تحسين ثقافة الخلايا الظهارية للعدسة الأساسية للماوس: دليل شامل للتربسين

ملخص

تحدد هذه المخطوطة بروتوكول فيديو مفصل لزراعة الخلايا الظهارية للعدسة الأولية (LECs) ، بهدف تحسين قابلية التكاثر والمساعدة في البحث في إعتام عدسة العين وعتامة الكبسولة الخلفية (PCO). يقدم إرشادات خطوة بخطوة حول تشريح العدسة ، وعزل LECs ، والتحقق من صحتها ، وهو بمثابة دليل قيم ، خاصة للوافدين الجدد في هذا المجال.

الملخص

تلعب الخلايا الطلائية للعدسة (LECs) أدوارا مهمة متعددة في الحفاظ على الاتزان الداخلي للعدسة ووظيفتها الطبيعية. تحدد LECs نمو العدسة وتطورها وحجمها وشفافيتها. على العكس من ذلك ، يمكن أن تؤدي LECs المختلة وظيفيا إلى تكوين إعتام عدسة العين وعتامة الكبسولة الخلفية (PCO). وبالتالي ، فإن إنشاء نظام زراعة LEC أولي قوي أمر مهم للباحثين المشاركين في تطوير العدسات والكيمياء الحيوية وعلاجات إعتام عدسة العين والوقاية من PCO. ومع ذلك، فإن زراعة المجتمعات المحلية منخفضة الاستهلاك الأولية تمثل تحديات منذ فترة طويلة بسبب محدودية توافرها، وبطء معدل انتشارها، وطبيعتها الحساسة.

تعالج هذه الدراسة هذه العقبات من خلال تقديم بروتوكول شامل لثقافة LEC الأولية. ويشمل البروتوكول خطوات أساسية مثل صياغة وسط استزراع محسن، وعزل دقيق لكبسولات العدسات، وتقنيات التربسين، وإجراءات الاستزراع الفرعي، وبروتوكولات الحصاد، والمبادئ التوجيهية للتخزين والشحن. طوال عملية الاستزراع ، تمت مراقبة مورفولوجيا الخلية باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور.

لتأكيد صحة LECs المستزرعة ، تم إجراء فحوصات التألق المناعي للكشف عن وجود وتوزيع بروتينات العدسة الحرجة ، وهي αA و γ-crystallins. يزود هذا البروتوكول المفصل الباحثين بمورد قيم لزراعة وتوصيف LECs الأولية ، مما يتيح التقدم في فهمنا لبيولوجيا العدسة وتطوير استراتيجيات علاجية للاضطرابات المرتبطة بالعدسات.

المقدمة

تلعب عدسة العين دورا حاسما في الرؤية من خلال تركيز الضوء الوارد على شبكية العين. وهو يتألف من بنية شفافة غير وعائية تتكون من خلايا متخصصة ، من بينها الخلايا الظهارية للعدسة (LECs) هي اللاعبين الرئيسيين. تقع LECs على السطح الأمامي للعدسة وهي مسؤولة عن الحفاظ على شفافيتها وتنظيم توازن الماء والمشاركة في نمو العدسة^{وتطورها 1,2}. LECs هي نوع فريد من الخلايا الموجودة في الجزء الأمامي من العدسة ، وتلعب دورا مهما في الحفاظ على وضوح العدسة ووظيفتها من خلال إنتاج ألياف العدسة باستمرار طوال الحياة.

يتميز إعتام عدسة العين بالتعتيم التدريجي للعدسة ، مما يؤدي إلى تشويه الضوء وتشتته ، مما يؤدي إلى ضعف الرؤية ^3,4. الآليات الدقيقة الكامنة وراء تكوين إعتام عدسة العين معقدة ومتعددة العوامل ، وتشمل عمليات خلوية وجزيئية مختلفة مثل الأشعة فوق البنفسجية ، والضرر التأكسدي ، والجلوكوز ^5,6. تم العثور على LECs لتساهم بشكل كبير في تطوير إعتام عدسة العين ، مما يجعلها محورا حيويا للبحث^{1،2،7،8،9}.

علاوة على ذلك ، فإن إحدى القضايا الأكثر إلحاحا في طب العيون اليوم هي الارتفاع النسبي في معدل عتامة الكبسولة الخلفية (PCO) ، المعروف أيضا باسم إعتام عدسة العين الثانوي. يظل PCO أكثر المضاعفات شيوعا بعد جراحة إعتام عدسة العين ، حيث يؤثر على ما يصل إلى 20-40٪ من المرضى البالغين و 100٪ من الأطفال في غضون 5 سنوات بعد الجراحة¹⁰. يحدث PCO بشكل أساسي بسبب LECs المتبقية التي تبقى في كيس المحفظة بعد استخراج إعتام عدسة العين. تخضع هذه الخلايا لتحول فيزيولوجي مرضي متعدد الأوجه لا يشمل فقط الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) ولكن أيضا تمايز LECs إلى ألياف العدسة ، مما يؤدي إلى عدد الخلايا الذي يتكون من مزيج من LECs والألياف والخلايا الليفية العضلية^11،12،13. تتكاثر الخلايا المحولة وتهاجر عبر كبسولة العدسة الخلفية ، مما يؤدي إلى ضعف البصر. يمكن أن يوفر فهم السلوك وآليات التحكم في LECs في نماذج الاستزراع رؤى قيمة حول الوقاية من PCO وإدارته. لذلك ، يقدم هذا البروتوكول لزراعة LECs أداة حيوية لباحثي طب العيون الذين يهدفون إلى دراسة وفهم ومكافحة هذه المضاعفات السائدة بعد العملية الجراحية في نهاية المطاف.

لكشف تعقيدات بيولوجيا LEC ودورها في تكوين إعتام عدسة العين و PCO ، من الضروري إنشاء أنظمة زراعة خلايا أولية قوية وقابلة للتكرار في المختبر . توفر ثقافة LEC الأولية للباحثين بيئة خاضعة للرقابة لدراسة الوظائف والإشارات والخصائص الجزيئية ل LECs. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بالتحقيق في العمليات الخلوية وتأثيرات الظروف التجريبية المختلفة ، مما يوفر رؤى قيمة في فسيولوجيا العدسة وعلم الأمراض.

لقد أثرت الأبحاث السابقة فهمنا لتقنيات زراعة LEC^{14،15،16،17،18،19،20}. على الرغم من أن هذه الدراسات قد استخدمت منهجيات مختلفة وأسفرت عن نتائج مهمة حول سلوك وخصائص LEC ، إلا أن بروتوكول تسجيل الفيديو الشامل والمتاح لزراعة LECs غائب في الأدبيات الحالية. يمكن أن يعيق هذا القيد قدرة الباحثين المبتدئين على إعادة إنتاج التقنيات بدقة ويمكن أن يؤدي إلى تناقضات واختلافات في النتائج التجريبية. من خلال توفير بروتوكول تسجيل الفيديو ، تهدف هذه الورقة البحثية إلى سد هذه الفجوة وتوفير مورد موحد يمكن أن يعزز قابلية التكاثر ويسهل نقل المعرفة في مجال ثقافة LEC.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب على وفقا لإرشادات جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم منح الموافقة الإجرائية من قبل لجنة رعاية واستخدام بمركز العلوم الصحية بجامعة شمال تكساس (رقم البروتوكول: IACUC-2022-0008). تم استخدام الفئران الصغيرة C57BL / 6J ، عادة أقل من 2 أسابيع من العمر ، في هذه الدراسات.

1. إعداد وسط الثقافة وتشريح العدسة

1. تحضير وسط الاستزراع بإضافة 50 مل من مصل بقري الجنين (FBS) و 0.1 مل من 50 مجم / مل جنتاميسين إلى 450 مل من DMEM.
2. القتل الرحيم إنسانيا C57BL / 6J الفئران الأصغر من 2 أسابيع.
   ملاحظة: قمنا بالقتل الرحيم باستخدام طريقة استنشاق CO₂ . يجب أن يحل معدل التدفق الأمثل لأنظمة القتل الرحيم CO₂ محل 30٪ إلى 70٪ من حجم الغرفة أو القفص / دقيقة.
3. قم بإزالة الجفون برفق باستخدام المقص الجراحي واضغط برفق باستخدام ملاقط منحنية على جوانب متقابلة من محجر العين ، مما يتسبب في بروز العين للخارج. قم بعمل شق دقيق على القرنية باستخدام سكين إعتام عدسة العين واستخرج العدسة بعناية باستخدام ملاقط منحنية ، مما يضمن عدم حدوث أي ضرر للعدسة أو كبسولة.
   ملاحظة: توخ الحذر أثناء تنفيذ هذه الخطوات للحفاظ على سلامة كبسولة العدسة. نظرا للطبيعة الحساسة للعدسة ، من المهم استخدام أدوات التشريح ذات النصائح المنحنية وغير الحادة لتقليل مخاطر تلف العدسة.
4. استخدم ملاقط منحنية ذات أطراف حادة لنقل العدسات إلى طبق زراعة مناديل بلاستيكية مقاس 60 مم مملوء ب 5 مل من محلول المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco المسخن مسبقا والمعقم الذي يحتوي على 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين.
5. اشطف العدسات برفق بمحلول DPBS يحتوي على 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين لإزالة أي حطام أو ملوثات محتملة ، وإعداد العدسات لمزيد من المعالجة ، والحفاظ على بيئة مزرعة معقمة.
6. للحصول على عدد كاف من LECs ، قم بتجميع أربع عدسات للوحة استزراع 24 بئرا وست عدسات للوحة استزراع 6 آبار.

2. عزل LECs

1. بعد الانتهاء من عملية الشطف ، ضع العدسة على قطعة من ورق الترشيح ، واتركها تجف.
2. بمجرد أن تجف العدسة بشكل كاف ، انقلها بعناية إلى غطاء طبق بتري استعدادا لإزالة كبسولة العدسة.
3. قم بتدوير العدسة لأعلى ، مع التأكد من أن الجزء الأمامي متجها لأعلى. أثناء استخدام الملقط لتثبيت الكبسولة الأمامية ، استخدم ملقط المحفظة في اليد المهيمنة لإحداث تمزق صغير في الكبسولة. اسحب الأداتين برفق في اتجاهين متعاكسين لإزالة الكبسولة ووضعها في DPBS حتى تكتمل جميع عمليات تشريح العدسة.
   ملاحظة: لتجنب أي تناقضات ، يجب على الباحثين تشريح كل كبسولة ظهارية للعدسة على الفور وتخزينها مؤقتا في DPBS. فقط بعد الانتهاء من جميع عمليات التشريح يتم نقل الكبسولات بشكل جماعي إلى التربسين عند 37 درجة مئوية ، مما يضمن التعرض المتزامن والموحد.
4. انقل كبسولة العدسة بعناية إلى لوحة ذات 6 آبار. أضف 1 مل من محلول التربسين 0.05٪ إلى كل بئر لبدء عملية الهضم الأنزيمي.
5. حرك محلول التربسين برفق لضمان تغلغل متساو. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا واترك الكبسولة تهضم لمدة 8-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: تسهل هذه الخطوة تكسير أنسجة كبسولة العدسة والإفراج اللاحق للخلايا الظهارية الفردية.
6. بعد الحضانة ، قم بفرم كبسولة العدسة المهضومة بعناية باستخدام مقص تشريح لتكسير أي كتل أنسجة متبقية وتعزيز فصل الخلايا.
   ملاحظة: يتم التأكيد على الدقة في فرم الأنسجة لضمان إطلاق الخلايا بكفاءة من كبسولات العدسة المهضومة.
7. أضف 0.5 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ FBS لإخماد التربسين. نقل عينات الأنسجة إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 5 دقائق.
8. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. استخدم 1 مل من وسط الاستزراع لإعادة تعليق الخلايا وزرع الخلايا في طبق 24 بئرا.
9. قم بتغيير وسط الثقافة كل 2-3 أيام.

3. الثقافة الفرعية LECs

1. بمجرد أن تحقق الخلايا التقاء ، قم بإزالة الوسط من طبق الاستزراع. المضي قدما في غسل الخلايا 2x مع 1 مل من DPBS.
2. أضف 200 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
3. بعد الحضانة ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وفحصها تحت المجهر للتأكد من أنها انفصلت عن طبق الثقافة وبدأت في الطفو.
4. أضف 1 مل من وسط الاستزراع وماصة الخلايا برفق 3-5x لفصل جميع الخلايا.
5. نقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي على حرارة 1000 × غرام لمدة 5 دقائق.
6. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في وسط النمو الكامل.
7. إذا لزم الأمر ، احسب رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
8. قسم تعليق الخلية بنسبة 1: 2 أو 1: 3 لأغراض الاستزراع الفرعي.
9. عندما تصبح الثقافة متقاربة مرة أخرى ، كرر الإجراءات المذكورة أعلاه.
   ملاحظة: تزدهر LECs في ظروف الاستزراع عالية الكثافة. تجنب تمييع الخلايا بشكل مفرط ، لأن هذا قد يعيق نموها.

4. التخزين والشحن

ملاحظة: رقم الخلية المثالي للتخزين هو ~ 1 × 10⁶.

1. اغسل الخلايا جيدا 3x مع 1 مل من DPBS. بعد الغسيل ، أضف 1 مل من محلول التربسين-EDTA وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
2. أضف 2 مل من وسط الاستزراع الكامل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق.
3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسط تجميد يتكون من 90٪ FBS و 10٪ DMSO ، بهدف كثافة خلية تبلغ 1 × 10⁶ خلايا / مل. نقل تعليق الخلية إلى cryovial.
4. انقل الخلايا على الفور إلى بيئة -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، تليها -80 درجة مئوية طوال الليل ، قبل التخزين الدائم في النيتروجين السائل.
   ملاحظة: في حالة عدم توفر النيتروجين السائل ، يمكن تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية بعد ساعة أولية عند -20 درجة مئوية.
5. إذا كانت الشحنة مطلوبة ، فقم بشحن الخلايا الموجودة في cryovial في عبوة بها ثلج جاف للتسليم بين عشية وضحاها.
6. عند استلام الخلايا ، تأكد من الشفاء السريع ووضع الخلايا في الثقافة الفرعية. إذا لم تكن الثقافة الفورية ممكنة ، فقم بنقل الخلايا إلى النيتروجين السائل للتخزين لفترة طويلة.
   ملاحظة: إذا كان سيتم شحن الخلايا ، فتأكد من دفن العينات بعمق في الثلج الجاف لمنع التلف المحتمل من تقلبات درجات الحرارة.

5. التحقق من صحة LECs

1. ضع LECs في أطباق استزراع مقاس 35 مم مع أكواب غطاء واستزراعها لمدة 48 ساعة تقريبا.
2. اغسل الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بتثبيت الخلايا بالميثانول البارد لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية.
3. اغسل الخلايا الثابتة لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا الثابتة بمخزن مؤقت مانع لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد.
4. بعد الانسداد ، احتضان الخلايا طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية (αA-crystallin و γ-crystallin و PROX1) المخففة بشكل فردي بنسبة 1:50 في المخزن المؤقت المخفف.
5. اغسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي المخفف 1: 100 في محلول مخفف لمدة ساعة واحدة.
6. اغسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بتلطيخ الخلايا ب 5 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتصور النوى.
7. اغسل الخلايا لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام PBS لإزالة محلول التلوين الزائد والتقاط صور الفلورسنت للخلايا باستخدام مجهر مضان باستخدام قناة DAPI للنوى وقناة FITC ل αA- و γ-crystallins و PROX1.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 2 ، باتباع هذا البروتوكول ، التصقت LECs الأولية من الفئران C57BL / 6J بالأطباق خلال فترة 4 ساعات. والجدير بالذكر أنه كانت هناك بقايا مرئية لأنسجة أخرى مثل أقسام الكبسولة الخلفية وخلايا ألياف العدسة. ومع ذلك ، فإن هذه العناصر غير المقصودة لم تعلق على الطبق ، وبالتالي يمكن إزالتها عن طريق تغيير وسط الثقافة. وفي وقت لاحق، بين اليومين الثالث والخامس، بدأت اللجان المحلية المحلية مرحلة انتشارها. ويمكن بعد ذلك ملاحظة النمو السريع، الذي يميز مرحلة الانتشار اللوغاريتمي، بين اليومين السابع والعاشر. في الحالات التي لا تتقدم فيها الخلايا إلى مرحلة النمو السريع ، قد يكون من المستحسن دمج مكملات النمو ، مثل EpiCGS-a ، في وسط الثقافة. علاوة على ذلك ، لاحظنا أن الخلايا تظهر معدل نمو أسرع في الوسط الذي يحتوي على 20٪ FBS مقارنة ب 10٪ FBS. عادة ما يعزز تركيز FBS المنخفض نموا أبطأ ، مما يعكس سمات الظهارة المركزية للعدسة ، بينما يكرر تركيز FBS بنسبة 20٪ سمات المنطقة التكاثرية للعدسة.

وفقا ل Reddy et al. و Andley et al. ، الذين طوروا خط الخلايا الظهارية للعدسة البشرية الخالدة B3 ، من المتوقع أن تعبر LECs عن بروتينات مختلفة خاصة بالعدسة مثل αA- و γ-crystallins ^2,21. ومن ثم ، في هذه الدراسة ، استخدمنا بلورات αA و γ كعلامات خلوية للتحقق من هوية الخلايا على أنها LECs. تم استزراع LECs داخل الممرات الثلاثة الأولية على أغطية زجاجية. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية الخاصة ببلورات αA و γ لاحتضان الخلايا بين عشية وضحاها. كما هو موضح في الشكل 3، أظهرت هذه الخلايا تعبيرا قويا عن بلورات ألفا أ و γ، مما يوفر دليلا قاطعا على أنها خلايا طلائية مشتقة من العدسة. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمنا PROX1 كعلامة راسخة لخلايا الألياف لتسمية LECs الأولية. أشارت البيانات إلى أن هذه LECs أظهرت تلطيخا سلبيا ل PROX1 ، مما يؤكد أن هذه الخلايا هي خلايا ظهارية ولم تخضع للتمايز إلى خلايا ليفية بعد.

الشكل 1: سير العمل خطوة بخطوة لثقافة LEC. يوضح الشكل الخطوات المتسلسلة التي ينطوي عليها استزراع الخلايا الطلائية للعدسة الأولية. تتضمن الخطوة 1 إنشاء تمزق صغير في الكبسولة الأمامية. تستلزم الخطوة 2 إزالة كبسولة العدسة برفق. في الخطوة 3 ، يتم نقل كبسولة العدسة بعناية إلى لوحة 24 بئرا وتحضينها بمحلول التربسين 0.05٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، يتم فرم كبسولة العدسة المهضومة باستخدام مقص تشريح لتعزيز فصل الخلايا. تتضمن الخطوة 4 إخماد التربسين بإضافة 0.5 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 20٪ FBS إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي لعينات الأنسجة عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق. تتطلب الخطوة 5 إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط الاستزراع وزرعها في طبق من 24 بئرا. أخيرا ، تتضمن الخطوة 6 تغيير وسائط المزرعة كل 2-3 أيام لدعم نمو الخلايا وصيانتها طوال التجربة. الاختصارات: LECs = الخلايا الظهارية للعدسة. FBS = مصل الجنين البقري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نمط نمو LECs بمرور الوقت. تم تسجيل التغيرات المورفولوجية للخلايا الظهارية للعدسة الأولية في نقاط زمنية مختلفة أثناء نموها تحت مجهر تباين الطور. تصور الصور التي تم التقاطها في الأيام 1 و 2 و 3 و 5 و 7 و 10 مورفولوجيا الخلية المتطورة ، مما يوفر نظرة ثاقبة لتطور وسلوك الخلايا الظهارية للعدسة بمرور الوقت. سهم أحمر يشير إلى موقع الخلايا الظهارية للعدسة المتكاثرة بنشاط. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: LECs = الخلايا الظهارية العدسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: التحقق من صحة LECs. (أ) التلوين المناعي لبلورات ألفا في LECs الفأر. تم تلطيخ mLECs الأولية ب Hoechst 33342 (أزرق) وجسم مضاد بلوري αA (أخضر). (ب) التلوين المناعي لبلورات γ في LECs الفئران. (ج) التلطيخ المناعي ل PROX1 في LECs للفئران. تم تلطيخ mLECs الأولية ب Hoechst 33342 (أزرق) وجسم مضاد PROX1 (أخضر). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار: LECs = الخلايا الظهارية العدسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يوفر البروتوكول المقدم في هذه الورقة دليلا شاملا خطوة بخطوة للعزلة الناجحة والثقافة والثقافة الفرعية للمجتمعات المحلية الأولية ، مع استكمال وثائق الفيديو المصاحبة. يعزز الدليل المرئي المفصل إلى جانب التعليمات المكتوبة وضوح البروتوكول وإمكانية الوصول إليه ، مما يعزز استخدامه وإمكانية استنساخه بين الباحثين في هذا المجال. الهدف النهائي هو المساهمة في توسيع مجموعة المعرفة المحيطة بدور LECs في تكوين إعتام عدسة العين و PCO ، وهي مضاعفات سائدة بعد جراحة إعتام عدسة العين.

عند مقارنة LECs الأولية مع خطوط الخلايا الظهارية للعدسة ، مثل HLE-B3 و SRA01 / 04 ، يقدم كل منها مزايا وتحديات فريدة في سياق البحث. يمثل خط خلايا HLE-B3 ، جنبا إلى جنب مع SRA01 / 04 ، فئة من خطوط الخلايا التي ، على الرغم من سهولة التعامل معها ودائما ، غالبا ما تظهر تغيرات وراثية ومظهرية بسبب تكرارها المستمر وظروف الاستزراع المطولة. يمكن أن يؤدي هذا إلى اختلافات كبيرة عن وظيفة LECs الأصلية ، مما يقلل من صحة ردودهم. وعلى العكس من ذلك ، فإن LECs الأولية ، المعزولة مباشرة عن الأنسجة الحية من المرضى أو الأبحاث ، تعكس بشكل أكثر دقة البيئة الخلوية الطبيعية والاستجابات المتأصلة للعدسة في الجسم الحي. على الرغم من التعقيد الإضافي لاستخراجها وثقافتها ، إلا أنها غالبا ما تكون مفضلة في الدراسات التي تتطلب أهمية فسيولوجية عالية ، لأنها تقدم نتائج أكثر دقة وموثوقية.

يجب مراعاة بعض النقاط الرئيسية أثناء اتباع هذا البروتوكول. تم استخدام الفئران الصغيرة C57BL / 6J ، عادة أقل من 2 أسابيع من العمر ، في هذه الدراسات. لاحظنا أن LECs التي تم حصادها من هذه الفئران الشابة أظهرت نموا أكثر قوة مقارنة ب LECs من الفئران التي تتراوح أعمارها بين 2 أشهر أو أكبر. هذا يشير إلى وجود علاقة سلبية بين عمر الفئران ونمو الخلايا.

يعد تشريح العدسة من عين الفأر مهمة حساسة ، مما يستلزم الاستخدام الدقيق لأدوات التشريح للحفاظ على سلامة العدسة وكبسولةها. يضمن الإجراء الموضح في القسم 1 من البروتوكول استخراج العدسة بنجاح بأقل قدر من الضرر. في حين أن الحفاظ على صحة وسلامة كبسولة العدسة يمثل تحديا ، إلا أنه لا يمكن التقليل من أهميتها لأن أي ضرر يمكن أن يؤثر على جودة وكمية LECs المعزولة. من الجدير بالذكر أن غالبية الانقسامات الخلوية تحدث عادة في المنطقة الإجرائية بالقرب من المنطقة الاستوائية في العدسة ، وهي منطقة لا يمكن الوصول إليها بسهولة للزراعة. وفقا ل Zetterberg et al. ، على الرغم من أن الجزء المركزي من ظهارة العدسة يعرض الحد الأدنى من النشاط الانقسامي في ظل الظروف العادية ، فإن التجارب التي تستخدم وضع العلامات على الثيميدين المثلث (³H-Tdr) قد حددت خلايا ظهارة العدسة ذات الموقع المركزي كخلايا جذعية محتملة^17,22. تظهر الخلايا الجذعية خصائص مميزة ، مثل قدرة الانتشار غير المحدودة على الرغم من انخفاض معدل الانتشار في ظل الظروف القياسية. على هذا النحو ، قد يوفر الجزء المركزي من ظهارة العدسة تمثيلا أفضل للقدرة التكاثرية ل LECs من المنطقة الجرثومية.

يشكل عزل LECs ، كما هو مفصل في قسم البروتوكول 2 ، خطوة محورية في هذا الإجراء التجريبي. يتم تنفيذ الإجراءات المتكاملة بما في ذلك إزالة كبسولة العدسة والهضم الأنزيمي وتفتيت الأنسجة بعناية لفصل الخلايا الظهارية الفردية عن الكبسولة. أحد العناصر الحاسمة في هذه العملية هو مدة هضم التربسين. يوصى بضبط فترة الهضم بين 8 و 10 دقائق. إذا تم تقصير هذه الفترة إلى أقل من 5 دقائق ، فقد يؤدي ذلك إلى فصل غير كامل للخلايا. على العكس من ذلك ، فإن الإفراط في تمديد هذا الإطار الزمني قد يضر بشكل كبير بصلاحية الخلية. إن الخيار الاستراتيجي المتمثل في استخدام التربسين-EDTA ككاشف لتفكك الخلايا ، جنبا إلى جنب مع وسط زراعة DMEM المكمل ب 20٪ FBS و 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، يحسن إطلاق الخلايا وانتشارها لاحقا مع التخفيف من مخاطر التلوث المحتملة.

كثيرا ما تستخدم المضادات الحيوية لمنع التلوث البكتيري خلال مزارع LEC الأولية. ومع ذلك ، ينبغي أن يتم اختيار المضادات الحيوية بعناية. المضادات الحيوية شائعة الاستخدام مثل البنسلين والستربتومايسين ، وكذلك العوامل المضادة للفطريات ، لديها القدرة على التأثير على صلاحية LECs. كبديل ، يوصى باستخدام محلول جنتاميسين بتركيز 10 ميكروغرام / مل لتحقيق النمو الأمثل ل LEC.

علاوة على ذلك ، يعد الحفاظ على كثافة عالية للخلايا عاملا حاسما آخر لنجاح ثقافة LEC الأولية. على عكس خطوط الخلايا الراسخة ، تحتاج LECs الأولية إلى كثافة خلايا أعلى للنمو الأمثل. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى اعتمادها على التواصل الفعال بين الخلايا ، والذي يتم تسهيله عن طريق الاتصال المباشر أو إشارات paracrine ، مما يساعد على الحفاظ على حالة تمايزها ووظيفتها. تخفف كثافة الخلايا العالية أيضا من الآثار الضارة ل "صدمة الثقافة" ، وهي حالة تعاني منها الخلايا الأولية عند عزلها ووضعها في بيئة مخبرية تختلف اختلافا كبيرا عن أصلها في الجسم الحي ²³. من خلال محاكاة بيئة أكثر شبها بالجسم الحي ، تزيد كثافة الخلايا العالية من معدلات البقاء على قيد الحياة. بالإضافة إلى ذلك ، تساعد هذه الكثافة في إنشاء تدرج تركيز لعوامل النمو والسيتوكينات التي تدعم نمو الخلايا ووظيفتها. بالنظر إلى أن العديد من الخلايا الأولية تعتمد على المرسى ، وتتطلب ارتباطا سطحيا للتكاثر ، فإن كثافة الخلايا العالية توفر عددا كافيا من الخلايا المجاورة للالتصاق ، وبالتالي تعزيز النمو الصحي. وبالتالي ، فإن تنظيم كثافة الخلايا هو اعتبار حاسم في زراعة الخلايا الأولية نظرا لتأثيرها الكبير على اتصال الخلية وبقائها وتكاثرها. يوصى باختيار أطباق الاستزراع الأصغر ، مثل أطباق 24 بئرا أو 6 آبار ، لخلق بيئة مثالية ل LECs. يؤدي اتباع هذا البروتوكول عادة إلى وصول LECs إلى حالة التقاء ~ 10-14 يوما بعد الزراعة. نوصي باستخدام LECs في عدد قليل من المقاطع ، من الناحية المثالية بين P0 و P6 ، لضمان السلوك الأكثر طبيعية في التجارب. بعد 7-10 ممرات ، قد تظهر LECs نموا متناقصا وقد لا تتفاعل مع الظروف التجريبية بنفس الطريقة التي تتفاعل بها الخلايا في الممرات السفلية.

يرتبط تركيز المصل مباشرة بمعدل نمو الخلايا. من المرجح أن تؤدي المستويات المنخفضة من FBS إلى نمو أبطأ ، يشبه خصائص الظهارة المركزية. في المقابل ، تحاكي مستويات FBS الأعلى ظروف المنطقة التكاثرية. إذا كان نمو الخلايا بطيئا ، كما قد يحدث عندما تحتاج LECs إلى عزلها عن الأكبر سنا أو المعدلة وراثيا ، فقد يكون من المفيد زيادة FBS إلى 20٪ أو إضافة مكمل نمو مثل EpiCGS-a (5 مل ، انظر جدول المواد) إلى وسط الاستزراع. يمكن أن يعزز هذا التخصيب بالمصل والمكملات تكاثر الخلايا ويعزز النمو الأمثل للخلايا الظهارية.

ينظر بروتوكول التخزين والشحن (قسم البروتوكول 5) في التحديات المرتبطة بحفظ الخلايا الحية ونقلها. يعد اختيار وسط التجميد أمرا بالغ الأهمية لبقاء LECs أثناء التخزين والنقل. لقد جربنا وسائط تجميد مختلفة ، بما في ذلك 70٪ وسط استزراع كامل + 20٪ FBS + 10٪ DMSO ؛ 90٪ FBS + 10٪ DMSO ؛ ووسط تجميد خال من DMSO والمصل. تشير الأدلة من تجاربنا إلى أن الحل الذي يتكون من 10٪ DMSO و 90٪ FBS يظهر أداء فائقا في الحفاظ على صلاحية الخلية. وباستخدام هذه التركيبة المحددة، نجحنا في الحفاظ على LECs الأولية في التخزين عند -80 درجة مئوية لفترات تتجاوز 10 سنوات، مما يدل على متانة هذا النهج وقدرته على تسهيل إحياء الخلايا بعد التخزين.

تم استخدام αA-crystallin و γ-crystallin كعلامات ل LECs. تم استخدام PROX1 كعلامة لخلايا ألياف العدسة. يمكن أيضا استخدام علامات إضافية مثل PAX6 و FOXE3 و E-cadherin لتوصيف النمط الظاهري LEC. إذا كان الباحثون مهتمين باستكشاف EMT ، فيجب استخدام αSMA كعلامة. من الضروري ضبط أوقات الحضانة والتخفيفات وفقا للمتطلبات المحددة للتجربة والتوصيات المقدمة للأجسام المضادة المستخدمة المعنية.

وفي حين أن هذه الدراسة تقدم منهجية قوية لاستزراع المجتمعات المحلية الأولية، فمن المهم الاعتراف بحدودها. في حين أن الخلايا المعزولة في البداية هي LECs أولية ، فإن أي إجراءات للاستزراع الفرعي ، والتربسين ، والإنعاش ستؤدي إلى تغييرات في حالتها. يستخدم البروتوكول الذي صممناه في المقام الأول عدسة الماوس كمصدر ل LECs. ومع ذلك ، يمكن أيضا استزراع LECs من موارد أخرى ، بما في ذلك عينات مرضى إعتام عدسة العين ، أو عيون بنك العيون ، أو المرضى الذين يعانون من أمراض العين المختلفة بما في ذلك الجلوكوما واعتلال الشبكية السكري^17،24. قد لا تمتثل LECs التي يتم حصادها من الأفراد الأكبر سنا أو أولئك الذين يعانون من حالات معينة في العين للبروتوكول بنفس فعالية الخلايا من نظرائهم الأصغر سنا والأكثر صحة. قد يتطلب استزراع LECs من الأفراد أو الأكبر سنا أو المعدلة وراثيا تحسين وسط الاستزراع ، ربما عن طريق زيادة FBS إلى 20٪ أو دمج عوامل نمو إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة التي أجراها Menko et al. ، والتي أجريت على مزارع الخلايا الظهارية لعدسة الفرخ الجنينية الأولية ، تمايزا تلقائيا يحدث بعد اليوم الثاني من الثقافة²⁵. لذلك ، يجب على الباحثين توخي الحذر والنظر في الاختلافات في المنهجيات ، خاصة إذا كانت دراسة التمايز هي هدفهم البحثي الرئيسي.

يمكن استخدام طرق مختلفة لثقافة LECs الأولية. على سبيل المثال ، تتضمن الطرق التي طورها Ibaraki et al. و Sundelin et al. و Andjelic et al. ، زراعة LECs الأولية مباشرة على طبق بتري باستخدام الجزء الأمامي من كبسولة العدسة التي تم جمعها أثناء جراحة إعتام عدسة العين^{16،17،19،20}. يحافظ هذا النهج على الاتصالات الطبيعية من خلية إلى خلية والمصفوفة خارج الخلية ، مما يوفر أهمية فسيولوجية عالية حاسمة لظروف مثل PCO. بدلا من ذلك ، تحافظ طريقة زرع العدسة ، مثل التي حددها Zelenka et al. على بنية الأنسجة الأصلية ، مما يسمح بإجراء دراسات أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية ، وهي مفيدة بشكل خاص لاستكشاف التمايز النهائي ل LECs ، والتفاعلات الخلوية ، وعمليات تطوير العدسة ، مما يمنح فهما مفصلا للأحداث الخلوية والجزيئية المتسلسلة أثناء التمايز²⁶.

في المقابل ، تنتج طريقة التربسين الموصوفة في هذا البروتوكول تعليقا موحدا أحادي الخلية ، مما يبسط البذر الموحد وعد الخلايا بدقة ، وهو أمر مفيد لبعض التجارب مثل فحوصات صلاحية الخلية وانتشارها ، وفحص الأدوية ، وتحليل مسار إشارات الخلية. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان أن ندرك أنه في حين أن هذه الطريقة تسهل الدراسات الخاضعة للرقابة والدقيقة بسبب عدد الخلايا الموحد ، إلا أنها قد تغير السلوك الخلوي وتعرض للخطر الأهمية الفسيولوجية التي شوهدت في طرق الزرع والزراعة المباشرة بسبب المعالجة الأنزيمية. بالنسبة للباحثين الذين يركزون حصريا على دراسة الخلايا الظهارية ، تثبت هذه الطريقة أنها قابلة للتطبيق ومريحة للغاية ، مما يوفر رؤى يمكن الاعتماد عليها حول خصائص وسلوكيات هذه الخلايا. ومع ذلك ، بالنسبة لأولئك الذين تمتد استفساراتهم العلمية إلى التمايز الخلوي ، يصبح من الضروري التفكير في طرق بديلة مثل تقنيات الزرع ، أو تكييف وتحسين الطريقة الحالية لتشمل هذه الجوانب.

وعموما، تم تصميم هذا البروتوكول مع مراعاة متأنية للاحتياجات والمتطلبات المحددة للمراكز المحلية للاقتصادات المحلية. كل خطوة ، من التشريح إلى التحقق من الصحة ، مصممة بعناية للحفاظ على صلاحية الخلايا ووظائفها. نتيجة لذلك ، يمكن أن يكون دليلا قيما للباحثين الذين يدرسون LECs ودورها في فسيولوجيا العين وعلم الأمراض. يمكن للدراسات المستقبلية تكييف وتعديل هذا البروتوكول لاستكشاف جوانب مختلفة من بيولوجيا LEC ، مما يوفر منصة لمزيد من التقدم في فهم الأمراض المرتبطة بالعدسات وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة للوقاية من إعتام عدسة العين و PCO.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.05٪ Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	# 25300054	لتفكك LECs
Alexa Fluor 488 الجسم المضاد الثانوي   ؛	Jackson ImmunoResearch	# 715-545-150	للتحقق من صحة الخلايا
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	للتحقق من صحة الخلايا
المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة	Licor	# 927-60001	للتحقق من صحة الخلية
سكين أمان القندس	Beaver-Visitec International	# 3782235	لتشريح
العدسةحجب العازلة	Licor	# 927-60001	للتحقق من صحة الخلية
ملقط Capsulorhexis	Titan Medical Instruments	TMF-124	لعزل كبسولة العدسة
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	لثقافة LECs
المتوسطة DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	لصنع وسط التجميد   ؛
دولبيكو محلول ملحي مخزن فوسفات من دولبيكو	ثيرمو فيشر	#J67802	لتشريح العدسة
ملاقط دومون	روبوز الجراحية الأداة	RS-4976	لعزل كبسولة العدسة
EpiCGS-a (اختياري)	ScienCell	4182	لثقافة LECs المتوسطة
FBS	Sigma Aldrich	F2442	لثقافة LECs متوسطة
Gentamicin (50   ملغ / مل)	Sigma-Aldrich	G1397	لثقافة LECs متوسطة
Hoechst 33342 محلول	Thermo Fisher	# 62249	للتحقق من صحة الخلية
مقص التشريح الدقيق	Roboz Surgical Instrument   ؛	RS-5983	لتشريح العدسة
ملاقط التشريح الدقيقة	Roboz Surgical Instrument	RS5137	لتشريح العدسة
الجسم المضاد PROX1	Thermo Fisher	11067-2-AP	للتحقق من صحة الخلية
Vannas مقص زنبركي	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	لعزل كبسولة العدسة
&alpha ؛ الجسم المضاد البلوري	A- سانتا كروز	sc-28306	للتحقق من صحة الخلية   ;
& جاما ؛ - البلورية الجسم المضاد	سانتا كروز	sc-365256	للتحقق من صحة الخلية