هنا ، نصف الخطوات اللازمة لإنشاء نموذج EVLP للفئران ونظهر المظهر الالتهابي المرتبط بالرئتين المنفصة. الهدف هو نشر المعرفة والخبرات حول نموذج EVLP للفئران ، مما يتيح الفهم المتكامل للاستجابات البيولوجية المرتبطة بهذه التقنية الثورية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنشاء نموذج فئران نضح الرئة خارج الجسم الحي للرؤى الانتقالية في زراعة الرئة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
منذ إنشاء زراعة الرئة كاستراتيجية علاجية لأمراض الرئة المتقدمة ، يواجه المجتمع العلمي مشكلة انخفاض عدد الرئتين التي تعتبر قابلة للتطبيق لعملية التبرع. ومع ذلك ، في العقود الأخيرة ، تم تغيير هذا السيناريو بشكل إيجابي ، نظرا لتطور تروية الرئة خارج الجسم الحي (EVLP) كاستراتيجية لتقييم وتجديد الرئتين الهامشية. أدى إنشاء EVLP في مراكز زراعة الأعضاء الكبيرة إلى زيادة عدد عمليات زرع الرئة ، سواء من خلال زيادة الدقة التشخيصية لوظائف الرئة أو من خلال تشكيل منصة فعالة لإعادة تجديد ترقيع الرئة. في هذا السياق ، في مواجهة القضايا الأخلاقية واللوجستية ، وكذلك في دراسة العوامل المناعية المرتبطة بزراعة الرئة ، أصبح تطوير نماذج EVLP للقوارض أمرا مهما ، نظرا لموثوقيتها ، وإمكانية التلاعب الجيني ، وانخفاض التكاليف. تصف هذه الورقة بروتوكولا لإنشاء نموذج EVLP للفئران وتظهر الملف الالتهابي المرتبط بالرئتين المنفوختين. سيساعد هذا في نشر المعرفة حول نموذج EVLP للفئران ، مما يعزز فهمنا للاستجابات البيولوجية المرتبطة بهذه التقنية الثورية.
المقدمة
تم التعرف على زراعة الرئة كاستراتيجية علاجية لأمراض المرحلة النهائية مع تحسينات في الأساليب الجراحية وتثبيط المناعة خلال العقود الماضية. على الرغم من ارتفاع الطلب ، فإن عدد المتبرعين الرئويين المتوفين المقبول أقل من الأعضاء الصلبة الأخرى ، حيث يتقارب مع العدد الأقل من عمليات زرع الرئة التي يتمإجراؤها 1،2،3. لمعالجة النقص في مجموعة المتبرعين ، قام المجتمع الطبي بتوسيع معايير التبرع بالرئة ، وتحويل الأعضاء التي كانت تعتبر سابقا غير قابلة للحياة إلى أعضاء محتملة للزرع. ومع ذلك، تتطلب المعايير الموسعة جهودا مختلفة من أجل فهم وتدخل أفضل في ضوء العواقب المنهجية المحتملة التي تنشأ عن العضو المتبرع به. ظهر نضح الرئة خارج الجسم الحي (EVLP) كتقنية توفر الحفاظ على الرئة الحرارية العادية ، وتقييم وظائف الرئة ، وتجديد الرئتين التي كانت تعتبر سابقا غير مجدية لعمليةالتبرع 4،5،6.
نظرا للعدد المتزايد من عمليات زرع الرئة منذ إنشاء EVLP في مراكز زراعة الأعضاء الكبيرة ، فقد تم التحقيق بشكل متزايد في استراتيجيات الحفاظ على الرئة وإصلاحها. بهذا المعنى ، في مواجهة القضايا الأخلاقية واللوجستية ، وكذلك في دراسة العوامل المناعية المرتبطة بزراعة الرئة ، أصبح تطوير نماذج EVLP للقوارض أمرا مهما ، نظرا لموثوقيتها ، وإمكانية التلاعب الجيني ، وانخفاض التكاليف7،8،9. هنا ، نصف الخطوات اللازمة لإنشاء نموذج EVLP للفئران وإظهار الملف الالتهابي المرتبط بالرئتين المنفوختين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء التجارب على وفقا لبروتوكول استخدام المعتمد من قبل لجنة رعاية في الشبكة الصحية الجامعية. تم منح ذكور فئران لويس (255-330 جم) إمكانية الوصول إلى الغذاء والماء. بعد ذلك ، تم الحفاظ عليها في بيئة خاضعة للرقابة (18-22 درجة مئوية) مع دورة نهارا وليلا لمدة 12 ساعة. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والحلول والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. تهيئة نظام نضح الرئة خارج الجسم الحي
- تأكد من توصيل جميع محولات الطاقة بمعدات جهاز التروية المعزولة ونظام الحصول على البيانات (الشكل 1). ثم افتح برنامج الحصول على البيانات.
- قبل التروية ، املأ دائرة EVLP ب 150 مل من محلول Steen مكملا ب 1,000 وحدة USP من هيبارين الصوديوم ، و 50 مجم من السيفازولين ، و 50 مجم من ميثيل بريدنيزولون.
- اضبط حمام الماء الدافئ على 20 درجة مئوية. ابدأ في تدوير الماء الدافئ لتسخين نظام EVLP بالكامل.
2. إجراء شراء الرئة من المتبرعين
- تخدير الجرذ بحقن داخل الصفاق من الكيتامين (50 ملغ/كغ) والزيلازين (5 ملغ/كغ) أو وفقا للممارسة المحلية. تأكد من العمق المناسب للتخدير عن طريق فحص منعكس قرصة إصبع القدم.
- إجراء التنبيب الوريدي (14 جم قسطرة وريدية). بعد التنبيب ، قم بتوصيل أنبوب القصبة الهوائية بنظام تهوية الصغيرة. قم بتهوية الفئران بحجم مد و جزر يبلغ 10 مل / كجم ، ومعدل 60 نفسا / دقيقة ، وجزء الأكسجين المستوحى (FiO2) من 0.5 ، وضغط الزفير النهائي الإيجابي (PEEP) 2 سم H2O.
- ضع الجرذ في وضع ضعيف.
- بمساعدة المقص والملقط المناسبين ، ادخل إلى التجويف البريتوني واحمل الشق في الجمجمة ، وقم بإجراء بضع البطن المتوسط وحقن هيبارين الصوديوم (400 وحدة USP) في الوريد البابي.
- بعد ذلك ، أدخل التجويف الصدري من خلال عملية الخفافير. قم بإجراء بضع القص مع استئصال الجمجمة للقص والفتح الشعاعي الحذر للحجاب الحاجز ، حتى لا تتلف الرئة.
- لاستعادة كتلة القلب والرئة، قم بعمل شق في الوريد الأجوف السفلي (IVC) وعلى طول قمة القلب الأيسر.
- باستخدام مقص دقيق ، قم بإجراء شق أمامي في مجرى تدفق البطين الأيمن. بعد ذلك ، أدخل قسطرة وريدية 18 جم في الجذع الرئوي واغسل الرئتين ب 20 مل من محلول ديكستران منخفض البوتاسيوم (LPD) يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من البروستاجلاندين E1.
- مباشرة بعد التنظيف ، قم بتثبيت الثلث السفلي من القصبة الهوائية في نهاية الإلهام للحفاظ على الرئتين في حالة منتفخة.
- حصاد كتلة القلب والرئة وضعها في محلول LPD للتخزين.
ملاحظة: يمكن تخزين طعم الرئة في درجات حرارة وفترات زمنية مختلفة وفقا لغرض البحث. هنا ، نعرض نتائج تمثيلية للرئتين اللتين خضعت لأطوال متفاوتة من الوقت الإقفاري البارد (CIT) على الجليد.
3. إجراء نضح الرئة خارج الجسم الحي
- ضع رباط حريري 0 أسفل الشريان الرئوي الرئيسي (PA) وحول البطينين ، وقم بتثبيته لتسهيل القنية.
- قم بتوصيل قنية PA في خط التدفق لنظام EVLP وابدأ تشغيل المضخة التمعجية بنسبة 10٪ من تدفق الصيانة ، مما يسمح بإزالة أي هواء في قنية PA.
- ضع قنية التدفق وقم بتثبيتها في PA الرئيسي (OD: 2.0 مم / قطر الرأس: 2.5 مم) ، متبوعة بقنية التصريف من قمة القلب إلى الأذين الأيسر (قطر رأس LA: 4.0 مم) من خلال الصمام التاجي للتروية اللاحقة. استخدم الملقط لتوسيع الصمام التاجي ، مما يسهل القنية.
- قم بعمل ثقب صغير في القصبة الهوائية وأدخل قنية القصبة الهوائية (OD: 2.0 مم / L: 14 مم). ثم قم بتوصيله بخط التهوية للنظام.
- قم بتوصيل قنية لوس أنجلوس بخط التدفق الخارجي للنظام.
- ملاحظة: لقد حددنا 10٪ من تدفق الصيانة كبدء للنضح. لتجنب إدخال فقاعات الهواء في الرئتين ، تأكد من ملء مصيدة الفقاعات.
- قم بزيادة معدل التدفق تدريجيا للوصول إلى 20٪ من النتاج القلبي (CO).
ملاحظة: لنشر كلتا الرئتين ، استخدمنا ما يقدر ب 75 مل / دقيقة ل 250 جراما من الفئران10،11. تمت زيادة معدل تدفق التروية تدريجيا إلى 1 ساعة للوصول إلى معدل التدفق المستهدف وفقا لبروتوكول EVLP السريري12. يتم تلخيص معلمات التروية في الجدول 113. - قم بإزالة مشبك القصبة الهوائية بعد 20 دقيقة من بدء التروية وابدأ تهوية الرئة متبوعا ببدء تدفق غاز EVLP (8٪ CO2 ، 6٪ O2 ، 86٪ N2) للحفاظ على تدفق نفحات PCO2 بين 35 و 45 مم زئبق.
ملاحظة: يتم تلخيص معلمات التهوية في الجدول 113.
4. المعلمات وإدارة العينات
- كل ساعة أثناء EVLP ، سجل في الوقت الفعلي الامتثال الديناميكي للرئة ومقاومة الأوعية الدموية الرئوية (PVR).
ملاحظة: قبل 5 دقائق من التقييمات الفسيولوجية ، يجب توسيع الرئتين إلى ضغط التضخم. - خذ عينات من النفقات من منفذ العينة كل ساعة وقم بالتجميد السريع في النيتروجين السائل لمزيد من التحليلات.
ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك ، نقوم بإجراء مناورة تجنيد (حتى 20 سم فيالساعة 2درجة مئوية) قبل 5 دقائق من التقييم ، وبعد ذلك نأخذ الخرافات لتحليلات غازات الدم لقياس الأس الهيدروجيني ، PCO2 ، PO2 ، الإلكتروليتات ، الجلوكوز ، واللاكتات. - أوقف التروية وقم بتثبيت القصبة الهوائية للحفاظ على الرئتين في حالة منتفخة. بعد ذلك ، قم بعزل عينات الرئة وتجميدها في النيتروجين السائل أو وضعها في محاليل التثبيت لمزيد من الدراسات.
ملاحظة: هنا ، تم نشر الرئتين لمدة 4 ساعات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن أن تتدفق جميع الرئتين مع CIT التي تتراوح من 20 دقيقة إلى 18 ساعة لمدة 4 ساعات (الشكل 2) 13. كان الامتثال مستقرا في معظم المجموعات باستثناء 18 ساعة CIT ، والتي انخفضت تدريجيا خلال فترة التروية التي استمرت 4 ساعات (الشكل 2 أ). على الرغم من ذلك ، لم يتم ملاحظة فروق ذات دلالة إحصائية في مقاومة الأوعية الدموية ، وأكسجة الطعم الرئوي ، ومستويات الجلوكوز للمجموعات (الشكل 2B-D
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصفت هذه الدراسة الخطوات اللازمة لإنشاء بروتوكول EVLP للفئران. هنا ، نوضح أنه يمكن نشر رئتي المتبرع لمدة 4 ساعات بعد الحفاظ على الكهرباء الساكنة الباردة لمدة تصل إلى 18 ساعة عند 4 درجات مئوية. وقد تم إثبات ذلك من خلال تقييم امتثال الرئة ، ومقاومة الأوعية الدموية الرئوية ، وتركيز الجلوكوز / اللاكتات في التحيم ، ونسبة P / F.
أدى ظهور منصة EVLP كأداة مهمة في تقييم وظائف الرئة وتجديد الكسب غير المشروع إلى تحفيز العديد من المجموعات على تطوير نموذج EVLP للفئران. هذ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
MC هي مساهم في Traferox Technologies Inc ومستشارة لشركة Lung Bioengineering Inc. تتلقى MC دعما بحثيا من Beyond Air Inc. و Synklino. ويعلن المؤلفان أنه لم تكن هناك مصالح متنافسة يمكن أن تؤثر على النتيجة الواردة في هذه الورقة.
شكر وتقدير
تم إنشاء الشكل 1 ب BioRender.com (تأكيد حقوق النشر والترخيص [الاتفاقية: BT25KGSKWF]).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| قسطرة وريدية 14G | BD | 381167 | التنبيب في فتحة القصبة الهوائية |
| قسطرة وريدية 16G | BD | 381157 | قسطرة لغسل الرئة |
| 2-0 سوتش سوفيلك | كوفيديين | S-305 | تثبيت أنبوب القصبة الهوائية |
| سوفيلك 3-0 سوتور سوفسيلك | كوفيديين | S303 | تثبيت القنوص الشريانية والأذينية |
| نظام الرئة المثقوب المعزول في النواة IPL-2 للفئران | جهاز هارفارد | 734276 | نظام تدفقات الرئة خارج الجسم الحي (EVLP) |
| الكيتامين (ناركيتان) | فيتوكينول | 440894 | التخدير/التخدير |
| مدفع الشريان الرئوي الكبير | جهاز هارفارد | 73-0711 | |
| القمع الأذيني الأيسر | جهاز هارفارد | 73-0712 | |
| محلول الجلوكوز منخفض البوتاسيوم ديكستران (بيرفاديكس) | XVIVO | 19811 | حل الحفظ |
| ميثيل بريدنيزولون الصوديوم سوكسينات (SOLU-MEDROL) | فايزر | 14705 | مضاد للالتهاب |
| بروستاجلاندين E1 (بروستين VR) | فايزر | RX297945 | |
| جهاز التنفس الصناعي للحيوانات الصغيرة (موديل 683) | جهاز هارفارد | 55-0000 | |
| هيبارين الصوديوم | ليو فارما | 453811 | |
| حل ستين | XVIVO | 19004 | محلول خارج الخلوي مخزن لنفخ الرئتين أثناء عملية التفريغ الداخلي |
| Sugita Aneur clip curv | ميزوهو | 07-940-86 | مشبك القصبة الهوائية |
| قرب القصبة الهوائية | جهاز هارفارد | 73-3384 | |
| زيلازين (رومبون) | باير للرعاية الصحية | 2169592 | التخدير/التخدير |
المراجع
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report — 2021; Focus on recipient characteristics. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 40 (10), 1060-1072 (2021).
- Meyer, K. C. Recent advances in lung transplantation. F1000Research. 7, 1684(2018).
- Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2018 Annual Data Report: Lung. American Journal of Transplantation. 20, 427-508 (2020).
- Chaney, J., Suzuki, Y., Cantu, E., van Berkel, V. Lung donor selection criteria. Journal of thoracic disease. 6 (8), 1032-1038 (2014).
- Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 13 (11), 6602-6617 (2021).
- Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool. Clinics in Chest Medicine. 44 (1), 77-83 (2023).
- Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: a review of translational interspecies models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (6), L932-L940 (2020).
- Noda, K., Philips, B. J., Atale, N., Sanchez, P. G. Endothelial protection in lung grafts through heparanase inhibition during ex vivo lung perfusion in rats. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 42 (6), 697-706 (2023).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Malik, A. B., Kaplan, J. E., Saba, T. M. Reference sample method for cardiac output and regional blood flow determinations in the rat. Journal of Applied Physiology. 40 (3), 472-475 (1976).
- Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).
- Soares, P. R. O., et al. Comparison between perfadex and locally manufactured low-potassium dextran solution for pulmonary preservation in an ex vivo isolated lung perfusion model. Transplantation Proceedings. 43 (1), 84-88 (2011).
- Pêgo-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).
- Yamanashi, K., et al. Reduction of donor mononuclear phagocytes with clodronate-liposome during ex lung perfusion attenuates ischemia-reperfusion injury. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 165 (4), e181-e203 (2023).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
