مقالة منهجية

عزل الأمعاء من يرقات الزرد لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

DOI:

10.3791/65876

⸱

نوفمبر 10, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Genetics, Erasmus University Medical Center - Sophia Children's Hospital, 2Division of Psychosocial Research and Epidemiology, the Netherlands Cancer Institute, 3Department of Hematology, Erasmus Medical Center, 4Department of Pathology, GROW-School for Oncology and Developmental Biology, Maastricht University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ، لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤدي الجهاز الهضمي (GI) مجموعة من الوظائف الأساسية للحياة. يمكن أن تؤدي العيوب الخلقية التي تؤثر على تطورها إلى اضطرابات عصبية عضلية معوية ، مما يسلط الضوء على أهمية فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الجهاز الهضمي والخلل الوظيفي. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب للحصول على خلايا حية قابلة للحياة والتي يمكن استخدامها لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). يعتمد هذا البروتوكول على التشريح اليدوي لأمعاء الزرد ، يليه التفكك الأنزيمي مع غراء. بعد ذلك ، يتم تقديم الخلايا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، ويتم جمع الخلايا القابلة للحياة من أجل scRNA-seq. باستخدام هذه الطريقة ، تمكنا من تحديد أنواع الخلايا المعوية المختلفة بنجاح ، بما في ذلك الخلايا الظهارية واللحمية والدم والعضلات والخلايا المناعية ، وكذلك الخلايا العصبية المعوية والدبقية. لذلك ، نعتبره موردا قيما لدراسة تكوين الجهاز الهضمي في الصحة والمرض ، باستخدام الزرد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز الهضمي (GI) هو نظام معقد يلعب دورا حيويا في الصحة العامة والرفاهية. وهي مسؤولة عن هضم وامتصاص العناصر الغذائية ، وكذلك القضاء على النفايات 1,2. يتكون الجهاز الهضمي من أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الظهارية وخلايا العضلات الملساء والخلايا المناعية والجهاز العصبي المعوي (ENS) ، والتي تتواصل بشكل وثيق معا لتنظيم وظيفة الأمعاء المناسبة والحفاظ عليها3،4،5. يمكن أن يكون للعيوب في تطور الجهاز الهضمي آثار بعيدة المدى على جوانب مختلفة مثل امتصاص العناصر الغذائية ، وتكوين الجراثيم ، ومحور الأمعاء والدماغ ، و ENS، مما يؤدي إلى العديد من الاضطرابات العصبية العضلية المعوية ، مثل مرض هيرشسبرونغ وانسداد الأمعاء المزمن 6,7. تتميز هذه الاضطرابات بخلل شديد في حركة الأمعاء ناتج عن تغيرات في الخلايا الرئيسية المختلفة ، مثل الخلايا الخلالية ل Cajal وخلايا العضلات الملساء و ENS6،8،9. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الجهاز الهضمي والخلل الوظيفي لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.

يعتبر الزرد كائنا نموذجيا قيما لدراسة تطور الجهاز الهضمي واختلاله الوظيفي بسبب تطوره الجنيني السريع ، والشفافية خلال المراحل الجنينية واليرقات ، وقابلية السحب الوراثية10،11،12،13،14. تتوفر العديد من خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية. مثال على هذا الخط هو سمك الزرد tg (phox2bb: GFP) ، الذي يشيع استخدامه لدراسة ENS، حيث يتم تصنيف جميع خلايا phox2bb + ، بما في ذلك الخلايا العصبية المعوية ،15,16. هنا ، باستخدام خط الزرد tg (phox2bb: GFP) ، نقدم طريقة لعزل الأمعاء لمدة 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) يرقات لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع عمليات تربية الزرد والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لتشريع Erasmus MC ورعاية. يندرج استخدام يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ضمن فئة التجارب التي لا تتطلب موافقة أخلاقية رسمية ، على النحو المبين في اللوائح الهولندية.

1. الحصول على 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) من النوع البري ويرقات tg (phox2bb: GFP)

  1. قم بإعداد تربية الزرد من النوع البري وجمع 50 بيضة في وسط E3 المخزن HEPES (المشار إليه فيما يلي باسم E3) في طبق بتري 15 سم. استخدم هذه الأسماك كعنصر تحكم سلبي لفرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACs).
  2. قم بإعداد تربية سمك الزرد tg (phox2bb: GFP) وجمع ما يقرب من 300 بيضة في E3 في طبق بتري 15 سم.
  3. احتفظ بالبيض المخصب في E3 (بحد أقصى 50 بيضة / طبق) في دورة ضوء / مظلمة لمدة 14 ساعة / 10 ساعات ، في حاضنة عند 28.5 درجة مئوية.
  4. عند 1 dpf ، قم بإزالة البيض غير المخصب واترك البيض المخصب يتطور إلى 5 dpf.
  5. حدد يرقات tg (phox2bb: GFP) عند 1 dpf.

2. تفكك اليرقات الكاملة من النوع البري

  1. تخدير 5 يرقات dpf مع 0.016 ٪ تريكايين.
  2. قم بتقطيع 30 سمكة زرد إلى قطع صغيرة باستخدام شفرة حلاقة في طبق بتري يحتوي على 1 مل من محلول 10x trypsin-EDTA.
  3. انقل سمك الزرد المفروم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم إجمالي 2 مل من محلول 10x trypsin-EDTA واتركه على الثلج لمدة 3 ساعات. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 كل ساعة لتحفيز التفكك.

3. عزل الأمعاء

  1. ضع 6-10 5 يرقات dpf مخدرة بنسبة 0.016٪ تريكايين على التوالي ، على صفيحة أغاروز 1.8٪ (0.45 جم من الأغاروز في 25 مل من E3) ، تحت مجهر تشريح
  2. ضع دبوس حشرة واحد في رأس الزرد.
  3. قم بإزالة كل ما تبقى من E3 باستخدام منديل.
  4. عزل الأمعاء باستخدام دبوس حشرة آخر ، دون إزعاج أي أعضاء أخرى. تأكد من إزالة صفار البيض (الشكل التكميلي S1A).
  5. بمجرد عزلها ، افحص الأمعاء وقم بإزالة جميع المواد غير المعوية (مثل الجلد والدهون والكبد) إذا لزم الأمر.
  6. جمع الأمعاء مع ملاقط ووضعها في أنبوب الطرد المركزي ، التي تحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 10 ٪ مصل العجل الجنيني (FCS) ، على الجليد.
    ملاحظة: يجب عزل ما لا يقل عن 244 أمعاء ، مع الحفاظ على إجمالي وقت التشريح عند 3 ساعات. هذا ممكن مع شخصين يعملان بالتوازي.

4. تفكك القناة الهضمية

  1. مباشرة بعد تشريح جميع الأمعاء ، يقوم جهاز الطرد المركزي بأنبوب الطرد المركزي الدقيق بأقصى سرعة (13800 × جم) لمدة 30 ثانية.
  2. قم بإزالة PBS / 10٪ FCS ولكن اترك كمية صغيرة (~ 100 ميكرولتر) لمنع الأمعاء من الجفاف. أضف 500 ميكرولتر من غراء 2.17 مجم / مل في HBSS يحتوي على CaCl2 و MgCl2 ، لفصل الخلايا.
  3. تنشيط غراء مع 2.5 ميكرولتر من السيستين (1 م).
  4. احتضان الأحشاء في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ماصة صعودا وهبوطا في منتصف الطريق (بعد 5 دقائق) لتحفيز هضم الأنسجة الأنزيمية.
  5. نقل الخلايا إلى أنبوب FACS باستخدام مصفاة خلية 35 ميكرومتر ، مبللة مسبقا ب 0.5 مل من PBS / 10٪ FCS.
  6. اغسل المصفاة بإضافة إجمالي 2 مل من PBS / 10٪ FCS في خطوات 0.5 مل.
  7. جهاز طرد مركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من PBS / 10٪ FCS.
  9. أضف 1 ميكروغرام / مل من 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) لتسمية الخلايا الميتة (1: 1000) واحتضانها لمدة 5 دقائق للسماح باستبعادها أثناء FACS.

5. تخصيب نظام مراقبة الأصول الميدانية

  1. استخدم عينة النوع البري لتعيين بوابات مجموعة الخلايا التي تم فرزها عن طريق تسجيل 3000 خلية على مقياس التدفق الخلوي (الشكل التكميلي S1B-E).
  2. استخدم فوهة 100 ميكرومتر ، واضبط دقة الفرز على النقاء ، وضع أنبوب التجميع الذي يحتوي على 200 ميكرولتر من PBS / 5٪ FCS ، في آلة FACS.
  3. قم بتحميل تعليق الخلية في الأمعاء وفرز الخلايا الحية (سلبية DAPI) ، والخلايا المفردة في أنبوب التجميع (الشكل 2C) ، عن طريق استبعاد الخلايا المزدوجة (الشكل 2B) والخلايا الميتة (الشكل 2C).
    ملاحظة: بالنسبة لسمك الزرد tg (phox2bb) ، يتم فحص نسبة خلايا GFP + فقط للرجوع إليها ، حيث يتم فرز جميع الخلايا الحية الفردية.
  4. احتفظ بأنبوب التجميع على الثلج بعد فرز الخلايا.
  5. عد تعليق الخلية باستخدام مقياس الدم ، بما في ذلك فحص الجدوى باستخدام التريبان الأزرق. إذا كانت الجدوى 80٪ على الأقل ، فتابع الخطوة التالية.
  6. الخلايا جاهزة الآن لمعالجة scRNAseq (أي منصة الكروم الجينومية 10x). استخدم ما يقرب من 20000 خلية لكل عينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع هذا البروتوكول ، حققنا عزلا ناجحا وتفككا للأمعاء بأكملها من 5 يرقات dpf. باستخدام غراء كإنزيم تفكك ، عززنا بشكل كبير صلاحية الخلية ، مما مكن من التقاط 46139 حدثا يتضمن خلايا مفردة قابلة للحياة (6.4٪ من جميع الخلايا) من أصل 244 أمعاء معزولة (الشكل 2 أ). تم استخدام اليرقات الكاملة من النوع البري كعنصر تحكم لضمان تحسين عملية الفرز ، مما يتيح التعرف الفعال على الخلايا وفرزها. يمكن استخدام اليرقات الكاملة لأننا نفرز فقط الخلايا الحية المفردة (الشكل التكميلي S1B-E). تم تقديم جم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طريقة لعزل وتفكك أمعاء 5 يرقات الزرد dpf باستخدام FACS. باستخدام هذه الطريقة ، تم جمع أنواع مختلفة من الخلايا المعوية وتحليلها بنجاح بواسطة scRNA-seq ، باستخدام منصة 10x Genomics Chromium. اخترنا خط الزرد tg (phox2bb: GFP) ، حيث أردنا مؤشرا على أن خلايا ENS القابلة للحياة ستكون معزولة أيضا (الشكل 2D). ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذه الطريقة يمكن أن تمتد بسهولة إلى خطوط اهتمام الزرد الأخرى ، حيث استخدمنا فقط بوابة phox2bb لتقييم صلاحية الخلايا العصبية ، وليس لاختيار مجموع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل أصدقاء مؤسسة صوفيا (SSWO WAR-63).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10x Trypsin (0.5٪) -EDTA (0.2٪)Sigma59418C
5 مل أنبوب سفلي دائري مع غطاء مصفاة خليةFalcon352235
AgaroseSigma-AldrichA9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 مل (أنابيب FACS) غطاء المفاجئBD Biosciences352054
Cell Ranger v3.0.210X GenomicsN / A
DAPISigma-AldrichCat # D-9542
مجهر تشريحأوليمبوس SZX16
FACSAria III آلة فرزBD BiosciencesN / A
HBSS مع CaCl 2 < / sub > و MgCl 2< / sub>Gibco14025050 دبابيس
الحشراتأدوات العلوم الدقيقة26000-25
L-CysteineSigmaC7352
MS-222 ، TricaineSupelcoA5040-250G
PapainSigmaP4762
Seurat v3Stuart et  al. (2019)N / A
Trypan blue   ؛سيجما قطة # T8154

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
  2. Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
  3. Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  4. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
  5. Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
  6. Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
  7. Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
  8. De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
  9. Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
  14. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
  15. Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
  16. Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).
  17. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  18. Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070(2023).
  19. Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290(2022).
  20. Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
  21. Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).
  22. Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
  23. Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
  24. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة