مقالة منهجية

التعبير عالي الإنتاجية وتنقية ناقلات المذاب البشري للدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية

DOI:

10.3791/65878

⸱

سبتمبر 29, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب الدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية لناقلات الأغشية البشرية كميات ملليغرام من البروتين المستقر والسليم والمتجانس. نصف هنا الطرق القابلة للتطوير لفحص ناقلات ناقلات المذاب البشري والتعبير عنها وتنقيتها باستخدام الجينات المحسنة للكودون.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ناقلات المذاب (SLCs) هي ناقلات غشائية تستورد وتصدر مجموعة من الركائز الداخلية والخارجية ، بما في ذلك الأيونات والمغذيات والمستقلبات والناقلات العصبية والمستحضرات الصيدلانية. على الرغم من ظهورها كأهداف علاجية جذابة وعلامات للمرض ، إلا أن هذه المجموعة من البروتينات لا تزال تعاني من نقص الأدوية نسبيا من قبل الأدوية الحالية. يتم إعاقة مشاريع اكتشاف الأدوية لهذه الناقلات بسبب المعرفة الهيكلية والوظيفية والفسيولوجية المحدودة ، ويرجع ذلك في النهاية إلى الصعوبات في التعبير عن هذه الفئة من البروتينات المضمنة في الغشاء وتنقيتها. نوضح هنا طرقا للحصول على كميات عالية النقاء وملليغرام من بروتينات ناقل SLC البشرية باستخدام تسلسلات جينية محسنة للكودون. بالاقتران مع الاستكشاف المنهجي لتصميم البناء والتعبير عالي الإنتاجية ، تضمن هذه البروتوكولات الحفاظ على السلامة الهيكلية والنشاط الكيميائي الحيوي للبروتينات المستهدفة. نسلط الضوء أيضا على الخطوات الحاسمة في تعبير الخلايا حقيقية النواة ، وتنقية التقارب ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم لهذه البروتينات. في النهاية ، ينتج عن سير العمل هذا مستحضرات بروتينية نقية ونشطة وظيفيا ومستقرة مناسبة لتحديد البنية عالية الدقة ، ودراسات النقل ، ومقايسات مشاركة الجزيئات الصغيرة ، والفحص عالي الإنتاجية في المختبر .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لطالما كانت البروتينات الغشائية أهدافا للباحثين والصناعات الدوائية على حد سواء. من بين هؤلاء ، فإن ناقلات المذاب (SLCs) هي عائلة تضم أكثر من 400 جين ناقل ثانوي مشفر داخل الجينوم البشري1. تشارك هذه الناقلات في استيراد وتصدير العديد من الجزيئات ، بما في ذلك الأيونات2 ، والناقلات العصبية3 ، والدهون4،5،6،7 ، والأحماض الأمينية8 ، والمغذيات9،10،11 ، والمستحضرات الصيدلانية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم إيداع جميع جينات RESOLUTE SLC المحسنة للكودون في AddGene43 ، والتي تتوفر روابطها في قائمة الكواشف العامة الحازمة44. تم استنساخ هذه الجينات في بلازميد pDONR221 وتسمح بالاستنساخ المباشر للجينات في ناقل الوجهة باستخدام استنساخ إعادة التركيب45. لتحقيق أقصى قدر من التوازي ، تزرع الخلايا البكتيرية والحشرية والثدييات في شكل كتلة لإنتاج bacmid (القسم 3) ، وتضخيم الفيروس البقعي (القسم 5) ، واختبار التعبير (القسم 6) ، على التوالي. لهذه الخطوات ، يلزم وجود شاكر تعبير دقيق لضمان الخلط والتهوية الكافيين.

1. استنساخ (عالي الإنتاجية) من SLCs إلى pHTBV1.1 bacmid

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استنساخ جينات SLC من بلازميدات pDONR الحازمة إلى ناقلات BacMam للتعبير عن الثدييات
أثبتت البروتوكولات الموصوفة للاستنساخ والتعبير والتنقية نجاحها للعديد من ناقلات SLC عبر طيات البروتين المتعددة. ومع ذلك ، تشمل الإجراءات العديد من نقاط التفتيش لرصد التقدم ، مما يسمح بالتحسين لمراعاة الاختلافات في التعبير ، وطي البروتين ، والاستقرار المعتمد على الدهون والمنظفات ، والحساسية لظروف العازلة.

نقاط التفتيش أثناء استنساخ SLC والتعبير على نطاق صغير
في خطوات ا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وظل تطوير العلاجات التي تستهدف SLC معوقا بسبب عدم وجود توصيف منهجي لوظيفة الناقل. وقد أدى ذلك إلى انخفاض عدد الأدوية التي تستهدف هذه الفئة من البروتين بشكل غير متناسب بالنسبة إلى GPCRs والقنوات الأيونية63 ، على الرغم من أدوارها العديدة في العمليات الطبيعية والفيزيولوجية المرضية. RESOLUTE هو اتحاد دولي يهدف إلى تطوير تقنيات وأدوات بحثية متطورة لتسريع وتحسين أبحاث SLC الحالية. كجزء من RESOLUTE ، قمنا بتطوير هذه البروتوكولات للاستنساخ الفعال ، وبناء الغربلة ، والتعبير على نطاق واسع وتنقية SLCs البشري.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ هذا العمل في إطار مشروع RESOLUTE. تلقت RESOLUTE تمويلا من التعهد المشترك لمبادرة الأدوية المبتكرة 2 بموجب اتفاقية المنحة رقم 777372. يتلقى هذا المشروع المشترك دعما من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي و EFPIA. تعكس هذه المقالة آراء المؤلفين فقط ولا تتحمل IMI ولا الاتحاد الأوروبي و EFPIA المسؤولية عن أي استخدام قد يتم للمعلومات الواردة فيها. تم توفير بلازميد pHTBV من قبل البروفيسور فريدريك بويس (هارفارد).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3C البروتيازالمنتج داخليا
50 أو 100 كيلو دالتون مكثفات الطرد المركزيSartoriusVS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-&beta D-MaltosideAnatraceC325CYMAL-5
96-well bacmid طقم تنقيةMilliporeLSKP09604Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 مل)Greiner Bio-One780271
أختام بلاستيكية لاصقةQiagen19570وسادات الشريط
عمود الكروماتوغرافيا لاستبعاد حجم الاغاروزCytiva29091596Superose 6 زيادة 10/300 GL
Benzonase DNAseالمنتج داخليا
BisTrisSigma AldrichB9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris saltAnatraceCH210CHS
راتنج تقارب معدني الكوبالتتاكارا بيو635653تالون راتنج تقارب معدني
D (+) - بيوتينسيجما ألدريتش851209
كروماتوغرافيا استبعاد حجم ديكستران أغاروزCytiva28990944Superdex 200 زيادة 10/300 GL
DigitoninApollo ScientificBID3301
Dounce الأنسجة مطحنة (40 مل)كوكتيلالخالي من EDTA DWK Life Sciences357546
سيجما ألدريتش4693132001cOmplete ، كوكتيل مثبط البروتياز الخالي
EDTA مصل الأبقار الجنينيثيرمو فيشر10500064
Fos-Choline-12AnatraceF308SFS-12
GlycerolSigma AldrichG5516
Glyco-diosgeninAnatraceGDN101GDN
أعمدة تدفق الجاذبيةCole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 متوسطثيرمو فيشر12338018فري ستايل 293
متوسط HEPESApollo ScientificBI8181
عمود السيليكا UHPLC المحايد المحب للماءSepax231300-4615Unix-C SEC-300 4.6 × 150
إيميدازولسيجما ألدريتش56750
كاشف تعداء الحشراتسيجما ألدريتش71259كاشف
لوريل مالتوز نيوبنتيل جلايكولأناتراسNG310LMNG
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتسيجما ألدريتشM2670
شاكر التعبير الدقيقGlas-Col107A DPMINC24CE
كلوريدالصوديومسيجما ألدريتشS9888
n-Decyl- & beta ؛ - D-MaltosideAnatraceD322DM
n-Dodecyl-b-D-MaltopyranosideAnatraceD310DDM
n-Dodecyl-N ، N-Dimethylamine-N-OxideAnatraceD360LDAO
n-Nonyl- & beta ؛ -D-GlucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Octyl-d17- & beta ؛ - D-GlucopyranosideAnatraceO311DOGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		AnatraceO330C12E8
Octyl Glucose Neopentyl GlycolAnatraceNG311OGNG
فوسفات مخزن محلول ملحيسيجما AldrichD8537DPBS
بولي أوكسي إيثيلين (10) دوديسيل إيثرAnatraceAP1210C12E10
بولي أوكسي إيثيلين (9) دوديسيل الأثيرAnatraceAPO129C12E9
ختم مسامي لألواح زراعة الأنسجة VWR60941-084أفلام رايون للثقافات البيولوجية
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
مزيج إنزيم إعادة التركيبThermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
حشرات خاليةمن المصل Gibco10902088Sf-900 II وسائط خالية من المصل
الصوديوم بوتيراتسيجما ألدريتش303410
سونيكاتور مسبار 24رأسا سونيكس630-0579
وحدة طاقة سونيكاتورسونيكسVCX 750
سترابيو-تاكتين راتنجIBA علوم الحياة2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow راتنج عالي السعة
سكروزسيجما AldrichS7903
السكروز مونودوديكانواتAnatraceS350DDS
خلايا HEK293 المعلقة المتكيفةThermo FisherA14527Expi293F
كاشف التعداءSigma Aldrich70967كاشف الإرسال GeneJuice
عمود مثبط البروتياز من وسائط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Solute CarriersMembrane TransportersProtein ExpressionProtein PurificationHigh Throughput ScreeningAffinity PurificationSize Exclusion ChromatographySDS PAGE ElectrophoresisFluorescence MicroscopyDrug Discovery

مقالات ذات صلة