مقالة منهجية

عرض توضيحي لثقافة ورقة الخلايا المجمعة ذاتيا والتوليد اليدوي لوتر 3D / الأربطة الشبيهة بالعضوية باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية

3.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66047

⸱

يونيو 21, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Musculoskeletal Tissue Regeneration, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg, 2Laboratory for Experimental Trauma Surgery, Department of Trauma Surgery, University Hospital Regensburg, 3Department of Orthopaedics, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نعرض نموذجا عضويا من ثلاث خطوات (توسع ثنائي الأبعاد [2D] ، تحفيز ثنائي الأبعاد ، نضج ثلاثي الأبعاد [3D]) يقدم أداة واعدة للبحث الأساسي في الأوتار وطريقة محتملة خالية من السقالات لهندسة أنسجة الأوتار.

الملخص

الأوتار والأربطة (T / L) هي هياكل قوية منظمة هرميا توحد الجهاز العضلي الهيكلي. تحتوي هذه الأنسجة على مصفوفة خارج الخلية غنية بالكولاجين من النوع الأول (ECM) وخلايا سلالة T / L مرتبة بشكل أساسي في صفوف متوازية. بعد الإصابة ، يتطلب T / L وقتا طويلا لإعادة التأهيل مع مخاطر فشل عالية ونتائج إصلاح غير مرضية في كثير من الأحيان. على الرغم من التطورات الحديثة في أبحاث بيولوجيا T / L ، فإن أحد التحديات المتبقية هو أن مجال T / L لا يزال يفتقر إلى بروتوكول تمايز موحد قادر على تلخيص عملية تكوين T / L في المختبر. على سبيل المثال ، يتطلب تمايز العظام والدهون لخلايا السلائف الوسيطة فقط زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد القياسية (2D) وإضافة وسائط تحفيز محددة. للتمايز مع الغضاريف ، من الضروري زراعة الحبيبات ثلاثية الأبعاد (3D) ومكملات TGFß. ومع ذلك ، فإن تمايز الخلايا إلى الأوتار يحتاج إلى نموذج ثقافة 3D منظم للغاية ، والذي يجب أن يكون مثاليا أيضا خاضعا للتحفيز الميكانيكي الديناميكي. لقد أنشأنا نموذجا عضويا من 3 خطوات (التوسع والتحفيز والنضج) لتشكيل هيكل يشبه قضيب 3D من ورقة خلية مجمعة ذاتيا ، والتي توفر بيئة دقيقة طبيعية مع عوامل ECM و autocrine و paracrine الخاصة بها. تتميز هذه الكائنات العضوية الشبيهة بالقضيب ببنية خلوية متعددة الطبقات داخل ECM الغنية ويمكن التعامل معها بسهولة تامة للتعرض للإجهاد الميكانيكي الثابت. هنا ، أظهرنا البروتوكول المكون من 3 خطوات باستخدام الخلايا الليفية الجلدية المتاحة تجاريا. يمكننا أن نظهر أن هذا النوع من الخلايا يشكل عضويات قوية ووفيرة من ECM. يمكن تحسين الإجراء الموصوف بشكل أكبر من حيث وسائط الثقافة وتحسينه نحو التحفيز الميكانيكي المحوري الديناميكي. بنفس الطريقة ، يمكن اختبار مصادر الخلايا البديلة لقدرتها على تكوين عضويات T / L وبالتالي الخضوع لتمايز T / L. باختصار ، يمكن استخدام نهج 3D T / L العضوي المعمول به كنموذج للبحوث الأساسية للأوتار وحتى لهندسة T / L الخالية من السقالات.

المقدمة

الأوتار والأربطة (T / L) هي مكونات حيوية للجهاز العضلي الهيكلي التي توفر الدعم الأساسي والاستقرار للجسم. على الرغم من دورها الحاسم ، فإن هذه الأنسجة الضامة عرضة للانحطاط والإصابة ، مما يسبب الألم وضعف الحركة1. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي إمدادهم المحدود بالدم وقدرتهم البطيئة على الشفاء إلى إصابات مزمنة ، في حين أن عوامل مثل الشيخوخة والحركة المتكررة وإعادة التأهيل غير السليمة تزيد من خطر التنكس والإصابة2. العلاجات التقليدية ، مثل الراحة والعلاج الطبيعي والتدخلات الجراحية ، غير قادرة على استعادة هيكل T / L ووظيفته بالكامل. على مدى السنوات القليلة الماضية ، سعى الباحثون إلى فهم الطبيعة المعقدة ل T / L بشكل أفضل من أجل البحث عن علاجات فعالة لاضطرابات T / L3،4،5. تتميز T / L بهيكل منظم هرميا تهيمن عليه مصفوفة خارج الخلية (ECM) ، يتكون بشكل أساسي من ألياف الكولاجين من النوع الأول والبروتيوغليكان ، وهي ميزة يصعب تكرارها في المختبر6. تفشل نماذج زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) في التقاط التنظيم الثلاثي الأبعاد (3D) المميز لأنسجة T / L ، مما يحد من إمكاناتها الانتقالية بالإضافة إلى إعاقة التقدم المبتكر في مجال تجديد T / L.

في الآونة الأخيرة ، قدم تطوير نماذج 3D العضوية إمكانيات جديدة لتطوير البحوث الأساسية وهندسة الأنسجة الخالية من السقالات من أنواع الأنسجةالمختلفة 7،8،9،10،11،12،13. على سبيل المثال ، للتحقيق في تقاطع الأوتار العضلية ، طور Larkin et al. 2006 تركيبات العضلات الهيكلية ثلاثية الأبعاد جنبا إلى جنب مع شرائح الأوتار ذاتية التنظيم المشتقة من وتر ذيل الفئران10. علاوة على ذلك ، قام Schiele et al. 2013 ، باستخدام قنوات النمو المغلفة بالفبرونيكتين الدقيقة ، بتوجيه التجميع الذاتي للخلايا الليفية الجلدية البشرية لتشكيل ألياف خلوية دون مساعدة سقالة ثلاثية الأبعاد ، وهو نهج يمكنه التقاط السمات الرئيسية لتطور الأوتار الجنينية11. في الدراسة التي أجراها Florida et al. 2016 ، تم توسيع خلايا انسجة نخاع العظم لأول مرة إلى سلالات العظام والأربطة ، واستخدمت بعد ذلك لتوليد صفائح خلايا أحادية الطبقة مجمعة ذاتيا ، والتي تم تنفيذها بعد ذلك لإنشاء بنية عظمية متعددة الأطوار للأربطة والعظام تحاكي الرباط الصليبي الأمامي الأصلي ، وهو نموذج يهدف إلى تحسين فهم تجديد الرباط12. لتوضيح عمليات النقل الميكانيكي للوتر ، استخدم Mubyana et al. 2018 منهجية خالية من السقالات تم من خلالها إنشاء ألياف وتر واحد وإخضاعها لبروتوكول التحميلالميكانيكي 13. Organoids هي هياكل 3D ذاتية التنظيم تحاكي العمارة الأصلية والبيئة المكروية ووظائف الأنسجة. توفر الثقافات العضوية 3D نموذجا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة بيولوجيا الأنسجة والأعضاء وكذلك الفيزيولوجيا المرضية. يمكن أيضا استخدام هذه النماذج للحث على التمايز الخاص بالأنسجة لأنواع مختلفة من الخلايا الجذعية / السلفية14,15. وبالتالي ، فإن تنفيذ نماذج 3D العضوية في مجال بيولوجيا T / L وهندسة الأنسجة يصبح نهجا جذابا للغاية 9,16. يمكن تنفيذ مصادر الخلايا البديلة لتجميع العضوي وتحفيزها نحو التمايز التينوجيني. أحد أنواع الخلايا ذات الصلة المستخدمة للتوضيح في هذه الدراسة هو الخلايا الليفية الجلدية7،17،18. يمكن الوصول إلى هذه الخلايا بسهولة من خلال إجراء خزعة الجلد ، وهو أقل توغلا مقارنة بثقب نخاع العظم أو شفط الدهون ويمكن مضاعفتها بسرعة إلى حد ما إلى أعداد كبيرة بسبب قدرتها التكاثرية الجيدة. في المقابل ، فإن أنواع الخلايا الأكثر تخصصا ، مثل الخلايا الليفية المقيمة T / L ، أكثر صعوبة في العزل والتوسع. لذلك ، تم استخدام الخلايا الليفية الجلدية أيضا كنقطة انطلاق لتقنيات إعادة برمجة الخلايا نحو الخلايا الجذعية الجنينية المستحثةمتعددة القدرات 19. إن إخضاع الخلايا الليفية الجلدية لظروف ثقافة ثلاثية الأبعاد محددة وإشارات إشارات ، مثل تحويل عامل النمو بيتا 3 (TGFß3) ، والذي تم الإبلاغ عن أنه يعمل كمنظم رئيسي للعمليات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك تكوين وصيانة T / L ، يمكن أن يحفز تمايزها في المختبر مما يؤدي إلى التعبير عن جينات خاصة بالوتر وترسب T / L-typical ECM20 ، 21.

هنا ، نصف ونوضح بروتوكولا عضويا تم إنشاؤه وتنفيذه مسبقا من 3 خطوات (توسع ثنائي الأبعاد ، وتحفيز ثنائي الأبعاد ، ونضج ثلاثي الأبعاد) باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية العادية للبالغين (NHDFs) المتاحة تجاريا كمصدر للخلايا ، مما يقدم نموذجا قيما للدراسة في تكوين الوتر في المختبر 7. على الرغم من حقيقة أن هذا النموذج لا يعادل أنسجة T / L في الجسم الحي ، إلا أنه لا يزال يوفر نظاما أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية يمكن استخدامه للتحقيق في آليات التمايز الخلوي ، ومحاكاة الفيزيولوجيا المرضية T / L في المختبر ، وإنشاء T / L الطب الشخصي ومنصات فحص الأدوية. علاوة على ذلك ، في المستقبل ، يمكن للدراسات تقييم ما إذا كانت المواد العضوية 3D مناسبة لهندسة T / L الخالية من السقالات من خلال مزيد من التحسين وكذلك قابلة للاستخدام لتطوير تركيبات قوية ميكانيكيا موسعة تشبه إلى حد كبير الأبعاد والخصائص الهيكلية والفيزيائية الحيوية لأنسجة T / L الأصلية.

البروتوكول

ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات باستخدام تقنيات التعقيم.

1. الثقافة والتوسع المسبق ل NHDFs

  1. قم بإذابة قارورة التبريد التي تحتوي على الخلايا الليفية الجلدية البشرية الطبيعية المحفوظة بالتبريد (NHDFs ، 1 × 106 خلايا) بسرعة عند 37 درجة مئوية حتى تكاد تذوب الجليد.
  2. أضف ببطء 1 مل من وسط نمو الخلايا الليفية المسخنة مسبقا 2 (مجموعة جاهزة للاستخدام بما في ذلك الوسط القاعدي ، مصل ربلة الساق الجنيني 2٪ (FCS) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) والأنسولين) مع 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (قلم / بكتيريا (NHDF متوسط) ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية إلى الخلايا.
  3. نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. إزالة الطاف. أعد تعليق حبيبات الخلية في 12 مل من وسط NHDF المسخن مسبقا.
  5. انقل الخلايا إلى قارورة T-75 واهتز لفترة وجيزة بطريقة متقاطعة. ضع قارورة T-75 عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 .
  6. تغيير المتوسطة كل 2 أيام. راقب NHDFs تحت المجهر حتى تصل إلى التقاء 70٪ - 80٪.

2. توسيع 2D

  1. أخرج قارورة T-75 للحاضنة وأزل وسط NHDF. اغسل الخلايا بمحلول ملحي عازل للفوسفات (PBS).
  2. أضف 3 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA إلى الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 حتى تنفصل الخلايا عن القارورة (حوالي 3 دقائق).
  3. أضف 6 مل من وسط NHDF المسخن مسبقا لتحييد عمل التربسين. نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT وإزالة الطاف.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلايا في وسط النسور المعدلة (DMEM) منخفض الجلوكوز من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، 1x أحماض أمينية MEM ، 1٪ قلم / بكتيريا ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
  6. طبق NHDFs في طبق زراعة الخلايا الملتصقة 10 سم بكثافة 8 × 103 NHDFs / سم2 (في المجموع ، 4.4 × 105 NHDFs لكل طبق 10 سم). صخرة بلطف بطريقة متقاطعة.
  7. ضع طبق زراعة الخلايا 10 سم على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 . تغيير الوسيط كل 2 أيام
  8. راقب الخلايا تحت المجهر حتى تصل إلى التقاء 100٪ (حوالي 5 أيام).

3. تحفيز 2D

  1. أخرج أطباق زراعة الخلايا 10 سم التي تحتوي على NHDFs (من الخطوتين 2.6 و 2.7) من الحاضنة. قم بإزالة وسط الثقافة وغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا.
  2. أضف 10 مل من وسط DMEM عالي الجلوكوز المكمل ب 10٪ FBS و 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك و 1٪ قلم / بكتيريا ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
  3. ضع طبق بتري على حرارة 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 . تغيير المتوسطة كل 2 أيام.
  4. مراقبة NHDFs تحت المجهر لمدة 14 يوما.

4. 3D النضج

  1. أخرج طبق زراعة الخلايا 10 سم من الحاضنة وأزل وسط الجلوكوز العالي DMEM.
  2. افصل ورقة الخلية المشكلة برفق وبسرعة عن الطبق باستخدام مكشطة خلية. أثناء الانفصال ، قم بلف ورقة الخلية في وقت واحد إلى عضوي يشبه قضيب 3D.
  3. التقط وضع عضويات NHDF في طبق بتري غير ملتصق (للخلايا) بطول 10 سم. يستخدم هذا النوع من الأطباق لتجنب هجرة الخلايا من العضو العضوي إلى البلاستيك.
  4. في هذه النقطة الزمنية أو بعد يوم واحد (اليوم 0 أو اليوم 1 من النضج ثلاثي الأبعاد) ، اجمع بعض الكائنات العضوية لمزيد من التحليلات مثل الوزن الرطب والتقييم النسيجي (يفضل استخدام المواد العضوية في اليوم 1 لأنها تصبح أكثر إحكاما) والحمض النووي الريبي وعزل البروتين.
  5. إصلاح حواف العضو العضوي مع دبابيس معدنية على النحو التالي:
    1. امسك جانبا واحدا من العضو العضوي بعناية باستخدام ملقط ، وباستخدام ملقط آخر ، قم بتطبيق التمدد اليدوي برفق بنسبة 10٪ تقريبا من الاستطالة المحورية. لتقدير الاستطالة المحورية بنسبة 10٪ ، استخدم ورقة ملليمتر أو مسطرة.
    2. بعد ذلك ، التقط دبوسا معدنيا واحدا باستخدام الملقط واضغط يدويا لأسفل من خلال الحافة العضوية في الطبق البلاستيكي لإصلاحه. كرر هذا الإجراء مع الدبوس الثاني على الحافة الثانية من العضو العضوي.
  6. أضف 10 مل من وسط DMEM عالي الجلوكوز المكمل ب 10٪ FBS ، 1x أحماض أمينية MEM ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، 10 نانوغرام / مل TGFß3 ، و 1٪ قلم / بكتيريا ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
  7. ضع طبق 10 سم على حرارة 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 . تغيير المتوسطة كل 2 أيام.
  8. راقب المواد العضوية بانتظام لمدة 14 يوما.
    ملاحظة: قد ترتخي الدبابيس ، وبالتالي إعادة الإصلاح باستخدام نفس الأسلوب الموضح في الخطوة 4.5.
  9. بعد 14 يوما ، قم بإزالة وسط الجلوكوز العالي DMEM من المواد العضوية. اغسل المواد العضوية باستخدام برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا.
  10. قم بقياس المواد العضوية للوزن الرطب في اليوم 0 واليوم 14 باستخدام مقياس دقيق.
    1. ضع طبقا فارغا طوله 10 سم على الميزان واجعل الوزن صفرا لضمان قياس وزن الكائنات العضوية فقط. قم بإزالة وسط الاستزراع بالكامل من طبق 10 سم وقم بقياس الوزن الرطب العضوي واحدا تلو الآخر.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، في اليوم 0 ، تم وزن ثلاثة عضويات لكل متبرع ، وفي اليوم 14 ، تم وزن عضوين لكل متبرع.
  11. وفقا لأغراض الدراسة ، قم بتنفيذ بعض المواد العضوية NHDF في مزيد من التحليلات النسيجية أو قم بتجميدها على الفور في النيتروجين السائل باستخدام أنابيب معقمة خالية من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين اللاحق ثم تخزينها عند -80 درجة مئوية.
  12. للتحقيق النسيجي ، ثبت كل عضو عضوي في 5 مل من بارافورمالدهيد المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) 4٪ في PBS (معدل إلى درجة الحموضة المحايدة) لمدة 45 دقيقة على الجليد ، متبوعا بغسل PBS في RT (2 × 5 دقائق لكل منهما).
  13. قم بحماية المواد العضوية الثابتة بالتبريد باستخدام تدرج السكروز عن طريق وضع الكائنات العضوية في عبوات زجاجية للأنسجة. احتضان المواد العضوية في 10٪ سكروز في محلول PBS لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية ، بعد 20٪ سكروز / PBS لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية ، وأخيرا ، 30٪ سكروز / PBS بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. قم بتغيير محاليل السكروز عن طريق سحب المحلول أولا ثم ملئه بالمحلول الجديد.
  14. قم بتضمين المواد العضوية في وسط التبريد.
    1. ضع طبقا نحاسيا على ثلج جاف في صندوق الستايروفوم واتركه يبرد لمدة 10 دقائق.
    2. بعد ذلك ، ضع قالب تبريد بلاستيكي ، مملوء مسبقا بوسط التبريد ، على الصفيحة النحاسية واضغط برفق على العضو العضوي في أسفل cryomold باستخدام الملقط. انتظر حتى يتم تجميد cryomedium بالكامل.
    3. بالنسبة للمواد العضوية الطويلة ، قم أولا بقصها إلى نصفين بمشرط ووضع النصفين بالتوازي مع بعضهما البعض في cryomold. كرر الإجراء لكل عضوي يهدف إلى الخضوع للتحليل النسيجي.
  15. قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستئصال بالتبريد.
  16. باستخدام cryotome ، قم بقطع المواد العضوية طوليا في أقسام بسمك 10 ميكرومتر وتخضع للتلطيخ النسيجي مثل الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) باستخدام البروتوكول القياسي8.

النتائج

تم إنشاء نموذج 3D T / L العضوي مسبقا وإثباته هنا من خلال تنفيذ NHDF المشتراة تجاريا (ن = 3 ، 3 عضويات لكل متبرع ، تم استخدام NHDF في الممرات 5-8). يتم تلخيص سير عمل النموذج في الشكل 1. يوضح الشكل 2 صورا تمثيلية لتباين الطور لثقافة NHDF أثناء ما قبل التوسع في قوارير T-75 (الشكل 2A) وكذلك في بداية وبعد 5 أيام من الاستزراع في خطوة التمدد ثنائية الأبعاد في أطباق زراعة الخلايا 10 سم (الشكل 2B). يوضح الشكل 2C (صور تباين الطور التمثيلية) التقاء NHDFs أثناء التحفيز ثنائي الأبعاد بعد 14 يوما من المزرعة في أطباق زراعة الخلايا 10 سم. بعد ذلك ، تم فصل صفائح الخلايا يدويا وتدحرجت في وقت واحد إلى عضويات تشبه قضيب 3D (في اليوم 0 ، يبلغ طول العضو حوالي 6 سم ، وعرضه حوالي 0.4 سم) ، والتي تمت زراعتها تحت توتر ثابت بنسبة 10٪ لمدة 14 يوما (الشكل 3 ، اليوم 0 واليوم 14 ، صور عيانية تمثيلية). بحلول اليوم 14 من عملية النضج ثلاثية الأبعاد ، أظهرت الكائنات العضوية مظهرا أبيض لامعا ، وتقلصت ، وبدت أكثر كثافة من الكائنات العضوية الأولية. تم قياس الوزن الرطب للعضويات في وقت التكوين (اليوم 0) ومرة أخرى في اليوم 14 من خطوة النضج ثلاثية الأبعاد (الشكل 4). لوحظ انخفاض كبير في الوزن الرطب ، مما يشير إلى الانكماش وإعادة التنظيم الهيكلي ل ECM داخل الكائنات العضوية خلال الفترة الزمنية لخطوة البروتوكول هذه. بالإضافة إلى تغير الوزن ، بسبب الانكماش ، انخفض طول العضو أيضا (في اليوم 14 ، يبلغ طول العضو حوالي 3.5 سم ، والعرض حوالي 0.3 سم). في هذه العملية ، تم فك المسامير المعدنية وكان لا بد من إعادة تثبيتها ؛ وبالتالي ، خلال 14 يوما من النضج ثلاثي الأبعاد ، نوصي بمراقبة المواد العضوية بشكل متكرر. لتقييم مورفولوجيا المواد العضوية ، تم الحصول على مقاطع طولية من عضويات NHDF التي تم جمعها في اليوم 1 واليوم 14 من خطوة النضج ثلاثية الأبعاد وتعرضت لتلطيخ H& E (الشكل 5). في اليوم 1 ، عرضت الكائنات العضوية طبقات منفصلة ، تتكون بشكل أساسي من خلايا محاطة بكميات منخفضة من ECM. علاوة على ذلك ، لم يتم محاذاة الخلايا داخل الطبقات العضوية على طول المحور العضوي الطولي المستخدم كاتجاه لحمل الشد الثابت المطبق. أظهرت نوى NHDF شكلا دائريا بأحجام وأشكال مختلفة. كشف تحليل H&E لليوم 14 من الكائنات العضوية عن زيادة ملحوظة في إشارة eosin ، مما يشير إلى ترسب ECM أثناء عملية النضج ثلاثية الأبعاد. في هذه المرحلة الزمنية ، أظهرت الكائنات العضوية طبقات منصهرة ، مع مناطق تحتوي على خلايا محاذاة. كانت الخلايا في كثير من الأحيان في مجموعات. ومع ذلك ، تم تنظيمهم أيضا في صفوف الخلايا في بعض المواقع. كان لغالبية النوى أحجام متشابهة وأحيانا كانت ممدودة.

figure-results-1
الشكل 1: رسم كاريكاتوري لنموذج عضوي ثلاثي الأبعاد T / L يتكون من 3 خطوات: تمدد ثنائي الأبعاد ، وتحفيز ثنائي الأبعاد ، ونضج ثلاثي الأبعاد. في البداية ، تم توسيع NHDFs مسبقا في قارورة T-75 حتى وصلت إلى التقاء 70٪ -80٪. بعد ذلك ، تمت زراعة NHDFs باستخدام وسط النسور المعدلة (DMEM) منخفض الجلوكوز من Dulbecco في طبق زراعة الخلايا 10 سم لمدة 5 أيام (توسع 2D). ثم تم تحفيز الخلايا باستخدام وسط الجلوكوز العالي DMEM المكمل بحمض الأسكوربيك لمدة 14 يوما من الثقافة (تحفيز ثنائي الأبعاد). بعد ذلك ، تم فصل NHDF عن الطبق الملتصق بطول 10 سم ، ولفه في عضوي ثلاثي الأبعاد يشبه القضيب ، وتم نقله وتثبيته في طبق زراعة خلايا غير ملتصق بطول 10 سم مملوء بوسط جلوكوز عالي DMEM مكمل بحمض الأسكوربيك وعامل النمو المحول بيتا 3 (TGFß3) لمدة 14 يوما (نضج ثلاثي الأبعاد). قد تخضع الكائنات العضوية ثلاثية الأبعاد المشكلة لتقييم الوزن الرطب ، والتقييم النسيجي ، وعزل الحمض النووي الريبي والبروتين ، وتحليلات أخرى (على سبيل المثال ، المجهر الإلكتروني للانتقال ، والقياسات الميكانيكية الحيوية) في نقاط زمنية مختلفة مثل الأيام 0 و 1 و 14. تم إنشاء الرسوم المتحركة في برنامج BioRender . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صور تمثيلية لتباين الطور ل NHDFs أثناء خطوات ما قبل التمدد والتمدد ثنائي الأبعاد والتحفيز ثنائي الأبعاد. (أ) NHDFs أثناء ما قبل التمدد في دورق T-75. (ب) أضلاع NHDFs في اليومين 1 و5 من خطوة التمدد ثنائية الأبعاد في طبق زراعة الخلايا طوله 10 سم. (ج) NHDFs في اليومين 1 و 14 من خطوة التحفيز 2D في طبق زراعة الخلايا 10 سم. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. تم التقاط الصور بمجهر مقلوب مزود بكاميرا عالية الدقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التشكل الإجمالي لعضويات NHDF 3D. صور عيانية تمثيلية لعضويات NHDF في اليومين 0 و 14 من خطوة النضج ثلاثية الأبعاد. شريط المقياس: 1 سم. تم التقاط الصور بكاميرا الهاتف المحمول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل الوزن الرطب لعضويات NHDF 3D. كان قياس الوزن الرطب للعضويات في اليوم 0 واليوم 14 ، نهاية عملية النضج ثلاثية الأبعاد. يوضح الرسم البياني القيم المتوسطة والانحرافات المعيارية (NHDF n = 3 ، 3 عضويات / مانح في اليوم 0 و 2 عضوي / مانح في اليوم 14 بسبب 1 عضوي / متبرع مأخوذ للأنسجة في اليوم 1) ، تمثل كل نقطة عضويات فردية بينما يمثل كل شكل ملون متبرعا فرديا مختلفا. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري ، وتم استخدام اختبار t بارامتري غير مزاوج. الفروق الإحصائية: ** p ≤0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: التحليل النسيجي لعضويات NHDF 3D. صور تمثيلية للأقسام الملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) من عضويات NHDF أثناء عملية النضج ثلاثية الأبعاد في اليومين 1 و 14. الصورة اليمنى - صور تكبير منخفضة ، الصورة اليسرى - عرض مكبرة مع مؤشرات على النحو التالي: الأسهم الصفراء - طبقات منفصلة ؛ رؤوس الأسهم الصفراء - نوى بأحجام وأشكال مختلفة ؛ الأسهم السوداء - الطبقات المنصهرة وترسب ECM ؛ رؤوس الأسهم السوداء - صفوف الخلايا ، نوى ذات حجم واستطالة مماثلة ؛ النجوم السوداء - الخلايا في مجموعات. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

توفر النتائج الموضحة في هذه الدراسة رؤى قيمة حول إنشاء وتوصيف نموذج NHDF 3D العضوي لدراسة أنسجة T / L. أدى البروتوكول المكون من 3 خطوات إلى تكوين عضويات تشبه قضيب ثلاثي الأبعاد تظهر ميزات نموذجية لمكانة T / L. تم الإبلاغ عن هذا النموذج سابقا في Kroner-Weigl et al. 20237 وتم عرضه بتفصيل كبير هنا.

أظهرت صور تباين الطور المعروضة في الشكل 2 تقدم التقاء NHDF وتشكيل الصفيحة أثناء خطوات التمدد والتحفيز. تم تنفيذ عملية النضج ثلاثية الأبعاد عن طريق دحرجة صفائح الخلايا يدويا إلى عضويات تشبه قضيب ثلاثي الأبعاد ، والتي تم استزراعها بعد ذلك تحت توتر ثابت لمدة 14 يوما. أظهرت الكائنات العضوية مظهرا أبيض لامعا وكثافة متزايدة بحلول اليوم 14 ، مما يشير إلى الانكماش وإعادة التنظيم الهيكلي داخل الكائنات العضوية. يشير هذا إلى أن فترة النضج أمر بالغ الأهمية لتحقيق بنية أكثر تنظيما ومحاكاة الأنسجة T / L.

علاوة على ذلك ، كشف تحليل الوزن عن انخفاض كبير في الوزن الرطب للعضويات بين اليومين 0 و 14 ، مما يشير مرة أخرى إلى انكماش كبير وإعادة تنظيم ECM داخل الكائنات العضوية أثناء عملية النضج. الأهم من ذلك ، قد تختلف قياسات الوزن الرطب بين التجارب بسبب المناولة والوسط المتبقي داخل العضو أو في الأطباق. علاوة على ذلك ، قد يحتوي العضو العضوي على وسيط أكثر في البداية لأنه ، كما هو موضح أدناه ، في اليوم 0 ، يتم فصل الطبقات التي تشكلها ورقة الخلية المتدحرجة ولا تنصهر. مع مرور الوقت ، انضمت الطبقات وأصبحت أكثر إحكاما ، وبالتالي ، قد يتم بثق الوسط.

قدم التقييم المورفولوجي بواسطة H& E Staining رؤى إضافية حول الخصائص الهيكلية العضوية. في اليوم 1 ، أظهرت الكائنات العضوية طبقات منفصلة ، تتكون بشكل أساسي من خلايا ذات نوى مستديرة محاطة ب ECM رقيق شبه خلوي. يشير عدم وجود محاذاة للخلايا بالتوازي مع محور حمل الشد إلى أن هناك حاجة إلى مزيد من النضج لتحقيق بنية خلوية و ECM أكثر تنظيما للعضويات. على الرغم من الانكماش وانخفاض الوزن العضوي والأبعاد بين اليومين 1 و 14 ، أظهر تلطيخ H& E زيادة في المناطق الإيجابية لليوزين ، مما يشير إلى زيادة ترسب ECM. علاوة على ذلك ، لم تعد هناك طبقات مرئية ، وفي بعض الأحيان ، كانت الخلايا تحتوي على نوى ممدودة وتم وضعها في صفوف خلايا متوازية. أشار هذا إلى أن الخلايا داخل الكائنات العضوية تخضع للتنظيم الذاتي عن طريق تغيير ترتيبها الخاص بالإضافة إلى ترسب ECM وهيكلها ومحاذاتها ، وبالتالي محاكاة سلوك تكوين أنسجة T / L الأصلي.

بشكل عام ، تسلط هذه النتائج الضوء على إمكانات نموذج NHDF العضوي كأداة قيمة لدراسة بيولوجيا T / L ، وتكوين الوتر في المختبر ، وحتى لمواصلة تطوير هندسة T / L الخالية من السقالات. ومع ذلك ، هناك ثلاث خطوات حاسمة للتعامل الناجح مع نموذج عضوي ثلاثي الأبعاد: 1) تشكيل ورقة خلية ضيقة خلال مرحلة تحفيز 2D من البروتوكول. عند استخدام الخلايا الأولية ، يعتمد هذا في الغالب على خصائص الخلايا المانحة. ولذلك، من المهم تقييم الجهات المانحة المتعددة بالتوازي؛ 2) المتداول اليدوي لورقة الخلية. هذا يتطلب المتداول بسرعة ، ولكن في نفس الوقت بلطف ، ورقة الخلية باستخدام مكشطة الخلية. لذلك ، ينصح بتخطيط المواد العضوية الأولية لتدريب هذا الإجراء أولا ؛ و 3) التثبيت المستقر للدبابيس عند الحواف العضوية. يضمن هذا التثبيت الاستطالة المحورية العضوية ويمنع التشوهات وكذلك الانهيار في بنية تشبه الكتلة. علاوة على ذلك ، خلال مرحلة النضج 3D ، نظرا لأن الكائنات العضوية تجربة إعادة تشكيل ECM ، يمكن فصل المسامير فجأة ، لذلك ، من المهم مراقبة كل عضو عضوي بشكل متكرر وإعادة إصلاح المسامير.

لم يصل النموذج الحالي بعد إلى مستوى التقليد في الجسم الحي لأنسجة T / L ويحتوي على عدد من القيود. على سبيل المثال ، يتطلب الأمر عددا كبيرا من الخلايا لكل عضو عضوي بالإضافة إلى 35 يوما لإكمال الإجراء ، بينما يتم تعيين معظم بروتوكولات التمايز ، مثل نموذج الحبيبات الغضروفية ثلاثية الأبعاد ، على 21 يوما22. يفضل تنفيذ خطوات الغسيل في إجراء البروتوكول باستخدام عازل غسيل متوازن من الناحية الفسيولوجية ، على سبيل المثال ، Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) أو Earles Balanced Salt Solution (EBSS) ، بدلا من PBS الذي قد يكون له عواقب أيضية على الخلايا البشرية الأولية المزروعة في المختبر. فيما يتعلق بوسط الاستزراع المستخدم في مراحل التحفيز ثنائي الأبعاد والنضج ثلاثي الأبعاد في العضوي ، فقد تم اختياره DMEM بالإضافة إلى تركيبة FBS بنسبة 10٪ لأن هذا هو أساس بروتوكولات التمايز المقبولة على نطاق واسع وكذلك بقصد التوحيد والمقارنة بين أنواع الخلايا المختلفة لخصائصها العضوية23. قد يتأثر استنساخ بروتوكول العضو المكون من 3 خطوات عبر إعدادات المختبر المختلفة بنوع الخلية المستخدمة وجودة الخلية ومرورها ، بالإضافة إلى خصائص الخلية المعتمدة على المانح. يمكن أن تؤثر الاختلافات في المعدات ، خاصة في جودة أطباق زراعة الخلايا 10 سم24 المستخدمة خلال مرحلة التحفيز ثنائية الأبعاد ، على متانة تكوين صفائح الخلايا. علاوة على ذلك ، بسبب تقلص ECM على نضج 3D ، قد يخفف التثبيت المحوري للعضويات عبر المسامير ؛ لذلك ، كما ذكر أعلاه ، يوصى بالمراقبة المتكررة. يمكن أن يؤدي اختبار واختيار دبابيس مختلفة من حيث القطر والقوة أيضا إلى تقليل مخاطر انفصال الدبوس25. ومع ذلك ، فإن استخدام المسامير للتمدد اليدوي ليس قويا ، وهو عرضة للتعامل مع التباين ؛ وبالتالي ، من المهم جدا تطوير آلية تثبيت في أبحاث المتابعة لتثبيت الحواف العضوية ، والتي يمكن أن تؤدي ليس فقط إلى توحيد هذه الخطوة ، ولكن أيضا يمكن أن تسمح بالتمدد الديناميكي للعضويات. بشكل عام ، سيكون من المهم التحقيق في طريقتين لتعديل نموذج العضو ، أحدهما تصغير الحجم - لتقليل عدد الخلايا لكل عضو ووقت الإجراء ، مما يجعله أكثر سهولة في الاستخدام ، خاصة بالنسبة للدراسات المختبرية ؛ والثاني - لزيادة أبعاد الكائنات العضوية من أجل اختبار سلوكها في النماذج الحيوانية الكبيرة كاستراتيجية محتملة لاستبدال الأوتار.

يمكن أن يوفر النموذج الموضح هنا منصة للتحقيق في الآليات الكامنة وراء تطور الأوتار ، والفيزيولوجيا المرضية ، وربما الإصلاح والتجديد إذا تم دمج الكائنات العضوية مع أنواع مختلفة من الخلايا وتعرضها للتمزق الدقيق. من المهم الإشارة إلى أن دراسة Kroner-Weigl et al. 20237 حددت العديد من القيود المتعلقة بنوع خلية NHDF ، وهي أن المواد العضوية المكونة من NHDFs أكبر وأكثر خلوية من تلك المشتقة من خلايا T / L ، مما يجعل من الصعب التحكم في تكاثر الخلايا وسلوكها. فيما يتعلق بموت الخلايا المبرمج ، لم يظهر الفحص القائم على وضع العلامات على نهاية deoxynucleotidyl dUTP (TUNEL) أي دليل على وجود خلايا ميتة في جميع أنحاء العضو في اليوم 147 ، مما يشير إلى الانتشار المناسب للمغذيات والنفايات والأكسجين خلال خطوة النضج ثلاثية الأبعاد. ومن المثير للاهتمام ، على الرغم من الاختلافات المورفولوجية ، أن الفحص التجريبي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لعدد من الجينات المرتبطة ب T / L (بما في ذلك أنواع الكولاجين المختلفة ، Scleraxis (SCX) ، الموهوك (MKX) ، إلخ) اقترح تعبيرا جينيا مشابها بين NHDF و T / L organoids7 ، وهي نتيجة يجب إجراء مزيد من التحقيق فيها وكذلك يجب التحقق من صحتها على مستوى البروتين. وبالتالي ، بالنسبة لهذا النوع من الخلايا ، يلزم إجراء مزيد من التحسين من أجل دعم تمايز T / L ويمكن أن يعتمد على ضبط الوسط المستخدم في تحفيز 2D وخطوات النضج 3D (على سبيل المثال ، تركيز المصل وعوامل النمو والفيتامينات) ، وتمديد وقت النضج أو حتى إخضاع الكائنات العضوية لتمدد ميكانيكي ديناميكي. يمكن أن يؤدي تطوير البروتوكول إلى زيادة تحسين الخصائص التركيبية والهيكلية والوظيفية العضوية ، وبالتالي تمكين النموذج من محاكاة المركب بشكل أفضل في مكانة الأنسجة T / L في الجسم الحي . علاوة على ذلك ، يمكن التحقيق في مصادر الخلايا البديلة لقدرتها على تكوين عضويات T / L وما إذا كان يمكن أن تخضع لتمايز T / L. Yan et al. 20209 ، استخدم نموذج العضو العضوي ثلاثي الأبعاد باستخدام خلايا جذعية / سلفية شابة / صحية ومسنة / تنكسية (Y-TSPCs و A-TSPCs) للتحقيق في السلوك الخلوي في 3D وكذلك ما إذا كانت قدرة تشكيل الأوتار تتغير مع شيخوخة T / L. وأفادوا أن الكائنات العضوية A-TSPC 3D تظهر مورفولوجيا الأنسجة الضعيفة، والخلايا داخلها لديها معدل انتشار أقل ولكن موت الخلايا المبرمج أعلى بالتوازي مع مستويات مرتفعة من العلامات المرتبطة بالشيخوخة9. وبالتالي ، فإن نموذج T / L 3D organoid هو منصة واعدة لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية المشاركة في شيخوخة الأوتار ويمكن استخدامه أيضا لاختبار العلاجات الدوائية الجديدة لإصلاح الأوتار وتجديدها. في نهج مختلف ، Chu et al. 2021 نفذت خلايا بصيلات الأسنان (DFCs) في نموذج عضوي 3D من أجل تقييم تمايزها في الأربطة. شكل هذا النوع من الخلايا عضويات جيدة التنظيم ، مما يشير إلى DFCs كمصدر خلية جذاب للتمييز في أنسجة الرباط اللثوي (PDL) ، والتي بدورها يمكن أن تطور استراتيجية علاجية واعدة لالتهاب دواعم السن8.

في المستقبل ، يمكن أن يصبح النموذج أكثر تعقيدا من خلال تضمين أنواع مختلفة من الخلايا (على سبيل المثال ، الخلايا الليفية العضلية ، البلاعم) ، والتي قد تقدم رؤى جديدة حول السلوكيات الخاصة بالخلية والحديث المتبادل الخلوي داخل الكائنات العضوية وتساهم في فهم أكثر شمولا لبيولوجيا T / L وعلم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية8،9،16،26.

نماذج 3D العضوية تحمل العديد من المزايا لهندسة الأنسجة وتطبيقات الطب التجديدي. إنها تحاكي عن كثب التركيب الخلوي والتنظيم وكذلك التفاعلات من خلية إلى خلية ومن خلية إلى مصفوفة للأنسجة البشرية ، مما يوفر منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة آليات المرض والاستجابات الدوائية27. يمكن استخدام المواد العضوية كمنصة فحص عالية الإنتاجية لتقييم الفعالية ولكن أيضا الآثار الجانبية المحتملة للأدوية المختلفة وتوفير بديل موثوق ومنخفض التكلفة للتجارب على. علاوة على ذلك ، فإنها تتيح إجراء مقارنات مباشرة بين الظروف الصحية والمرضية ، مما يسمح باكتشاف التغيرات الجزيئية والخلوية الرئيسية المرتبطة بأمراض متنوعة ، وتحديد المؤشرات الحيوية للكشف المبكر عن الأمراض بالإضافة إلى تسهيل الفهم الصاعد لآليات المرض ، وتطوير العلاجات المستهدفة28،29.

مجتمعة ، أظهرنا بتفصيل كبير خطوات نموذج 3D T / L العضوي الذي تم إنشاؤه مسبقا والذي يوفر منصة واعدة لدراسة بيولوجيا الأنسجة T / L والعمليات المختبرية لأنواع الخلايا المختلفة. يتم تشجيع المزيد من التنفيذ والتحسين والبحث في هذا النموذج بشدة لأنها قد تؤدي إلى تطوير استراتيجيات هندسة T / L الخالية من السقالات ، والتي بدورها يمكن أن تسهم في تحسين علاج T / L.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

د. د. و س. م. د. الاعتراف بمنحة BMBF "CellWiTaL: أنظمة الخلايا القابلة للتكرار لأبحاث الأدوية - نقل الطباعة بالليزر الخالية من الطبقات لخلايا مفردة محددة للغاية في هياكل خلوية ثلاثية الأبعاد" الاقتراح رقم 13N15874. D.D. و V.R.A. تعترف بمنحة EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "التدريب الشامل للجيل القادم من أبحاث هشاشة العظام" GA Nr. 101034412. ويعرب جميع المؤلفين عن تقديرهم للسيدة بيت غيير لما قدمته من مساعدة تقنية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الأسكوربيك   Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany   A8960
طبق ثقافة الخلايا الملتصقة مقاس 10 سمSigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430167
بتري غير ملتصق 10 سم ؛Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430591
Cryo-mediumTissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands   4583
Cryomold standard Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, هولندا4557
D(+)-Sucrose AppliChem Avantor VWR International GmbH ، دارمشتات ، ألمانياA2211
DMEM ارتفاع الجلوكوز المتوسط الجدي العلمي ، Ebsdorfergrund ، ألمانيا  DMEM-HA
DMEM منخفض الجلوكوزالجدي العلمي ، Ebsdorfergrund ، ألمانيا   ؛  DMEM-LPXA
مصل الأبقار الجنينيAnprotec ، Bruckberg ، ألمانيا   ؛AC-SM-0027
وسط نمو الخلايا الليفية 2   ؛PromoCell, هايدلبرغ, ألمانيا   C-23020
H& طقم تلطيخ EAbcamab245880
مجهر مقلوب بكاميرا عالية الدقةZeissNAZeiss Axio Observer مع   أكسيوكام 506
MEM الأحماض الأمينية  الجدي العلمي ، Ebsdorfergrund ، ألمانيا    NEAA-B
دبابيس معدنية EntoSphinx, Pardubice, جمهورية التشيك 04.31
الخلايا الليفية الجلدية البشرية الطبيعية PromoCell, هايدلبرغ, ألمانيا C-12302
ParaformaldehydeAppliChem ، Sigma-Aldrich ، Taufkirchen ، ألمانيا   ؛A3813
البنسلين / الستربتومايسين   ؛Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany15140122
محلول ملحي للفوسفات  Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P4417
TGF & szlig ؛ 3 R & D Systems, Wiesbaden, Germany   8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05٪ DPBS الجدي العلمي ، Ebsdorfergrund ، ألمانيا    ليرة تركية -1 ب
طبق

المراجع

  1. Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
  2. Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844(2020).
  3. Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
  4. Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
  5. Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299(2022).
  6. Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
  7. Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772(2023).
  8. Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
  9. Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406(2020).
  10. Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
  11. Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
  12. Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
  13. Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
  14. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  15. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  16. Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272(2018).
  17. Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047(2020).
  18. Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
  19. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  20. Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
  21. Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
  22. Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936(2019).
  23. Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
  24. Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
  25. Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
  26. Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
  27. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  28. Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
  29. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة