هنا ، نقدم البروتوكول الأول للتسلل الفراغي الموضعي للدراسات في الجسم الحي للتحول الوراثي للنباتات كبيرة الحجم. باستخدام هذه المنهجية ، حققنا لأول مرة التحول العابر للكاكاو بوساطة Agrobacterium في النبات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التسلل الزراعي القسري بالفراغ للتحول في النبات للنباتات المتمردة: الكاكاو كدراسة حالة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عابر في تحول النبات هو بديل سريع وفعال من حيث التكلفة للتحول الوراثي للنبات. تعتمد معظم بروتوكولات التحول في النبات على استخدام التحول بوساطة Agrobacterium. ومع ذلك ، فإن البروتوكولات المستخدمة حاليا موحدة للنباتات الصغيرة الحجم بسبب القيود المادية والاقتصادية لإخضاع النباتات كبيرة الحجم للمعالجة الفراغية. يقدم هذا العمل بروتوكولا فعالا للتسلل الزراعي الموضعي القائم على الفراغ المخصص للنباتات كبيرة الحجم. لتقييم فعالية الطريقة المقترحة ، اختبرنا استخدامها في نباتات الكاكاو ، وهي أنواع نباتية استوائية متمردة على التحول الجيني. سمح بروتوكولنا بتطبيق ما يصل إلى 0.07 ميجا باسكال فراغ ، مع التكرار ، على جزء جوي موضعي من أوراق الكاكاو ، مما يجعل من الممكن إجبار تسلل Agrobacterium إلى المساحات بين الخلايا للأوراق المرفقة. نتيجة لذلك ، حققنا عابر بوساطة Agrobacterium في تحويل النبات لأوراق الكاكاو المرفقة التي تعبر عن نظام مراسل RUBY. هذا هو أيضا أول Agrobacterium بوساطة في تحول النبات العابر للكاكاو. سيسمح هذا البروتوكول بتطبيق طريقة الترشيح الزراعي القائمة على الفراغ على الأنواع النباتية الأخرى ذات القيود المماثلة في الحجم ويفتح الباب أمام توصيف الجينات في النبات في الأنواع الخشبية الكبيرة الحجم المتمردة.
المقدمة
تعد طرق التحول الوراثي للنبات ضرورية لاختبار الوظائف البيولوجية للجينات وهي مفيدة بشكل خاص اليوم نظرا للعدد الكبير من الجينات غير المميزة المتوقعة في عصر ما بعد الجينوم1. يمكن استخدام هذه الطرق للحصول على خطوط محولة بالكامل أو للتعبير عن الجينات بشكل عابر. يحدث التحول المستقر عندما يصبح الحمض النووي الأجنبي الذي تناوله المضيف مدمجا بشكل كامل ولا رجعة فيه في جينوم المضيف ، ويتم نقل التعديلات الجينية إلى الأجيال اللاحقة. يحدث التعبير العابر ، المعروف باسم التحول العابر ، من النسخ المتعددة من T-DNA المنقولة بواسطة Agrobacterium إلى الخلية ، والتي لم يتم دمجها في الجينوم المضيف ، ويبلغ ذروته بعد 2-4 أيام من الإصابة2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. ثقافة أجروباكتريوم توميفاسينس
- ذوبان الخلايا الكهربائية من سلالة Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
- أضف 1 مل من شعير الخميرة (YM; الجدول 1) مرق إلى أنبوب ثقافة 17 مم × 100 مم. احفظ هذا الأنبوب لوقت لاحق ، واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة (RT).
- في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 مل ، أضف 30 ميكرولتر من خلايا Agrobacterium المذابة و 100-250 نانوغرام (حتى 5 ميكرولتر) من الحمض النووي الذي يحتوي على 35S: RUBY. تخلط بلطف.
ملاحظة: كان 35S: RUBY هدية من يوندي تشاو. لتجنب انحناء العينة ، قلل من وجود المركبات الأيونية قدر الإمكان. قد تكون هذه المركبات الأيوني....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة للتسلل الزراعي للنباتات الخشبية كبيرة الحجم. باستخدام هذا البروتوكول ، تمكنا من تحقيق ضغط فراغ يبلغ -0.07 ميجا باسكال ، مما أدى إلى تسلل فعال وموضعي لأوراق الكاكاو. في الشكل 4 ، نلاحظ عملية إعداد نظام التسلل ، وفي الشكل 5 ، التكوين النهائي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا العمل ، قدمنا بروتوكول تسلل زراعي فعال ومنخفض التكلفة للتحول العابر للنباتات الخشبية في النبات ، باستخدام نباتات الكاكاو كمثال. بالنظر إلى القيد المعروف الذي تمثله بشرة الأوراق لتحويل الأنسجة النباتية ، ركزنا على تطوير استراتيجية لتسهيل التسلل الزراعي عن طريق الفراغ في النباتات الخشبية ، والتي عادة ما تكون متمردة على هذا الإجراء.
كان ضغط الفراغ الذي تم تحقيقه داخل غرفة التفريغ ممكنا فقط بسبب الختم الفعال وملء الفجوات الصغيرة التي تم إنشاؤها بين المجفف ، وفرع الشجرة ، والحشية / .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.
شكر وتقدير
نشكر ليك. خيسوس فوينتيس غونزاليس ونستور إيفان روبلز أوليفاريس لمساعدتهما في تصوير لقطات الفيديو. نعترف بالهدايا السخية التي قدمتها الدكتورة أنطونيا جوتيريز مورا من CIATEJ (نباتات الكاكاو Theobroma ). كما نشكر CIATEJ و Laboratorio Nacional PlanTECC ، المكسيك ، على دعم المرافق. 1135375 وأجرى المعهد دراسات ماجستير بتمويل من المجلس الوطني للإنسانيات والعلوم والتكنولوجيا في المكسيك (CONAHCYT). تعترف RUL بالدعم المقدم من المجلس الحكومي للعلوم والتكنولوجيا في خاليسكو (COECYTJAL) ، وأمانة الابتكار العلمي والتكنولوجيا (SICYT) ، خاليسكو ، المكسيك (منحة 7270-2018).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 35S: RUBY< / em> البلازميد | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID: Addgene_160908 |
| 1 مم كوفيت التثقيب الكهربائي | Thermo Fisher Scientific ؛ | FB101 | Fisherbrand مجفف التجميد الكهربائي بالإضافة |
| مجفف | بيل آرت SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| مجفف التجميد | LABCONCO | 700402040 | |
| K2< / sub>HPO4< / sub> | Sigma Aldrich | P8281-500G | لمتوسط YM أضف 0.38 جم / لتر |
| السليم للبكتيريا الزراعية المختصة | بالكهرباء الولايات المتحدة الأمريكية | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | بالنسبة لمتوسط YM ، أضف 10 جم / لتر |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (ل LB و YM ووسط إعادة التعليق) أضف 1.95 جم / لتر (10 ملم) MgCl |
| 2< / sub> | Sigma Aldrich | M8266 | لمتوسط إعادة التعليق أضف 0.952 جم / لتر (10 ملم) |
| MgSO4& middot; 7H2< / sub>0 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | لمتوسط YM أضف 0.204 جم / لتر |
| جهاز التثقيب الكهربائي MicroPulser | Biorad ؛ | 165-2100 | |
| كلوريد الصوديوم | كارال | 60552 | للرطل المتوسط أضف 5 جم / لتر ؛ بالنسبة لمتوسط YM ، أضف 0.1 جم / لتر |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific ؛ | 13-400-518 | |
| رئيس سيليكون انطباع المواد | كولتين | 60019938 | |
| ريفامبيسين ؛ | Gold-Bio | R-120-1 | (100 مجم / مل) |
| مسدس مادة انطباع السيليكون | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 مجم / مل) |
| ستربتومايسين | جولد-بيو | S-150-SL10 | (100 مجم / مل) |
| هضم إنزيمي التريبتون من الكازين | سيجما ألدريتش | 95039-1KG-F | لمتوسط LB أضف 10 جم / لتر |
| خميرة استخراج | MCD LAB | 9031 | لمتوسط LB أضف 5 جم / لتر ؛ بالنسبة لمتوسط YM ، أضف 0.4 جم / لتر |
المراجع
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
