مقالة منهجية

المقاصة البصرية ووضع العلامات للفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية في تصوير الدماغ البشري على نطاق واسع

DOI:

10.3791/65960

⸱

يناير 26, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, 2Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Department of Physics, University of Pisa, 4National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), 5Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 6Department of Biology, University of Florence

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول الحالي إجراء خطوة بخطوة للمسح البصري السريع والمتزامن ، ووضع العلامات المستديرة المعطية ، وإعادة البناء الحجمي ثلاثي الأبعاد لعشرات أقسام الدماغ البشري بعد الوفاة من خلال الجمع بين تقنية تحويل الأنسجة القصيرة (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2،2'-thiodiethanol [TDE]) مع التصوير المجهري الفلوري للصفائح الضوئية في بروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من العديد من تقنيات التطهير التي ظهرت في العقد الماضي ، لا تزال معالجة أدمغة البشر بعد الوفاة مهمة صعبة بسبب أبعادها وتعقيدها ، مما يجعل التصوير بدقة ميكرومتر صعبا بشكل خاص. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإجراء إعادة بناء الأجزاء الحجمية من الدماغ البشري عن طريق معالجة عشرات الأقسام في وقت واحد باستخدام بروتوكول تحويل الأنسجة SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2،2'-thiodiethanol [TDE]) ، والذي يتيح التطهير ووضع العلامات والتصوير المتسلسل للعينات باستخدام المجهر الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM). يوفر SHORT إزالة الأنسجة بسرعة ووضع علامات متعددة متجانسة للشرائح السميكة مع العديد من العلامات العصبية ، مما يتيح تحديد مجموعات فرعية عصبية مختلفة في كل من المادة البيضاء والرمادية. بعد المقاصة ، يتم تصوير الشرائح عبر LSFM بدقة ميكرومتر وفي قنوات متعددة في وقت واحد لإعادة بناء 3D سريعة. من خلال الجمع بين تحليل SHORT و LSFM ضمن بروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني ، من الممكن الحصول على إعادة بناء العمارة الخلوية 3D للمناطق الحجمية الكبيرة بدقة عالية في وقت قصير ، وبالتالي تمكين التوصيف الهيكلي الشامل للدماغ البشري.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تحليل التنظيم الجزيئي 3D والهندسة الخلوية لكميات كبيرة من الدماغ البشري شفافية بصرية للعينات ، يتم تحقيقها من خلال بروتوكولات ذات وقت معالجة مكثف. تم تطوير تقنيات المسح البصري لتقليل عدم التجانس في معامل الانكسار (RI) داخل الأنسجة ، وبالتالي تقليل تشتت الضوء وزيادة عمق اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة1،2،3،4،5. تسمح التطورات الحالية في طرق التطهير ووضع العلامات على الأنسجة العميقة بالتصوير الحجمي لأعضاء القوارض والأجنة السليمة من خلال استغلال تقنيات الفحص المجهري المتطورة6،7،8،9،10،11،12.

ومع ذلك ، لا تزال إعادة البناء الحجمي 3D لمناطق واسعة من الدماغ البشري بعد الوفاة تمثل مهمة صعبة مقارنة بالكائنات الحية النموذجية. يمكن أن يؤدي التركيب البيولوجي المعقد وظروف التثبيت والتخزين المتغيرة بعد الوفاة إلى الإضرار بكفاءة إزالة الأنسجة وعمق اختراق الأجسام المضادة والتعرف على الحواتم13،14،15،16،17،18،19. علاوة على ذلك ، لا يزال هناك حاجة إلى تقسيم الأنسجة الميكانيكية والتطهير ووضع العلامات اللاحقة لكل شريحة لتحقيق تطهير فعال ووضع علامات موحدة على مناطق الدماغ البشري الكبيرة ، مما يؤدي إلى أوقات معالجة طويلة والحاجة إلى معدات مخصصة متطورة ، مقارنة بالكائنات النموذجية15،20،21،22.

تم تطوير تقنية تحويل الأنسجة SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) خصيصا لتحليل كميات كبيرة من الدماغ البشري18,23. تستخدم هذه الطريقة الحفاظ على بنية الأنسجة لبروتوكول SWITCH11 وتركيزات عالية من هيدروجين البيروكسيد لتقليل التألق الذاتي للأنسجة ، بالاقتران مع ترميم الحاتمة. يسمح SHORT بتلطيخ موحد لشرائح الدماغ البشري مع علامات لأنواع فرعية مختلفة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية والأوعية الدموية والألياف الميالينية18,24. نتائجه متوافقة مع تحليل كل من البروتينات منخفضة وعالية الكثافة. تتيح مستويات الشفافية العالية الناتجة ووضع العلامات الموحدة إعادة البناء الحجمي للشرائح السميكة باستخدام المجهر الفلوري ، على وجه الخصوص ، من أجل الحصول السريع على جهاز الصفيحة الخفيفة الذي يمكن استخدامه18،24،25،26،27.

في هذا العمل ، نصف كيف يمكن استخدام تقنية تحويل الأنسجة القصيرة للتطهير المتزامن ووضع العلامات متعددة الجولات لعشرات أقسام الدماغ البشري الثابتة بالفورمالين. يمكن استخدام أربع علامات فلورية مختلفة معا ، مما يؤدي إلى تحديد مجموعات فرعية خلوية مختلفة. بعد التطهير ، يمكن إجراء التصوير الحجمي عالي الدقة باستخدام الفحص المجهري الفلوري. هنا ، استخدمنا LSFM المقلوب حسب الطلب18،24،25،26،27 ، والذي يتيح التقسيم البصري السريع للعينة والاستحواذ السريع على قنوات متعددة بالتوازي. مع هذا البروتوكول عالي الإنتاجية بشكل روتيني ، من الممكن الحصول على توصيف خلوي وهيدي شامل مع دقة خلوية فرعية لمناطق واسعة من الدماغ البشري كما هو موضح بالفعل في رسم خرائط منطقة بروكابأكملها 23.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير عينات الأنسجة البشرية الثابتة بالفورمالين من قبل قسم علم الأمراض العصبية في خدمة تشريح الجثة بمستشفى ماساتشوستس العام (MGH) (بوسطن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على موافقة خطية من المشاركين الأصحاء قبل الوفاة ، وفقا لبروتوكولات جمع الأنسجة المعتمدة من IRB من لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية للشركاء (PIBC ، البروتوكول 2003P001937). يتم الاحتفاظ بوثائق التفويض مع خدمات تشريح الجثة MGH في بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة ، وهي متاحة عند الطلب.

1. تضمين الأغاروز وقطع العينات

  1. قم بإعداد محلول أغاروز 4٪ w / v في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS ، درجة الحموضة 7.4) في دورق وقم بتضمين كتلة الأنسجة بالداخل. انتظر حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ثم قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. للحصول على أقسام عالية الدقة ، قم بلصق العينة على قرص عينة الاهتزاز واملأ الدرج ب 1x PBS بارد (درجة الحموضة 7.4). اضبط معلمات الاهتزاز مثل التردد والسعة والسرعة وفقا لنوع الأنسجة المراد تقطيعها (القيم المستخدمة: التردد = 5 (50 هرتز) ؛ السعة = 0.4 ؛ السرعة = 3 (0.15 مم / ثانية).
    ملاحظة: يجب استخدام اهتزازات مختلفة اعتمادا على حجم العينة. بالنسبة للعينات التي يبلغ حجمها الأقصى 70 × 40 × 15 مم ، يمكن استخدام اهتزاز (على سبيل المثال ، Leica VT1000 S) ؛ بالنسبة للعينات الأكبر حجما ، من الممكن استخدام ضغط (على سبيل المثال ، VF-900-0Z Microtome18) أو جهاز مخصص21. هنا ، نقدم شرائح مقطوعة بسمك 400 ميكرومتر أو 500 ميكرومتر.
  3. بعد القطع ، ضع جميع الشرائح في محلول حافظة يتكون من 1x PBS (درجة الحموضة 7.4) مع 0.01٪ وزن / v أزيد الصوديوم (NaN3) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: قبل التضمين ، انتظر حتى يصل محلول الأغاروز إلى 37 درجة مئوية. قد تؤدي درجة الحرارة المرتفعة إلى تلف العينة. يوصى بعدم ترك العينات في PFA لأكثر من 48 ساعة لأن التثبيت المطول قد يتداخل مع إجراء وضع العلامات عن طريق إتلاف المستضدات وزيادة التألق الذاتي للأنسجة. لتخزين الأنسجة البشرية على المدى الطويل ، يتم استخدام PBS مع NaN3 لمنع التلوث الميكروبي. بسبب سمية NaN3 ، قم بإعداد محلول الحافظة تحت غطاء كيميائي.

2. تثبيت الأنسجة

ملاحظة: يتم إعداد جميع المحاليل المستخدمة في البروتوكول التالي بكميات كبيرة ، كافية لمعالجة جميع شرائح نفس كتلة الأنسجة وتقليل التباين التقني وتقليل الوقت اللازم للخطوات الفردية.

  1. قم بإعداد محلول إيقاف التشغيل باستخدام 50٪ v / v 1x PBS pH 3 ، 25٪ v / v 0.1 M حمض الهيدروكلوريك (HCl) ، 25٪ v / v 0.1 M فثالات هيدروجين البوتاسيوم (KHP) ، و 4٪ v / v glutaraldehyde طازج. ضع جميع العينات في أطباق ذات أغطية لولبية (70 × 23 مم) واحتضانها بمحلول Switch-off مع اهتزاز لطيف عند 4 °C لمدة 1 يوم ، وحمايتها من الضوء بورق الألمنيوم.
  2. قم بإعداد محلول التبديل باستخدام 1x PBS (درجة الحموضة 7.4) و 1٪ v / v glutaraldehyde طازج. ضع جميع العينات في أطباق جديدة واحتضانها بمحلول Switch-on مع اهتزاز لطيف عند 4 °C لمدة 1 يوم ، وحمايتها من الضوء بورق الألمنيوم.
    ملاحظة: نظرا للسمية العالية وحساسية الضوء للجلوتارالدهيد ، يجب دائما تحضير كل من محاليل إيقاف التشغيل والتشغيل طازجة وحفظها تحت الغطاء الكيميائي على الجليد. املأ الطبق دائما ب 20 مل من كل محلول وختمه بالأغشية.

3. التعطيل والمقاصة

ملاحظة: يجب تعطيل الجلوتارالدهيد التفاعلي في العينات عن طريق الحضانة بمحلول تعطيل يتكون من 1x PBS pH 7.4 ، 4٪ w / v acetamide ، 4٪ w / v glycine ، pH 9.0. يمكن تخزين المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. لإزالة الدهون وجعل الأنسجة شفافة ، نستخدم محلول المقاصة الذي يتكون من 200 مللي متر كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 20 مللي متر كبريتيت الصوديوم (Na2SO3) ، و 20 mM حمض البوريك (H3BO3) ، درجة الحموضة 9.0. يجب تخزين المحلول في RT حيث يترسب SDS عند 4 درجات مئوية. سيتم تنفيذ جميع الخطوات التالية في أنابيب مملوءة بالمحلول.

  1. انقل العينات من الأطباق إلى الأنابيب واغسلها لمدة 3 × 2 ساعة مع 1x PBS pH 7.4 في RT في اهتزاز لطيف.
    ملاحظة: بالنسبة للخطوة 3.1 ، من الضروري العمل تحت الغطاء الكيميائي بسبب سمية الجلوتارالدهيد. الأسيتاميد ، SDS ، وحمض البوريك هي أيضا كواشف سامة ، ويجب التعامل معها تحت غطاء كيميائي. املأ الأنبوب دائما ب 50 مل من كل محلول.
  2. احتضان العينات في محلول التعطيل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي طوال الليل (o / n).
  3. يغسل لمدة 3 × 2 ساعة في 1x PBS درجة الحموضة 7.4 في RT في هز لطيف.
  4. احتضان العينات في محلول التطهير عند 55 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 3-7 أيام. تغيير الحل كل يومين (الجدول 1).

4. وضع العلامات المناعية

ملاحظة: قبل خطوة وضع العلامات ، من الضروري إزالة SDS المتبقي ، وتقليل التألق الذاتي ، وكشف الحواتم بمحلول استرجاع مستضد يتكون من قاعدة Tris 10 mM ، و 1 mM EDTA ، و 0.05٪ v / v Tween 20 ، pH 9. تم تحسين الرقم الهيدروجيني للمحلول البالغ 9 لعملية استرجاع فعالة. تعمل قاعدة Tris كعامل تخزين مؤقت للحفاظ على بيئة درجة الحموضة المستقرة ؛ EDTA ، وهو عامل مخلب ، يعزز إمكانية الوصول إلى المستضد. يساعد المنظف غير الأيوني Tween 20 في تحسين نفاذية الأنسجة. يمكن تخزين هذا المحلول عند 4 درجات مئوية. من المهم ملاحظة أن بيروكسيد الهيدروجين جنبا إلى جنب مع خطوة استرجاع المستضد لها تأثير تآزري في تقليل إشارة التألق الذاتي ، عن طريق تحطيم و / أو تعديل الفلوروفورات الداخلية المسؤولة عن إشارة الخلفية غير المحددة (مثل ليبوفوسين).

  1. قم بإعداد 1x PBS مع 0.1٪ v / v Triton X-100 (PBST) ، وقم بتسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، واغسل العينات 3 × 3 ساعات خلال النهار في رج لطيف عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. اترك آخر غسلة o / n.
    ملاحظة: قم بتخزين محلول مخزون PBST عند 4 درجات مئوية. من الضروري إزالة SDS من الأنسجة لأنها يمكن أن تشكل رواسب غير قابلة للذوبان في درجات حرارة منخفضة قد تتداخل مع عمليات الاستحواذ اللاحقة.
  2. في اليوم التالي ، أضف 10 مل من 30٪ v / v بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) إلى كل عينة واتركها مع رج لطيف في RT لمدة 45 دقيقة.
  3. اغسل 3 × 10 دقائق مع 1x PBS (درجة الحموضة 7.4) مع اهتزاز لطيف في RT.
  4. سخن محلول استرجاع المستضد عند 95 درجة مئوية في حمام مائي ؛ انقل العينات إلى المحلول الساخن واتركها على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. اترك العينات لتبرد إلى RT لمدة 40 دقيقة في اهتزاز لطيف.
  6. اغسل 3 × 5 دقائق بالماء منزوع الأيونات في رج لطيف.
  7. موازنة العينات في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
  8. قم بإعداد محلول أجسام مضادة جديد مصنوع من PBST مع 0.01٪ وزن / وزن NaN3 (انظر الملاحظة للخطوة 1.3) وأضف الأجسام المضادة الأولية. احتضان العينات بالمحلول في أطباق ذات أغطية لولبية عند 37 درجة مئوية لمدة n أيام (1-7) في حاضنة مع اهتزاز لطيف وحماية من الضوء (الجدول 2).
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على الحجم والسمك (الجدول 1 والجدول 2).
  9. بعد n أيام ، انقل العينات إلى أنابيب واغسلها 3 × 2 ساعة باستخدام PBST المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف في الحاضنة.
  10. أضف الأجسام المضادة الثانوية في PBST مع 0.01٪ وزن / وزن NaN3 واحتضان العينات في أطباق جديدة بأغطية لولبية عند 37 درجة مئوية لمدة n أيام (1-6) في حاضنة مع اهتزاز لطيف ومحمية من الضوء (الجدول 1 والجدول 2).
  11. بعد n أيام ، انقل العينات إلى أنابيب واغسلها 3 × 3 ساعات خلال اليوم باستخدام PBST المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز لطيفة. اترك آخر غسلة o / n.
    ملاحظة: نظرا لأن Triton X-100 و Tween 20 لزجان ، فإن الماصة ببطء للسماح للطرف بالملء. املأ الأنبوب دائما ب 50 مل من كل محلول. استخدم 10 مل من محاليل الأجسام المضادة لكل عينة وأغلق الطبق بالبارافيلم لمنع تبخر المحلول. نظرا لأن محاليل الأجسام المضادة تحتوي على NaN3 ، فيمكن تخزينها عند 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها لتسمية عينات جديدة في غضون 2 أسابيع.

5. مطابقة معامل الانكسار

ملاحظة: لتحقيق مستوى عال من الشفافية ، من الضروري تجانس معامل انكسار الأنسجة. هنا نستخدم 2،2'-ثيوديثانول (TDE) مخفف في 1x PBS. يجب تخزين حلول TDE في RT.

  1. انقل العينات إلى أطباق جديدة ، وأضف 30٪ v / v TDE ، واتركها لمدة 4 ساعات مع اهتزاز لطيف في RT.
  2. قم بإزالة محلول 30٪ v / v TDE ، وأضف 68٪ v / v TDE إلى العينات ، واتركها مع اهتزاز لطيف في RT.
    ملاحظة: نظرا لأن TDE لزج ، فإن الماصة ببطء للسماح للطرف بالملء. استنشاق بخار TDE أو الضباب يمكن أن يهيج الجهاز التنفسي. لذلك ، ينصح بالعمل في منطقة جيدة التهوية أو استخدام أغطية الدخان لتقليل التعرض. يجب تخزين حلول TDE في RT. استخدم 10 مل من حلول TDE لكل عينة.

6. تركيب العينة

ملاحظة: لتسهيل تركيب العينة والحصول على صورة LSFM ، نستخدم حامل عينة مختوم ومصنوع خصيصا (يسمى "شطيرة") ، والذي يتكون من ثلاثة أجزاء: شريحة مجهر ، وفاصل ، وغطاء غطاء.

  1. ضع الفاصل الفولاذي (56 × 56 × 0.5 مم3) فوق شريحة المجهر (60 × 60 × 1 مم3) وضع العينة على شريحة الفحص المجهري.
  2. ضع غطاء الكوارتز بعناية (60 × 60 × 0.5 مم3) ، وقم بقص كل شيء معا ، وقم بإعداد غراء سيليكون مكون من عنصرين بنسبة 1: 1. استخدم غطاء كوارتز لمطابقة معامل الانكسار وتقليل الانحراف البصري أثناء عملية الاستحواذ.
  3. باستخدام حقنة سعة 1 مل ، املأ الفراغ بين الفاصل وغطاء الغطاء بغراء سيليكون مكون من عنصرين واتركه يجف لمدة 10 دقائق.
  4. قم بإزالة المشابك واستخدم إبرة صغيرة لملء الساندويتش بالكامل ببطء بنسبة 68٪ v / v TDE.
  5. اصنع غراء طازجا وختم الساندويتش.
    ملاحظة: إذا وصل TDE عن طريق الخطأ إلى الفاصل في الخطوة 6.1 ، فلن يعالج الغراء. تأكد من عدم تشكل فقاعات هواء أثناء الخطوة 6.2.

7. تجريد

ملاحظة: يسمح الحفظ الهيكلي وإمكانية الوصول المحسنة إلى SHORT بوضع علامات متعددة الجولات على الشرائح عن طريق إزالة الأجسام المضادة وإعادة تلطيخ العينات بعلامات أخرى.

  1. افتح الساندويتش بشفرة ، ضع العينات في أطباق جديدة بأغطية لولبية مملوءة بنسبة 30٪ v / v TDE ، واتركها لمدة 3 ساعات.
  2. انقل العينات إلى الأنابيب ، واغسلها لمدة 3 × 2 ساعة في 1x PBS (درجة الحموضة 7.4) في RT مع اهتزاز لطيف ، واترك آخر غسلة o / n.
  3. ضع العينات في محلول التطهير في حمام مائي على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
  4. يغسل لمدة 3 × 2 ساعة في 1x PBST (درجة الحموضة 7.4) عند 37 درجة مئوية في رج لطيف ويترك آخر غسلة o / n. الآن العينة جاهزة للتسمية مرة أخرى بدءا من الخطوة 4.8.
    ملاحظة: املأ الأنبوب دائما ب 50 مل من كل محلول. استخدم 10 مل من محلول TDE لكل عينة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح البروتوكول الموصوف هنا المعالجة المتزامنة لشرائح متعددة ، يتراوح سمكها من 100 ميكرومتر إلى 500 ميكرومتر ، باستخدام طريقة SHORT. هذا النهج يقلل بشكل كبير من وقت المعالجة الإجمالي للإجراء بأكمله. في هذا العمل ، نقدم وصفا شاملا لخط الأنابيب بأكمله (الشكل 1) لمعالجة أقسام سميكة متعددة من الدماغ البشري بعد الوفاة في وقت واحد ونوضح البروتوكول على 24 شريحة في وقت واحد (الشكل 2 أ). تتراوح مدة الإزالة ووضع العلامات المشتركة من 11 إلى 30 يوما ، مع مراعاة حجم العينات وسمكها (الجدول 1) ، باستثناء التصوير ومعالجة ما بعد التصوير. بعد إزالة الدهون ومطابقة معامل الانكسار في TDE ، يتم تحقيق الشفافية المثلى والمتجانسة لجميع شرائح الأنسجة في كل من المادة الرمادية والبيضاء (الشكل 2B).

يمكن إجراء التقاط الصور باستخدام مجاهر مضان متقدمة مختلفة ، بما في ذلك المجهر25 متحد البؤر والمجهر ثنائي الفوتون14. هنا ، استخدمنا LSFM18,23 مقلوبا حسب الطلب ومزودا بأربعة خطوط ليزر إثارة: 405 نانومتر ، 488 نانومتر ، 561 نانومتر ، و 638 نانومتر ، قادرة على الحصول على أربع ميزات بيولوجية مختلفة موسومة بأجسام مضادة مترافقة بالفلوروفور. يوضح الشكل 3 أ صورا تمثيلية لشريحة بسمك 400 ميكرومتر من منطقة بروكا البشرية التي تحمل علامة مشتركة ل NeuN ، وهي علامة عصبية شاملة ، سوماتوستاتين (SST) ، وكالريتينين (CR) ، والتي تسمي مجموعتين فرعيتين مختلفتين من الخلايا العصبية الداخلية والعلامة النووية DAPI (الشكل 3A ، B). في البلاطة السميكة التي يبلغ سمكها 400 ميكرومتر ، لاحظنا أن التألق العالمي على طول Z لا يقتصر على السطح ، ولكنه موحد تقريبا في جميع أنحاء عمق الأنسجة ، على الرغم من أن شدة الإشارة تنخفض قليلا في المنتصف (الشكل 3C).

لتحقيق توصيف خلوي أكثر شمولا لأنسجة المخ البشري ، من الممكن إجراء وضع علامات متعددة الجولات لنفس العينات عن طريق تجريد الأجسام المضادة وإعادة تسمية العينة كما هو موضح في ورقة SHORT الأصلية. يوضح الشكل 4 (مقتبس من Pesce et al.18) التطبيق المحتمل لسبعة أجسام مضادة مختلفة على شريحة أنسجة بسمك 500 ميكرومتر تمت معالجتها باستخدام SHORT في ثلاث جولات متتالية من التلوين المناعي. تشمل الأجسام المضادة المستخدمة NeuN و SST و CR و Parvalbumin (PV) والببتيد المعوي النشط في الأوعية (VIP) كعلامات عصبية مثبطة ، والبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) للخلايا الدبقية ، و vimentin (VIM) للأوعية الدموية (الجدول 2). تظهر النتائج القدرة الرائعة ل SHORT على الحفاظ على معلومات الأنسجة خلال إجراءات التجريد المختلفة ، وتقليل إشارات التألق الذاتي بشكل فعال ، وتحقيق إزالة فعالة للعينات.

figure-results-1
الشكل 1: الجدول الزمني ل SHORT. مخطط يمثل الخطوات المطلوبة لمعالجة العينات باستخدام بروتوكول SHORT. في كل خطوة ، تتم معالجة عشرات ألواح أنسجة المخ البشري معا. بعد التضمين في الأغاروز والتقطيع ، يتم وضع العينات في حلول التشغيل والإيقاف لمدة 1 يوم لكل منهما ؛ يتم تنفيذ خطوات التعطيل بين عشية وضحاها بينما تتطلب إزالة الدهون من خلال الحضانة في محلول المقاصة 3-7 أيام. بعد ذلك ، يتم تحضين العينات بمحاليل الأجسام المضادة الأولية والثانوية لمدة أقصاها 7 و 6 أيام ، على التوالي. بعد مطابقة معامل الانكسار ، يتم تركيب العينات في حامل العينة (شطيرة) لتصوير LSFM وتخزينه. في أي وقت بعد تجميع الساندويتش ، يمكن تجريد العينات وإعادة تسميتها للكشف عن علامات مختلفة. الاختصارات: TDE = 2,2'-ثيوديثانول ؛ SHORT = SWITCH - H2O2 - مستضد Retrieval -TDE ؛ o / n = بين عشية وضحاها ؛ RI = معامل الانكسار ؛ LSFM = المجهر الفلوري للصفائح الخفيفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: شرائح دماغ الإنسان من كتلة منطقة بروكا معالجة في وقت واحد. (أ) أربع وعشرون شريحة متتالية من منطقة بروكا 4 × 4 × 0.04 سم3 في برنامج تلفزيوني قبل المعالجة بطريقة SHORT. (ب) نفس العينات في A الموضحة بعد المعالجة القصيرة. شريط المقياس = 1 سم. الاختصارات: TDE = 2,2'-ثيوديثانول ؛ SHORT = SWITCH - H2O2 - مستضد Retrieval -TDE ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. صور LSFM تمثيلية لشريحة موضحة تحمل أربع علامات مختلفة. (أ) صور إسقاط الشدة القصوى (دقة 3.3 × 3.3 × 3.3 ميكرومتر3) تظهر إعادة بناء ميزوسكوبي لشريحة معالجة قصيرة من منطقة بروكا تحمل علامة NeuN و Somatostatin و Calretinin والعلامة النووية DAPI. على اليمين ، يتم عرض الصورة المدمجة (NeuN-SST-CR-DAPI). شريط المقياس = 0.5 سم. (B) إدراج مكبرة للصورة المدمجة في A. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (C) صور عالية الدقة (0.55 × 0.55 × 3.3 ميكرومتر) yz من (B). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: TDE = 2,2'-ثيوديثانول ؛ SHORT = SWITCH - H2O2 - مستضد Retrieval -TDE ؛ LSFM = المجهر الفلوري للصفائح الضوئية ؛ NeuN = مستضد نووي عصبي ؛ SST = السوماتوستاتين. CR = كالريتينين ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: صور LSFM تمثيلية للتلطيخ متعدد الجولات في شرائح معالجة قصيرة. (أ) صور لشريحة دماغ بشري يتم تطهيرها مسبقا (في PBS) وبعد وضع العلامات متعددة الجولات مع مطابقة معامل الانكسار (68٪ TDE). شريط المقياس = 1 سم. (ب) دمج القنوات المختلفة المكتسبة خلال ثلاث جولات متعددة لاحقة. تظهر الصورة كلا من المادة البيضاء والرمادية موسومة بالببتيد المعوي النشط في الأوعية ، والسوماتوستاتين ، والبارفالبومين ، والكالريتينين ، والمستضد النووي العصبي ، والبروتين الحمضي الليفي الدبقي ، والفيمنتين. دقة عالية (دقة 0.55 × 0.55 × 3.3 ميكرومتر) ، يتم عرض صور أحادية القناة على اليمين وأسفل الصورة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر لجميع الصور، باستثناء GFAP (شريط المقياس 10 = ميكرومتر). (ج) صور إسقاط الشدة القصوى لشريحة بسمك 500 ميكرومتر تظهر الإشارة من سبعة أجسام مضادة مختلفة تستخدم في ثلاث جولات متتالية من التلوين المناعي. الجولة 1: PV-SST-VIP; الجولة 2: CR-SST-NeuN؛ الجولة 3: VIM-SST-GFAP. شريط المقياس = 1 مم. تم تعديل هذا الرقم من Pesce et al.18. الاختصارات: TDE = 2,2'-ثيوديثانول ؛ SHORT = SWITCH - H2O2 - مستضد Retrieval -TDE ؛ LSFM = المجهر الفلوري للصفائح الضوئية ؛ NeuN = مستضد نووي عصبي ؛ SST = السوماتوستاتين. CR = كالريتينين ؛ PV = بارفالبومين. GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي ؛ VIM = فيمنتين. VIP = الببتيد المعوي النشط في الأوعية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الطول الزمني التمثيلي ل SHORT للعينات ذات النطاق من المساحات والسماكة. تتطلب العينات ذات المساحات والسماكات المختلفة وقت حضانة متغير في محاليل المقاصة والأجسام المضادة ، مما يؤدي إلى أطوال زمنية مميزة لخط أنابيب SHORT بأكمله. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: الأجسام المضادة المتوافقة مع SHORT. يسرد الجدول جميع الأجسام المضادة التي تم اختبارها باستخدام بروتوكول SHORT وأظهرت تلطيخا محددا في عينات دماغ الإنسان بسمك 400-500 ميكرومتر. يشير عمود P / M إلى الأجسام المضادة متعددة النسيلة وحيدة النسيلة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب التصوير عالي الدقة وإعادة بناء 3D لمناطق الدماغ البشري الكبيرة تقسيما ميكانيكيا للأنسجة يليه المقاصة البصرية ووضع العلامات المناعية لشرائح مفردة. يصف البروتوكول المقدم هنا كيف يمكن استخدام طريقة تحويل الأنسجة القصيرة للمعالجة السريعة والمتزامنة لأقسام سميكة متعددة من الدماغ البشري لإعادة بناء الدماغ 3D مع دقة تحت الخلوية مع LSFM.

على عكس الأساليب الأخرى ، مع طريقة SHORT ، لا تتطلب خطوات المقاصة والعلامات المتعددة معدات مخصصة متطورة. يمكن معالجة الجزء الأكبر من العينات تماما ، مما يقلل من وقت معالجة كتل أنسجة المخ البشرية الكبيرة ويقلل من التباين التقني.

تعد علاجات إزالة اللون وكشف القناع أمرا بالغ الأهمية عند العمل مع الأنسجة البشرية القديمة المثبتة بالفورمالين. يمكن أيضا استخدام بيروكسيد الهيدروجين وحلول استرجاع المستضد القلوي مع طرق المقاصة الأخرى مثل iDISCO 6,28 و CLARITY و SWITCH و SHIELD24.

لضمان الحفاظ على معلومات epitopal وتحقيق إزالة موحدة لكل من المادة الرمادية والبيضاء ، من الضروري تحويل العينة إلى هجين هجين / نسيج مقاوم للحرارة والكواشف الكيميائية. تم اختيار الجلوتارالدهيد لقدرته الممتازة على التشابك وقدرته على اختراق لوح الأنسجة عند درجة حموضة منخفضة (الرقم الهيدروجيني = 3). تركيز الجلوتارالدهيد هو عامل حاسم في تحديد قوة ووضوح الأنسجة. يؤدي التركيز العالي إلى الحفاظ بشكل أفضل على بنية الأنسجة ولكنه يزيد أيضا من الوقت اللازم للتطهير. يتيح هذا الاختيار النتائج المرجوة من حيث الحفاظ على الخاتمة والمقاصة المتجانسة. في حالة حل إيقاف التشغيل (خطوة البروتوكول 2.1) ، تم اختيار تركيز الجلوتارالدهيد بعناية وتحسينه لتحقيق توازن بين التشابك الفعال والمقاصة السريعة18,25. تم تصميم SHORT خصيصا للعمل مع شرائح الدماغ البشري الثابتة بالفورمالين من منطقة بروكا والحصين والقشرة القشرية18،23،25. ومع ذلك ، عند العمل مع نماذج بيولوجية أخرى أو مناطق مختلفة من الدماغ ، قد تكون بعض التعديلات ضرورية بسبب الاختلافات في تكوين المادة الرمادية والبيضاء.

تتمثل إحدى المهام الحاسمة لهذا البروتوكول أيضا في تحسين وقت الحضانة في المقاصة (خطوة البروتوكول 3.4) وحلول الأجسام المضادة (خطوات البروتوكول 4.8 و 4.10) ، المتعلقة بشكل أساسي بحجم العينة والتركيب البيولوجي للأنسجة. قدرنا أن 500 ميكرومتر تمثل حد سمك الأنسجة لتحقيق الشفافية المثلى في كل من المادة البيضاء والرمادية ووضع علامات موحدة في جميع أنحاء عمق الأنسجة للعديد من تلطيخ الأجسام المضادة (الجدول 2). يمكن العثور على وصف مفصل لهذه العمليات في Pesce et al.18 و Scardigli et al.24. قد يكون لمناطق الدماغ المختلفة تركيبة مختلفة في الدهون والبروتينات ، وتطور الأدمغة المسنة نسبة عالية من أصباغ نوع ليبوفوسين ونيويوروميلانين التي تنتج إشارة تألق ذاتي قوية وتغير انتشار المسبار في جميع أنحاء الأنسجة. على سبيل المثال ، تحتاج شريحة بسمك 400 ميكرومتر من 16 سم2 من منطقة بروكا البشرية إلى 7 أيام من العلاج بمحلول المقاصة للوصول إلى مستوى عال من إزالة الدهون. لضمان تلطيخ موحد في جميع أنحاء عمق الأنسجة ، فإنه يتطلب الحضانة مع حلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية لمدة 7 و 6 أيام ، على التوالي (الشكل 3). لذلك يلزم تحسين جيد لخطوات المقاصة ووضع العلامات قبل تطبيق بروتوكول الإنتاجية العالية الموصوف هنا.

يتيح SHORT تخزين العينات في حامل التصوير المصنوع خصيصا حيث ثبت أن إشارة الفلورسنت محفوظة لمدة عام على الأقل. لذلك يمكن للباحثين إعداد جميع السندويشات مسبقا وتخزينها لخطوة التصوير التي يمكن القيام بها لاحقا. والجدير بالذكر أنه يمكن تخصيص شريحة المجهر والفاصل وزجاج الغطاء المستخدم لإعداد السندويشات وفقا لحجم العينة.

تم تحليل العينات التي تمت معالجتها باستخدام بروتوكول SHORT الموصوف هنا باستخدام LSFM18,23 مقلوب حسب الطلب. يتكون هذا الإعداد من ذراعين مجهزين بأهداف مخصصة 12x مع طوق تصحيح معامل الانكسار (RI). يعمل كل هدف كذراع إضاءة وكشف في نفس الوقت ، مما يسمح بالحصول على قناتين في وقت واحد بسرعة حجمية تبلغ 0.16 سم3 / ساعة. نظرا لأن حامل العينة يمكنه استيعاب شطيرتين في وقت واحد ، يمكننا تصوير أربع قنوات على التوالي في شريحتين في 10 ساعات. بسبب السمية الخفيفة لبخار TDE للجهاز التنفسي ، لتجنب الانحراف الكروي ، يتم ملء حامل العينة بمحلول 91٪ v / v glycerol / water الذي يطابق RI (1.46) لكل من غطاء الكوارتز ومحلول TDE. يجب تغيير محلول 91٪ v / v glycerol / water كل 3 أيام لتجنب تلوث الغبار. لذلك ، يتيح LSFM الخاص بنا الحصول السريع على العينات ذات التبييض الضوئي المنخفض بدقة الخواص تبلغ 3.6 ميكرومتر بعد المعالجة اللاحقة18،23،29. تمت معالجة الكمية الكبيرة من البيانات المنتجة باستخدام خط أنابيب محدد لإعادة تقطيع وخياطة مكدسات الصور باستخدام برنامج مطور ذاتيا ، ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher) 23,29.

على الرغم من أننا استخدمنا SHORT مع الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية ، إلا أنه يمكن استخدام أنواع مختلفة من تقنيات التصوير الفلوري للاقتناء اعتمادا على توفر المختبر والتطبيقات المحددة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام المجهر متحد البؤر25 أو المجهر ثنائي الفوتون14 لتحليل العينات التي تم تطهيرها. يوصى بهذا النوع من التحليل للعينات ذات الأحجام الصغيرة نسبيا نظرا لأنها أنظمة قائمة على المسح الضوئي ووقت الاستحواذ لمناطق الأنسجة الكبيرة طويل جدا30. من خلال تحقيق تصوير أسرع وفصل الدقة الجانبية والمحورية ، يعد الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية هو الطريقة المفضلة لتصوير كميات كبيرة من العينات التي تم مسحها3،4،18،31،32،33.

باختصار ، وصفنا بروتوكولا سريعا عالي الإنتاجية للمقاصة المتزامنة ، ووضع العلامات المشتركة المتجانسة ، وإعادة البناء الحجمي 3D لعشرات من أقسام الدماغ البشري بعد الوفاة. من خلال الجمع بين SHORT وتصوير LSFM والتحليل الحسابي ، من الممكن الحصول على بيانات ثلاثية الأبعاد لتعداد شامل للخلايا وتحليل بروتيني للدماغ البشري.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بروس فيشل ، مستشفى ماساتشوستس العام ، مركز إيه إيه مارتينوس للتصوير الطبي الحيوي ، قسم الأشعة ، على توفير عينات الدماغ البشري التي تم تحليلها في هذه الدراسة. حصل هذا المشروع على تمويل من برنامج إطار البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 654148 (Laserlab-Europe) ، من برنامج إطار عمل Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار بموجب اتفاقية المنحة المحددة رقم 785907 (مشروع الدماغ البشري SGA2) ورقم 945539 (مشروع الدماغ البشري SGA3) ، من مركز مؤسسة المستشفيات العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم U01 MH117023 ، ومن وزارة التعليم الإيطالية في إطار العقدة الإيطالية للتصوير الحيوي الأوروبي (البنية التحتية لأبحاث ESFRI). أخيرا ، تم إجراء هذا البحث بمساهمة "Fondazione CR Firenze". محتوى هذا العمل هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2،2'-ثيوديثانولميرك لايف ساينس إس آر إل166782
الأسيتاميد > = 99.0٪ (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agarose High EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
حمض البوريك ميركلايف ساينس إس آر إلB7901
Compressome VF-900-0Z MicrotomePrecisionary/
CoverslipsLaserOptex/مخصص
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ثنائي الصوديوم ملح ثنائي الهيدراتميرك لايف ساينس إس آر إلE5134
الجلوتارالديهايدميرك لايف ساينس إس آر إلG7651
جلايسينسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC_29096
بيروكسيد الهيدروجين 30٪ميرك لايف ساينس إس آر إل
حاضنة ISS-4075رفيق مختبر  /
الفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة (LSFM)//
Loctite Attak HenkelItalia srlحسب الطلب /
شرائح المجهرLaborchimica/قرص
ملحي مخصص للفوسبات عازلةMerck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002خارج الإنتاج
البوتاسيوم الهيدروجين PhtalateMerck Life Science S.R.L.P1088
أزيد الصوديومميرك علوم الحياة S.R.L.S2002
كبريتات الصوديوم دوديسيلميرك لايف ساينس إس إلL3771
كبريتات الصوديومميرك علوم الحياة SRLS0505
الفواصلMicrolaser srl
حاويات البلغم المخصصة (أطباق بأغطية لولبية)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (كواشف ITW)A4577،0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
أنابيبSarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Vibratome VT1000SLeica Biosystem/
Water Bath MemmertWNB 7-45<
قوي > الأجسام المضادة والأصباغ < / قوي >
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H + L) JacksonImmuno Reasearch611-545-215التخفيف المستخدم ، 1: 200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H + L) JacksonImmuno Reasearch805-545-180التخفيف المستخدم ، 1: 200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H + L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215التخفيف المستخدم ، 1: 200
الأجسام المضادة للنيوميرك لايف ساينس إس آر إل.ABN91التخفيف المستخدم ، 1:100
الجسم المضاد للبارفالبومين (PV)Abcamab32895التخفيف المستخدم ، 1: 200
الجسم المضاد للفيمنتين [V9] - علامة الهيكل الخلوي (VIM)Abcamab8069التخفيف المستخدم ، 1: 200
كالريتينين الأجسام المضادة متعددة النسيلةProteinTech12278_1_APالتخفيف المستخدم ، 1:200
DAPIThermoFisherD3571التخفيف مستعمل ، 1: 100
حمار مضاد للفأر IgG H & L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700التخفيف المستخدم ، 1: 200
الحمار المضاد للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107التخفيف المستخدم ، 1: 200
الحمار المضاد للأرانب IgG H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470التخفيف المستخدم ، 1: 200
الحمار المضاد للفئران IgG H& L (Alexa Fluor 568) الممتزةAbcamab175475التخفيف المستخدم ، 1: 200
الماعز المضاد للدجاج IgY H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169التخفيف المستخدم ، 1: 500
الماعز المضاد للدجاج IgY H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711التخفيف المستخدم ، 1: 500
الماعز المضاد للدجاج IgY H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171التخفيف المستخدم ، 1: 500
الماعز المضاد للأرانب IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077التخفيف المستخدم ، 1: 200
المؤتلف Alexa Fluor 488 الأجسام المضادة المضادة ل GFAPAbcamab194324التخفيف المستخدم ، 1: 200
الأجسام المضادة Somatostatin YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706التخفيف المستخدم ، 1: 200
الببتيد المعوي النشط الوعائي (VIP)ProteinTech16233-1-APالتخفيف المستخدم ، 1: 200
مسبقا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251(2019).
  2. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84(2021).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  4. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  5. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
  6. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  8. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631(2016).
  9. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  10. Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48(2014).
  11. Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  12. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  13. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  14. Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684(2021).
  15. Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066(2018).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
  17. Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038(2021).
  18. Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447(2022).
  19. Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170(2023).
  20. Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
  21. Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
  22. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  23. Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844(2023).
  24. Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234(2021).
  25. Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
  26. Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  27. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  28. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
  29. Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160(2023).
  30. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  31. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  32. Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405(2022).
  33. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808(2015).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Optical ClearingLight Sheet MicroscopyHuman Brain ImagingTissue ClearingVolumetric ReconstructionAntigen RetrievalNeuronal MarkersImmunostainingRefractive Index MatchingVibratome Sectioning

مقالات ذات صلة