich10049 – 21 – 5RT
NaHCO3< / sub>Sigma-AldrichS5761RT
ماصة باستورNEST التكنولوجيا الحيوية318314RT
المضخة التمعجيةScientific Industries Incنموذج 203RT
بروبيديوم (اليود) MedChem ExpressHY-D0815 / CS-7538تخزين aliquots في &ndash ؛ 20 درجة ؛ C
جهاز التجسيمSCIENCEQART
مضخة حقنةهارفاردمضخة مضخة 11 ELITE NanomiteRT
حمام مائي ترموستاتيOLABOHH-2RT
يهتز ميكروتومLeicaVT1200RT
نظام

المراجع

  1. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
  2. Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
  3. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  4. Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
  5. Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
  6. Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
  7. Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
  8. Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
  9. Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
  10. Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222(2021).
  11. Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
  12. Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
  13. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
  14. Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
  15. Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
  16. Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
  17. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

انقباض الخلايا الحول وعائيةالوسم الفلوريالمجهر البؤريتصوير الأوعية الدموية الدقيقةحيوية الخلايا الحول وعائيةيوديد البروبيديومأيزولكتين B4
تصوير خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ بعد النزف تحت العنكبوتية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.