يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام التصوير الحي خارج الجسم الحي للتحقيق في انقسامات الخلايا وحركاتها أثناء تجديد أسنان الفأر

2.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66020

⸱

أكتوبر 27, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

التصوير الحي خارج الجسم الحي هو تقنية قوية لدراسة العمليات الديناميكية للحركات الخلوية والتفاعلات في الأنسجة الحية. هنا ، نقدم بروتوكولا ينفذ الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتتبع الخلايا الظهارية السنية الحية في قواطع الفئران البالغة المستزرعة.

الملخص

تظهر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار كنظام نموذجي قابل للتتبع للغاية للتحقيق في تنظيم الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة البالغة وتجديد الأسنان. تنقسم هذه المجموعات السلفية وتتحرك وتتمايز بنشاط للحفاظ على توازن الأنسجة وتجديد الخلايا المفقودة بطريقة سريعة الاستجابة. ومع ذلك ، فإن التحليلات التقليدية باستخدام أقسام الأنسجة الثابتة لا يمكن أن تلتقط العمليات الديناميكية للحركات والتفاعلات الخلوية ، مما يحد من قدرتنا على دراسة لوائحها. تصف هذه الورقة بروتوكولا للحفاظ على قواطع الفئران الكاملة في نظام زراعة النباتات والخلايا الظهارية السنية الحية باستخدام المجهر متعدد الفوتونات. تضيف هذه التقنية إلى مجموعة أدواتنا الحالية لأبحاث الأسنان وتسمح للمحققين بالحصول على معلومات زمانية مكانية حول سلوكيات الخلايا ومنظماتها في الأنسجة الحية. نتوقع أن تساعد هذه المنهجية الباحثين على استكشاف الآليات التي تتحكم في العمليات الخلوية الديناميكية التي تحدث أثناء تجديد الأسنان وتجديدها.

المقدمة

على مدى العقدين الماضيين ، برزت قاطعة الماوس كمنصة لا تقدر بثمن للتحقيق في مبادئ تنظيم الخلايا الجذعية البالغة وتجديد الأسنان 1,2. تنمو قاطعة الفأر باستمرار وتجدد نفسها طوال حياة. يقوم بذلك عن طريق الحفاظ على كل من الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة ، والتي يمكن أن تتجدد ذاتيا وتتمايز إلى أنواع مختلفة من خلايا السن 1,2. في حين أن الخلايا الجذعية الظهارية السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات المينائية ، التي تفرز مصفوفة المينا ، فإن الخلايا الجذعية الوسيطة السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات السنية ، والأرومات الأسمنتية ، والخلايا الليفية ، والتي تشكل العاج ، والملاط ، والرباط اللثوي ، على التوالي3،4،5،6. يحافظ هذا الإمداد المستمر للخلايا الجديدة على توازن الأنسجة ويسمح باستبدال الخلايا القديمة المفقودة بسبب تآكل المضغ أو الإصابات 7,8. لذلك فإن توضيح الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم صيانة وتمايز الخلايا الجذعية السنية أمر أساسي لفهم تجديد الأسنان ، وهو مجال يحظى باهتمام متزايد.

تشريحيا ، يتم تغليف جزء كبير من قاطعة الفأر البالغة في عظم الفك. أثناء تعرض الحافة القاطعة للسن ، فإن الطرف القمي للقواطع يتناسب مع التجويف ويتم ربطه بقوة بالعظم المحيط من خلال أربطة اللثة والأنسجة الضامة (الشكل 1 أ ، ب). النهاية القمية للقواطع هي أيضا منطقة نمو السن وتحافظ على جذع الأسنان والخلايا السلفية في كل من الطبقة الظهارية ولب اللحمة المتوسطة9،10،11،12،13. على وجه التحديد ، يتم الحفاظ على الخلايا الجذعية الطلائية السنية في الطرف المنتفخ من الظهارة ، والمعروفة باسم البرعم القمي ، والتي يشار إليها أيضا باسم حلقة عنق الرحم الشفوية (الشكل 1C). على غرار ظهارة الأمعاء والبشرة ، يتم دعم التجديد الظهاري في القاطعة بشكل أساسي من خلال تدوير الخلايا الجذعية بنشاط وأحفادها الوسيطة التكاثرية للغاية ، والتي تسمى خلايا تضخيم العبور14،15،16،17 ، وكلاهما مقيم في الجزء الداخلي من حلقة عنق الرحم. ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كانت ظهارة القواطع تحتوي على خلايا جذعية هادئة وتستخدمها أثناء التجديد. في المقابل ، تم تحديد كل من الخلايا الجذعية الوسيطة السنية النشطة والهادئة في اللب القمي ، وتعمل الخلايا الجذعية الهادئة كمجموعة احتياطية يتم تنشيطها أثناء إصلاح الإصابة13,18.

نتجت العديد من الاكتشافات حول بيولوجيا تجديد وتجديد قاطعة الفأر عن التحقيقات النسيجية ، حيث يتم الحصول على عينات في منعطفات زمنية متميزة ، وتثبيتها ، ومعالجتها ، ثم تقسيمها إلى شرائح رقيقة ميكرون على طول مستوى معين. من خلال التحليل التفصيلي للأقسام النسيجية من نماذج الفئران المختلفة التي تمكن من تتبع النسب أو الاضطرابات الجينية ، حدد العلماء سلالات الخلايا لمختلف مجموعات السلف ، بالإضافة إلى المسارات الجينية والإشارات التي تتحكم في توازن القواطع وإصلاح الإصابات19،20،21. ومع ذلك ، فإن الصور الثابتة ثنائية الأبعاد (2D) للخلايا غير الحيوية في الأقسام لا يمكنها التقاط مجموعة كاملة من السلوكيات الخلوية والمنظمات المكانية في الأنسجة الحية ، مثل تغيرات شكل الخلية والحركات والحركية الخلوية. يتطلب اكتشاف وقياس هذه التغيرات الخلوية السريعة ، والتي تحدث في نطاق زمني غير قابل للحل من خلال تقسيم الأنسجة ، استراتيجية مختلفة. علاوة على ذلك ، يعد الحصول على مثل هذه المعلومات أمرا بالغ الأهمية أيضا لفهم كيفية تفاعل خلايا الأسنان مع بعضها البعض ، والتفاعل مع محفزات الإشارات المختلفة ، والتنظيم الذاتي للحفاظ على هياكل الأنسجة ووظائفها.

إن ظهور التصوير العميق للأنسجة رباعي الأبعاد (4D) باستخدام المجهر ثنائي الفوتون22 ، وهي تقنية تدمج ثلاثة أبعاد مكانية مع الدقة الزمنية ، يتغلب على القيود المتأصلة في التحليل النسيجي من خلال تمكين الفحص الزماني المكاني لنباتات الأنسجة المستزرعة أو المواد العضوية أو حتى الأنسجة في الموقع23،24،25،26. على سبيل المثال ، كشف التصوير الحي 4D لظهارة الأسنان النامية النقاب عن الأنماط الزمانية المكانية لانقسامات الخلايا والهجرات التي تنسق نمو الأنسجة ، وتشكيل مركز الإشارات ، وتشكل ظهارة الأسنان27،28،29،30،31،32. في قاطعة الفئران البالغة ، تم تكييف التصوير 4D مؤخرا لدراسة السلوكيات الخلوية أثناء إصلاح إصابة الأسنان الظهارية. كشف التصوير الحي أن الخلايا البينية للطبقة في الطبقة فوق القاعدية يمكن تحويلها مباشرة إلى أرومات المينائية في الطبقة القاعدية لتجديد الظهارة التالفة ، مما يتحدى النموذج التقليدي لإصلاح الإصابات الظهارية15.

هنا ، نصف تشريح وزراعة وتصوير قاطعة الفئران البالغة ، مع التركيز على الخلايا الظهارية في حلقة عنق الرحم الشفوية (الشكل 1). تحافظ هذه التقنية على حيوية خلايا الأسنان لأكثر من 12 ساعة وتسمح بالتتبع المباشر للخلايا ذات العلامات الفلورية بدقة خلية واحدة. يسمح هذا النهج بالتحقيق في حركة الخلية وهجرتها بالإضافة إلى التغيرات الديناميكية في شكل الخلية واتجاه الانقسام في ظل ظروف الثقافة العادية ، أو في الاستجابات للاضطرابات الجينية والفيزيائية والكيميائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحفاظ على جميع الفئران في مرافق حيوانية خالية من مسببات الأمراض في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (UCLA) أو الجامعة العبرية في القدس (HUJI). تم إجراء جميع التجارب التي شملت الفئران وفقا للوائح والبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية المعنية لرعاية واستخدام (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) أو (MD-23-17184-3; هوجي). يظهر سير العمل العام للخطوات التجريبية في الشكل 2 أ. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع الأدوات والكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الحلول والمواد الهلامية

  1. وسط التشريح: قم بإعداد DMEM / F12 الطازج مع 0.5٪ جلوكوز واحتفظ به دافئا عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة إليه في الخطوة 2.4.
    ملاحظة: نستخدم DMEM / F12 بدون الفينول الأحمر لتقليل التألق الذاتي أثناء التصوير الحي.
  2. 1x وسط ثقافة: تحضير وسط طازج باستخدام 50٪ DMEM / F12 ، مصل الفئران 50٪ ، 1x بديل الجلوتامين ، 1x أحماض أمينية غير أساسية MEM ، 1٪ جلوكوز ، 0.1 مجم / مل حمض الأسكوربيك ، و 0.5٪ بنسلين ستربتومايسين. احتفظ بها دافئة عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة إليها في الخطوة 5.5. تستخدم هذه الوسيلة لزراعة نباتات القواطع أثناء التصوير الحي.
    ملاحظة: يجب أن يكون مصل الفئران عالي الجودة ومعدا خصيصا لزراعة الأنسجة الكاملة من قبل الباحثين أو من مصدر تجاري. على وجه الخصوص ، يجب طرد الدم بالطرد المركزي (لمدة 5 دقائق عند 1200 × جم في درجة حرارة الغرفة) قبل أن يبدأ التخثر في التكون. بعد الطرد المركزي ، يجب ضغط جلطة الفيبرين الناتجة والتخلص منها33.
  3. جل الثقافة: الغرض من الجل هو شل حركة العينات أثناء التصوير ويتم تحضيرها طازجة.
    1. اصنع 2٪ جل في DMEM / F12 عن طريق إذابة 200 مجم من أغاروز نقطة الانصهار المنخفضة في 10 مل من DMEM / F12 باستخدام الميكروويف. احفظ الجل 2٪ عند 37 درجة مئوية.
    2. اصنع وسطا للاستزراع 2x (بدون DMEM / F12) عن طريق خلط 50٪ مصل الفئران ، 1x بديل الجلوتامين ، 1x أحماض أمينية غير أساسية MEM ، 1٪ جلوكوز ، 0.1 مجم / مل L-حمض الأسكوربيك ، و 0.5٪ بنسلين ستربتومايسين. قم بتسخين وسط الاستزراع 2x (بدون DMEM / F12) إلى 37 درجة مئوية.
    3. اصنع جل استزراع 1٪ عن طريق خلط كميات متساوية من 2٪ جل ووسط استزراع 2x (بدون DMEM / F12). احتفظ بجل المستنبتة 1٪ عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة إليه في الخطوة 5.1.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع المحاليل دافئة قبل الخلط لتجنب التبلور. وجدنا أن 1٪ جل مناسب لزراعة قاطعة الماوس البالغة. يجب تحديد نسبة الجل تجريبيا إذا كان سيتم زراعة الأنسجة الأخرى.

2. استخراج الفك السفلي للفأر البالغ

  1. القتل الرحيم للفئران في العمر المطلوب باستخدام الإجراءات القياسية المعتمدة من قبل IACUC.
    ملاحظة: هنا نستخدم اختناق CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم. قد تختلف لوائح القتل الرحيم للحيوانات في مناطق مختلفة. يجب على الباحثين الحصول على الموافقة المؤسسية اللازمة قبل إجراء التجارب وضمان الامتثال للوائح رعاية المحلية.
  2. تطهير الماوس باستخدام 70 ٪ من الإيثانول.
  3. قطع رأس الماوس واستخراج الفك السفلي الأيسر والأيمن.
    1. ضع الماوس على بطنه ، ثم استخدم شفرة حلاقة صناعية أحادية الحافة # 9 لقطع منطقة الرقبة وفصل رأس الماوس عن بقية الجسم.
      ملاحظة: إذا كان سيتم جمع الأنسجة من البلعوم أو منطقة الرقبة أيضا ، فلا ينبغي إجراء قطع الرأس ، ويمكن للمرء المتابعة مباشرة إلى الخطوة 2.3.2.
    2. اقلب الماوس بحيث يكون جانبه البطني متجها لأعلى ويمكن الوصول إلى الفك السفلي بسهولة.
    3. قم بتأمين رأس عن طريق إمساكه برفق بين الإبهام والسبابة.
    4. استخدم شفرة الحلاقة لعمل شق منتصف السهمي يقطع جلد الفك السفلي من الشفة السفلية باتجاه خط العنق.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام شفرة جراحية # 15 لإجراء الشق والتشريح اللاحق (الخطوات 2.3.6-2.3.9).
    5. أثناء إجراء الشق ، انشر الجلد المقطوع باستخدام الإبهام والسبابة لكشف العضلات وعظم الفك تحتها.
    6. استخدم شفرة الحلاقة لقطع عضلات العضل على الجانب الشدقي من الفك السفلي ، بحيث يكون الجزء الخارجي من النصف الأيسر والأيمن خاليا الآن من ملحقات العضلات.
    7. قطع العضلات النخاعية اللامية على طول الجانب الداخلي من الفك السفلي لإزالة المرفقات العضلية هناك.
    8. قم بعمل شق آخر في ارتفاق الفك السفلي الذي يربط بين نصفي الدم. بمجرد القطع ، سيتم فصل الفك السفلي إلى النصفين الأيسر والأيمن.
    9. إسفين شفرة الحلاقة بين لقمة الفك السفلي ومفصل الفك السفلي الصدغي وتشريح بعناية من hemimandible من بقية الرأس.
      ملاحظة: وجدنا أنه من المفيد سحب القاطعة برفق في نفس الوقت أثناء القطع. يجب توخي الحذر لتجنب كسر الفك السفلي وإتلاف الأنسجة الرخوة بداخله.
  4. انقل الفك السفلي المقطعي على الفور إلى طبق بتري باستخدام وسائط التشريح الدافئة (الخطوة 1.1) وقم بإزالة الأنسجة العضلية المتبقية باستخدام شفرة جراحية # 15.
    ملاحظة: يؤدي الاحتفاظ بالعينات في الوسائط الباردة إلى إبطاء أنشطة الخلايا ، مما يؤدي إلى تأخير أو حتى فشل عمليات استرداد بعض أنشطة الخلايا ، مثل التكاثر أو حركة الخلايا ، أثناء التصوير الحي.

3. عزل قواطع الماوس بأكملها

ملاحظة: يتم إجراء مزيد من العزل للقواطع تحت مجهر تشريح المجال الساطع.

  1. حدد بصريا المنطقة البيضاوية من الفك السفلي التي تغطي مقبس القاطعة وتضم الجزء القمي من القاطعة.
  2. ضع الفك السفلي بحيث يكون السطح الداخلي (اللساني) متجها لأعلى.
  3. أثناء تثبيت الفك السفلي في مكانه باستخدام ملقط مسنن ، قم بإنشاء نافذة في المنطقة البيضاوية عن طريق حلق عظم الغشاء المغطي باستخدام شفرة جراحية # 15 ، في اتجاه من اللقمة نحو الأضراس. هذا يكشف الأنسجة الرخوة للقاطعة القمية على السطح الداخلي.
  4. اقلب الفك السفلي بحيث يكون السطح الخارجي (الشدق) متجها لأعلى.
  5. قم بإنشاء نافذة في المنطقة البيضاوية على الفك السفلي الخارجي كما هو موضح في الخطوة 3.3 واستخدم طرف المشرط لالتقاط أي شظايا عظمية متبقية عند الحافة. تأكد من أن الطرف القمي للسن مرئي من كلا الجانبين.
    ملاحظة: تجنب الضغط المفرط أثناء حلق العظام لمنع تلف الأنسجة الرخوة الأساسية.
  6. قطع العظام المحيطة بالقاطعة بشكل منهجي لعزل السن بأكمله.
    1. قم بعمل قطع نظيف في مستوى مجاور مباشرة للقاطعة القمية لإزالة عملية اللقمة أولا.
      ملاحظة: احرص على عدم قطع القاطعة.
    2. جعل قطع الثانية فقط الخلفي إلى الضرس 3 ، ولكن الظهرية إلى القاطعة دون الإضرار بالسن. هذا يزيل العظم الذي يتضمن عملية الإكليل.
    3. قطع متسلسل من طرف العملية الزاوية نحو القاطعة لإزالة الفك السفلي البطني تدريجيا بطريقة تدريجية.
      ملاحظة: غالبا ما تكون ظهارة الأسنان وأنسجة اللثة المرتبطة بها عالقة في العظم ويمكن اقتلاعها بسهولة إذا تم قطع جزء كبير من العظم البطني دفعة واحدة. لفصل العظم عن الأنسجة الرخوة القاطعة ، يمكن للمرء إدخال المشرط (أو زوج من الملقط الحاد غير المسنن) بين النسجين في الطرف القمي للقاطعة وتحريك الأداة بدقة للأمام.
    4. قطع العظم السنخي مع الأضراس وأي عظام متبقية لا تزال متصلة بالقاطعة.
    5. القاطعة بأكملها معزولة الآن. انقل القاطعة التي تم تشريحها بالكامل إلى طبق به وسائط تشريح دافئة ونظيفة (الخطوة 1.1).
  7. كرر الخطوات من 3.2 إلى 3.6 لعزل القواطع الإضافية حسب الحاجة.
    ملاحظة: تحافظ القواطع الفكية / العلوية للفأر أيضا على الخلايا الجذعية البالغة ويمكن استخدامها لدراسة تجديد الأسنان34. يركز باحثو طب الأسنان عادة على القواطع السفلية لأنها أكثر سهولة ويمكن تشريحها بسهولة أكبر من القواطع العلوية. لا يزال يتعين تحديد الاختلافات بين الخلايا السلفية القاطعة للفك السفلي والفك العلوي.

4. إزالة أنسجة اللثة لفضح حلقة عنق الرحم الظهارية القاطعة

  1. مع وضع القاطعة بأكملها على جانبها اللساني وأثناء تثبيت السن في مكانه باستخدام ملقط مسنن ، استخدم زوجا من الملقط الناعم # 5 لبدء دس أنسجة اللثة التي تغطي القاطعة القمية ومنطقة حلقة عنق الرحم.
  2. انزع بعناية أنسجة اللثة من البرعم القمي ، بحيث يصبح الجانب الجانبي من حلقة عنق الرحم (أو مناطق أخرى ذات أهمية) مرئيا تحت النطاق.
    ملاحظة: يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف ظهارة الأسنان أو فصلها عن اللحمة المتوسطة. إذا كان القواطع تحتوي على إشارات مضان في المنطقة محل الاهتمام ، وكان مجهر تشريح الفلورسنت متاحا ، فيمكن استخدام إشارات التألق للمساعدة في التمييز بين أنواع الأنسجة وتشريح المساعدة. من المهم تنفيذ الأقسام 2-4 بكفاءة حتى يمكن نقل العينات بسرعة إلى وسط الاستزراع وصيانتها بشكل كاف من خلال الاستزراع المزروع (انظر أدناه).

5. تضمين الأنسجة لثقافة النبات

  1. أضف 500 ميكرولتر من جل الاستزراع الدافئ غير الصلب إلى بئر في صفيحة مكونة من 24 بئرا وانقل القواطع الكاملة المشرحة بسرعة إلى البئر. قم بتدوير اللوحة عدة مرات لشطف القواطع.
  2. أضف 400 ميكرولتر من جل الثقافة الدافئ غير الصلب إلى طبق الاستزراع وانقل القواطع المغسولة إلى الطبق.
    ملاحظة: نستخدم طبق استزراع متوفر تجاريا ومتوافق مع إعداد التروية. راجع الخطوة 6.4 للحصول على خيارات بديلة.
  3. قم بتوجيه القاطعة لوضع منطقة حلقة عنق الرحم (أو مناطق أخرى ذات أهمية) في وسط الطبق (الشكل 2 أ ، ب) واضبط إمالة القاطعة القمية لمستوى التصوير المطلوب.
    ملاحظة: يجب أن يتم توجيه الأنسجة بسرعة قبل الهلام الكامل.
  4. بعد ضبط الجل ، استخدم زوجا من الملقط الدقيق لإزالة أي هلام أعلى المنطقة محل الاهتمام حتى لا يتم تغطيته بالهلام.
  5. أضف كمية كافية من وسائط الاستزراع الدافئة عن طريق سحبها ببطء على حافة الطبق لتغطية العينة فقط (~ 150 ميكرولتر).
  6. انقل مزرعة الزرع إلى حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية للسماح باستقرار الأنسجة والتكيف مع حالة المزرعة لمدة 1 ساعة.

6. الفحص المجهري الفاصل الزمني لمحطات القواطع

ملاحظة: في هذه التجربة ، استخدمنا مجهرا رأسيا مزودا بهدف غمس الماء 25x بفتحة عددية تبلغ 1. بشكل عام ، تعد عدسة غمس الماء ذات الفتحة العددية العالية هي الأنسب لتصوير الأنسجة العميقة.

  1. قم بتشغيل المجهر والليزر ثنائي الفوتون.
  2. ثبت طبق الاستزراع بمحول المسرح وقم بتركيب حلقة محول التروية في الأعلى (الشكل 2 ج).
  3. قم بتوصيل محول المرحلة بجهاز التحكم في درجة الحرارة المحدد للحفاظ على الثقافة عند 37 درجة مئوية.
  4. قم بتوصيل مدخل ومخرج حلقة المحول بمضخة التروية الدقيقة وابدأ نضح وسط الاستزراع ، مع ضبط سرعة التروية على 20 على المضخة. وهذا يولد تدفقا بطيئا (~ 5 مل / ساعة) لوسط الاستزراع فوق الجزء العلوي من العينات (الشكل 2C).
    ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول النظام للحفاظ على الأنسجة في بيئة يتم التحكم فيها بثبات. يمكن استخدام أنظمة أخرى أيضا. يمكن أيضا استخدام مزيج من صفيحة تسخين 37 درجة مئوية وطبق استزراع التروية محلي الصنع (الشكل التكميلي S1) مع مدخل ومخرج متصل بمضخات الحقن.
  5. ضع حلقة حاجز التحكم في الغلاف الجوي (ACBR) أعلى حلقة المحول وقم بخفض الهدف من خلال ACBR لمجرد الاتصال بوسط الاستزراع (الشكل 2D).
  6. اضبط الطول الموجي لليزر على 920 نانومتر لتصور كل من إشارات GFP والتألق الأحمر (على سبيل المثال ، tdTomato).
  7. حدد موقع العينات من خلال العدسات ثم على برنامج المجهر.
  8. قم بإعداد مكدسات Z والتصوير متعدد المواضع والفترات الزمنية باستخدام البرنامج. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم حجم z-step يبلغ 4 ميكرومتر وفاصل زمني قدره 5 دقائق لمدة 14 ساعة.
    ملاحظة: وجدنا أن الفاصل الزمني الذي يزيد عن 5 دقائق غالبا ما يكون غير كاف لالتقاط حركات الخلايا الملساء والانقسامات.
  9. بدء التصوير بفاصل زمني.
    ملاحظة: قد يتغير موضع العينة خلال الساعة الأولى وقد يلزم إجراء مزيد من التعديلات.
  10. حفظ الملفات لمعالجة البيانات النهائية وتحليلها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم تغليف المنطقة القمية لقواطع الفأر البالغة داخل الفك السفلي (الشكل 1) ، وبالتالي ، لا يمكن الوصول إليها مباشرة لتصور الخلايا السلفية المقيمة داخل منطقة النمو وتتبعها مباشرة. لذلك ، قمنا بتطوير طريقة لاستخراج القاطعة بأكملها من عظم الفك والحفاظ عليها في نظام استزراع نباتي للفحص المجهري ثنائي الفوتون (الشكل 2). هنا نصف النتائج التمثيلية التي تلتقط العملية الديناميكية لتكاثر الخلايا وحركتها في منطقة حلقة عنق الرحم الشفوية في ظهارة الأسنان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد تصوير الأنسجة الحية تقنية مهمة تسمح لنا بدراسة العمليات والسلوكيات الديناميكية للخلايا عند الحفاظ عليها في بيئتها المتخصصة41. من الناحية المثالية ، يتم إجراء التصوير المباشر في الجسم الحي بدقة مكانية زمانية عالية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التصوير في الجسم الحي لأعضاء الثدييات أمرا صعبا بسبب عدم إمكانية الوصول إلى الأنسجة ، والتعتيم البصري ، وصعوبة شل حركة أو العضو لفترة طويلة42. تتجاوز نباتات الأنسجة بعض هذه التحديات وقد تم اعتمادها بنجاح في عدد من الدرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

نحن نعترف بمختبر الفحص المجهري / الطيفي المتقدم بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ومركز التميز Leica Microsystems في معهد كاليفورنيا للأنظمة النانوية (RRID: SCR_022789) لتوفير مجهر ثنائي الفوتون. تم دعم AS من قبل ISF 604-21 من مؤسسة العلوم الإسرائيلية. تم دعم JH من قبل R03DE030205 و R01DE030471 من المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR. كما تم دعم AS و JH من خلال 2021007 المنح من مؤسسة العلوم ثنائية القومية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (BSF).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
24 بئر ، لوحة ثقافة الأنسجة ذات القاع المسطحأوليمبوس بلاستيك25-107
25x HC IRAPO motCORR هدف غمس الماءLeica11507704
حمض الأسكوربيك (فيتامين C)Acros Organics352685000
D- (+) - الجلوكوز bioxtra   ؛نظام Sigma AldrichG7528
Delta T Bioptechs0420-4بما في ذلك التحكم في درجة الحرارة وأطباق الاستزراع وإعداد التروية
مجهر التشريح- LEICA S9ELeica LED300 SLI
DMEM / F12الوسائط القاعدية11039047الحرارية العلمية بدون شفرة
جراحية بالريش الأحمر الفينول (# 15)الريشة72044-15
ملقط ناعمFST11252-23
Glutamax Thermo Scientific35050-061بديل الجلوتامين
Leica SP8-Dive مجهز بهدف غمس الماء 25X HC IRAPO MOTCORR  Leican / a
الاغاروز منخفض الذوبانNuSieve50080
الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)Thermo Scientific11140-050
البنسلين & ndash ؛ ستربتومايسينثيرمو ساينتيك1514012210,000 وحدة / مل   ؛
طبق بتريGen Clone32-107G90 mm 
AS3061SCمصل الفئرانوادي الطب الحيويمعالج للتصوير الحي
شفرة الحلاقة # 9VWR55411-050
مقبض مشرطFST10003-12
مقصFST37133
ملقط مسننFST11000-13
مقص زنبركيFS91500-09

المراجع

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494(2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378(2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918(2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818(2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336(2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405(2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685(2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969(2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51(2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816(2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403(2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استخدام التصوير الحي خارج الجسم الحي للتحقيق في انقسامات الخلايا وحركاتها أثناء تجديد أسنان الفأر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.