استخدام تصوير الخلايا الحية لقياس آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري في الخلايا العصبية الحصينية الأولية

ملخص

نوضح هنا كيفية الجمع بين نقل الخلايا العصبية للقوارض الحصين الأولية مع التصوير البؤري للخلايا الحية لتحليل التأثيرات المرضية التي يسببها البروتين على النقل المحوري وتحديد المسارات الميكانيكية التي تتوسط هذه الآثار.

الملخص

يعد النقل ثنائي الاتجاه للشحنات على طول المحور العصبي أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية والاتصال العصبي والخلايا العصبية السليمة. يتعطل النقل المحوري في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، وتكون الخلايا العصبية الإسقاطية معرضة بشكل خاص بسبب الحاجة إلى نقل المواد الخلوية لمسافات طويلة والحفاظ على كتلة محورية كبيرة. تؤثر التعديلات المرضية للعديد من البروتينات المرتبطة بالأمراض سلبا على النقل ، بما في ذلك تاو ، β الأميلويد ، α-سينوكلين ، ديسموتاز الفائق الأكسيد ، وهنتنغتين ، مما يوفر آلية مشتركة محتملة تمارس من خلالها البروتينات المرضية سمية في المرض. طرق لدراسة هذه الآليات السامة ضرورية لفهم الاضطرابات التنكسية العصبية وتحديد التدخلات العلاجية المحتملة.

هنا ، يتم نقل الخلايا العصبية الحصين للقوارض الأولية المستزرعة مع بلازميدات متعددة لدراسة آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري السريع باستخدام التصوير البؤري للخلايا الحية لبروتينات الشحن الموسومة بالفلورسنت. نبدأ بحصاد وتفكك وزراعة الخلايا العصبية الحصين الأولية من القوارض. بعد ذلك ، نشارك في نقل الخلايا العصبية باستخدام تركيبات الحمض النووي البلازميد للتعبير عن بروتين الشحن الموسوم بالفلورسنت والنوع البري أو الطافر تاو (يستخدم كنموذج للبروتينات المرضية). يتم تحديد المحاور العصبية في الخلايا الحية باستخدام جسم مضاد يربط مجالا خارج الخلية من اللفافة العصبية ، وهو بروتين المقطع الأولي للمحور العصبي ، ويتم تصوير المنطقة المحورية ذات الأهمية لقياس نقل البضائع الفلورية.

باستخدام KymoAnalyzer ، وهو ماكرو ImageJ متاح مجانا ، نقوم بتوصيف السرعة وتردد الإيقاف المؤقت وكثافة الشحن الاتجاهية للنقل المحوري ، وكلها قد تتأثر بوجود البروتينات المرضية. من خلال هذه الطريقة ، نحدد النمط الظاهري لزيادة تردد توقف البضائع المرتبط بالتعبير عن بروتين تاو المرضي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إضافة تركيبات shRNA لإسكات الجينات إلى مزيج النقل لاختبار دور البروتينات الأخرى في التوسط في تعطيل النقل. هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة للاستخدام مع البروتينات الأخرى المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية وهو طريقة قابلة للتكرار لدراسة آليات كيفية تعطيل هذه البروتينات للنقل المحوري.

المقدمة

تعتمد الخلايا العصبية على النقل ثنائي الاتجاه للبضائع على طول المحور العصبي للحفاظ على نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية والاتصال العصبي. يعتقد أن عجز النقل المحوري مساهم حاسم في التسبب في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) واعتلالات التاوباثيات الأخرى ، ومرض باركنسون ، والتصلب الجانبي الضموري ، ومرض هنتنغتون^1،2،3. في الواقع ، تؤثر التعديلات المرضية على العديد من البروتينات المرتبطة بالأمراض سلبا على النقل (تمت مراجعته في ⁴). من الضروري تطوير طرق للتحقيق في الآليات التي تمارس بها البروتينات المرضية السمية في المرض لفهم الاضطرابات التنكسية العصبية وتحديد الأهداف المحتملة للتدخل العلاجي.

تم إجراء العديد من الأفكار المهمة حول نقل المحور العصبي ، بما في ذلك اكتشاف الكينيسين التقليدي ، والمسارات المعتمدة على الكيناز والفوسفاتيز التي تنظم البروتينات الحركية ، والآليات التي تعطل بها البروتينات المرضية تنظيم نقل المحور العصبي ، باستخدام نموذج أكسوبلازم الحبار^{المعزول 4,5}. إن نضح أكسوبلازم الحبار مع الأشكال المرضية لبروتين تاو يمنع النقل المحوري السريع المتقدم (FAT) ، وهو تأثير يعتمد على التعرض لمجال تنشيط الفوسفاتيز في تاو ، والذي ينشط بروتين الفوسفاتيز 1 (PP1) ^6،7،8. PP1 ينشط الجليكوجين سينسيز كيناز 3 (GSK3) ، والذي بدوره يفسفر سلاسل ضوء كينيسين مما يتسبب في إطلاق البضائع. بروتين مرضي آخر في مرض الزهايمر هو الأميلويد β. تمنع الأشكال قليلة القسيمات من الأميلويد β الدهون ثنائية الاتجاه من خلال الكازين كيناز 2 ، الذي يفسفر سلاسل ضوء كينيسين⁹. علاوة على ذلك ، فإن بروتين هنتنغتين المرضي الذي يؤوي توسعا متعدد الجلوتامين ومتحولا عائليا مرتبطا بالتصلب الجانبي الضموري SOD1 يعطل كل منهما النقل المحوري في أكسوبلازم الحبار من خلال كيناز c-Jun N-terminal ونشاط بروتين كيناز المنشط بالميتوجين p38 ، على التوالي^10,11.

في حين أن نموذج أكسوبلازم الحبار لا يزال أداة قيمة في فهم آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري ، فإن الوصول المحدود إلى المعدات والعينات يمنعها من استخدامها على نطاق أوسع. قمنا بتطوير مقايسة النقل باستخدام التصوير المجهري متحد البؤر للخلايا الحية للخلايا العصبية الأولية للقوارض (الفئران والفئران). يمثل هذا النموذج نهجا قائما على الخلايا العصبية للثدييات يمكن تكييفه والتلاعب به بسهولة باستخدام مصادر الخلايا وأنظمة الفحص المجهري المتاحة على نطاق واسع. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن مجموعة متنوعة من البروتينات المرضية (على سبيل المثال ، إيواء التعديلات المرتبطة بالمرض) لتحديد كيفية تأثير تعديلات معينة لهذه البروتينات على النقل في المحاور. وبالمثل ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من بروتينات الشحن الموسومة بالفلورسنت لفحص التغيرات الخاصة بالبضائع. علاوة على ذلك ، تتم دراسة الآليات الجزيئية الأساسية بسهولة نسبية من خلال استهداف التعبير (أي الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير) للبروتينات المختارة التي قد تتوسط هذه التأثيرات. كما يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة مع الخلايا العصبية الأولية المشتقة من مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية.

نقدم بروتوكولا مفصلا يصف مقايسة نقل المحور العصبي للخلايا الحية التي كانت تستخدم سابقا في الخلايا العصبية الحصينية الأولية لإظهار أن بروتينات تاو الطافرة المرتبطة بالخرف الفصي الجبهي الصدغي (FTLD; P301L أو R5L tau) زيادة تردد التوقف المؤقت لبروتينات الشحن ذات العلامات الفلورية ثنائية الاتجاه¹². علاوة على ذلك ، أنقذت ضربة قاضية من isoform PP1γ تأثيرات الإيقاف المؤقت¹². يوفر هذا الدعم لنموذج الاضطراب المرضي الناجم عن تاو والذي يتم التوسط فيه من خلال التنشيط الشاذ لمسار الإشارات الذي بدأه PP1 كما هو موضح أعلاه^6،7،12. في دراسة منفصلة ، أظهرنا أن الفسفرة الكاذبة للتاو عند S199 / S202 / T205 (الفوسفوبيتوب AT8 الممرض المرتبط باعتلال التاوباثي) زاد من تردد توقف البضائع وسرعة الجزء الأمامي. كانت هذه التأثيرات تعتمد على مجال تنشيط الفوسفاتيز N-terminal ل tau¹³. تسلط هذه الأمثلة الضوء على فائدة هذا النموذج في تحديد آليات كيفية تعطيل البروتينات المرضية لنقل المحور العصبي في الخلايا العصبية في الثدييات.

تقدم هذه الورقة وصفا تفصيليا للطريقة التي تبدأ بحصاد وتفكك وزراعة الخلايا العصبية الحصينية الأولية للفأر ، تليها نقل الخلايا العصبية مع بروتينات الشحن المدمجة مع بروتين الفلورسنت ، وأخيرا ، تصوير الخلايا الحية وتحليل الصور. نوضح كيف يتم استخدام هذه الطريقة لدراسة آثار تاو المعدل على النقل ثنائي الاتجاه للبروتين المرتبط بالحويصلة ، synaptophysin ، كمثال. ومع ذلك ، هناك مرونة في البروتين الممرض وبروتين نقل البضائع محل الاهتمام ، مما يجعل هذا نهجا متعدد الاستخدامات لدراسة النقل المحوري.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ولاية ميشيغان. تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على فئران Tau Knockout في خلفية C57BL / 6J وفئران Sprague Dawley من النوع البري. يجب أن تكون السلالات الأخرى مقبولة أيضا.

1. حصاد الخلايا العصبية الحصين الأولية

1. قم بتغطية شريحة حجرة سفلية زجاجية مكونة من 4 آبار بفلتر 0.5 مجم / مل بولي دي ليسين (PDL) في محلول بورات (12.5 مللي مول بورات الصوديوم ديكاهيدرات و 50 مللي مول حمض البوريك). أضف 750 ميكرولتر / بئر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
2. اغسل شريحة الحجرة 4x بالماء منزوع الأيونات المعقم. جفف في الهواء بعد آخر غسلة واحفظ عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل (<1 أسبوع).
   ملاحظة: لا تدع PDL يجف على الشريحة قبل وبين الغسلات لأن هذا سام للثقافات. نجد أن التخزين طويل الأجل للشرائح المطلية ب PDL قد يؤثر على صحة الخلايا العصبية وأن الحفاظ على فترات زمنية ثابتة بين الطلاء والطلاء يقلل من التباين بين التشغيل في جدوى الثقافة.
3. الحصول على الفأر أو الجرذ الحامل في الوقت المناسب.
   ملاحظة: يمكن طلب الحامل الموقوتة من شركات مختلفة أو تربيتها في المنزل. يشير اليوم الجنيني صفر إلى اليوم الذي يتم فيه العثور على السدادة المهبلية ، وقد نجحنا في زراعة الخلايا العصبية الأولية والقرنية الأولية للفأر E16-18 باستخدام هذا النهج. يتم حصاد الخلايا العصبية للفئران أيضا في اليوم الجنيني 18.
4. في E18 ، القتل الرحيم للإناث الحامل بطريقة معتمدة. قطع من خلال جدار البطن وإزالة قرني الرحم. نقلها إلى طبق بتري يحتوي على الجليد الباردة 0.9 ٪ المالحة. شطف حتى المياه المالحة نظيفة.
   ملاحظة: نتناول جرعة زائدة من بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغ/كغ على الأقل) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
5. قطع رأس الجراء. بدءا من الثقبة العظمى (الفتحة الموجودة في الجزء الخلفي من الجمجمة) ، استخدم مقص التشريح المجهري لقطع الجلد والجمجمة على طول خط الوسط ، مع تحريك الطرف السفلي من المقص لأعلى مقابل الجزء الداخلي من الجمجمة لتجنب تلف أنسجة المخ.
6. قم بإزالة الجلد المغطي وإزالة الجمجمة بعناية لكشف الدماغ.
7. استخدم الملقط لتثبيت منطقة الفم / الأنف وقلب الجمجمة بحيث يكون الدماغ متجها لأسفل فوق طبق بتري مملوء بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪. اقلب الدماغ خارج الجمجمة واقطع الأعصاب وجذع الدماغ لتحرير الدماغ في المحلول الملحي.
8. ضع طبق بتري تحت مجهر تشريح لتشريح الحصين. أدخل المقص في خط الوسط للدماغ ، وقم بزاوية المقص بحيث تدفع الشفرة العلوية أحد نصفي الكرة المخية إلى الخارج ، واقطعه لفصل نصف الكرة بعيدا عن المناطق تحت القشرية.
9. قم بعمل قطع رأسي عبر القشرة بحيث تكون القشرة الأمامية أمامية ، والحصين خلف موقع القطع. أدخل الطرف السفلي للمقص في الفتحة الناتجة وقطعه بعناية على طول قمة القشرة التي تتوقف عند النهاية الخلفية.
10. باستخدام الملقط ، قم بتأرجح القشرة بعناية وإنهاء القطع الخلفي. يجب أن يشبه الحصين شكل الهلال. قم بقص القشرة المتبقية بعناية حتى يحافظ الحصين على شكله الهلالي المستدير.
11. باستخدام ملقط ومقص ، قم بإزالة السحايا برفق من الحصين.
    ملاحظة: من المهم إزالة جميع السحايا من الدماغ لتقليل عدد الخلايا غير العصبية التي يتم جمعها مع الامتناع عن إتلاف أو تمزق أنسجة الحصين.
12. قطع الحصين إلى أربع قطع متساوية ووضع الأنسجة في أنبوب مخروطي 15 مل مملوء بمحلول متجمد خال من الكالسيوم والمغنيسيوم (CMF; برنامج تلفزيوني من Dulbecco مع 0.1٪ جلوكوز ، 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب ، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين).
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، اجمع الحصين من 5-10 جراء لكل تفكك. يجب أن يوفر كل قرن آمون ما يقرب من 300000 خلية للفئران و 500000 خلية للفئران.

2. تفكك الخلايا العصبية الحصين الأولية والطلاء

1. قم بإزالة CMF باستخدام ماصة باستور واشطف المنديل باستخدام CMF 4x البارد الطازج ، مع الدوران برفق بين الشطف.
2. قم بإزالة CMF وإضافة 3 مل من محلول التربسين المصفى 0.125٪ (تمييع 2.5٪ تربسين في CMF المسخن مسبقا [37 درجة مئوية]). احتضان الأنسجة لمدة 15 دقيقة بالضبط عند 37 درجة مئوية ؛ حرك برفق كل 5 دقائق.
   ملاحظة: اصنع محلول التربسين مباشرة قبل الاستخدام.
3. تحضير 5 مل من محلول تثبيط التربسين (TIS; محلول ملح هانكس المتوازن ، مصل عجل حديثي الولادة 20٪ ومحلول DNase I 1x [مخزون 10x: 5 مللي متر أسيتات الصوديوم ، 1 ميكرومتر كلوريد الكالسيوم ، 0.5 مجم / مل DNase I]).
4. قم بإزالة محلول التربسين واغسل 2x باستخدام CMF البارد. أضف 3 مل من TIS البارد.
5. فصل الخلايا من خلال التثليج باستخدام حقنة 3 مل مع إبر قطرها أصغر تدريجيا: سحن 30x باستخدام إبرة 14 G ، 30x باستخدام إبرة 15 G ، 20x باستخدام إبرة 16 G ، 20x باستخدام إبرة 18 G ، و 15x باستخدام إبرة 21 G. استخدم سحوبات 2 ثانية مع الإبر الأربعة الأولى و 3 ثوان مع إبرة 21 جرام.
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام طرق أخرى للتثليث (على سبيل المثال ، الماصات الزجاجية المصقولة^{بالنار 14،15}). نجد أن استخدام إبر المحاقن المعدنية الموحدة يقلل بشكل كبير من التباين في تكتل الخلايا وصلاحيتها.
6. باستخدام إبرة 21 G ، ضع قطرة من تعليق الخلية على شريحة مجهرية وتحقق من وجود كتل خلوية. إذا لوحظت عدة كتل ، قم بالسحن ثلاث مرات أخرى من خلال إبرة 22 جم وأعد الفحص. كرر هذه العملية حتى يتم الحصول على تعليق متجانس أحادي الخلية ، مع الحرص على السحن بلطف طوال العملية.
7. قم بتصفية 5 مل من مصل الجنين البقري (FBS) باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. ضع تعليق الخلية برفق على FBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا (200 × جم عند 4 درجات مئوية) لمدة 5 دقائق.
8. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من FBS دون تعطيل الحبيبات. يعاد التعليق في 1 مل من الأوساط العصبية القاعدية الدافئة (37 درجة مئوية) الخالية من المضادات الحيوية (NBM؛ مع 1x بديل الجلوتامين و1x B-27).
9. تمييع تعليق الخلية في تريبان الأزرق (0.4 ٪) والحصول على عدد الخلايا.
   ملاحظة: يعمل التخفيف 1: 1 بشكل جيد لعداد الخلايا التلقائي ويستخدم تخفيفا بنسبة 1:60 للعد اليدوي باستخدام مقياس الدم. للاستمرار في طلاء الخلية ، يجب أن تكون صلاحية الخلايا العصبية أعلى من 90٪ في هذه المرحلة. هذا يعزز بشكل كبير من احتمال وجود ثقافة عصبية صحية بعد التفكك.
10. قم بطلاء الخلايا بكثافة 175000 خلية / بئر (70000 خلية / مم²) في شريحة حجرة رباعية الآبار مطلية مسبقا ب PDL في 750 ميكرولتر من NBM الخالي من المضادات الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، صفيحة 200000 خلية / بئر في أربعة آبار من صفيحة 24 بئرا مطلية ب PDL في 1.5 مل من NBM الخالي من المضادات الحيوية لاستخدامها كوسيط مكيف في النقل الموصوف في القسم 3. احتضان الخلايا في غرفة التحكم في الرطوبة ، 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO₂ .
    ملاحظة: يمكن تعديل كثافة الخلايا بناء على النتائج. يمكن أن تجعل الكثافات العالية من الصعب تصوير الخلايا العصبية بينما يمكن أن تؤثر الكثافة المنخفضة سلبا على صحة الثقافة وبقاء الخلايا العصبية. في تجربتنا ، يمكن طلاء الخلايا العصبية للفئران بكثافة أقل مقارنة بالخلايا العصبية للفئران.

3. نقل الخلايا العصبية

ملاحظة: يمكن نقل الخلايا العصبية على DIV 7 أو DIV 8 دون تغييرات ملحوظة في كفاءة النقل أو نتائج النقل. هذه الأحجام مخصصة لأربعة آبار من شريحة حجرة زجاجية ذات قاع زجاجي بأربعة آبار بحجم 750 ميكرولتر / بئر. يصف هذا البروتوكول النقل باستخدام كواشف نقل الدهون. اترك الوسائط وكواشف النقل تسخن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

1. تحضير كاشف مخزون النقل بإضافة 4.4 ميكرولتر من كاشف النقل إلى 127.6 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض. اخفقيها برفق باليد للخلط واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
2. تحضير مخزون الحمض النووي أثناء حضانة نقل الدهون. أضف 200 نانوغرام من الحمض النووي للشحن الفلوري (pFIN mApple-synaptophysin ؛ 12112 زوجا أساسيا) و 200 نانوغرام من الحمض النووي للتعبير عن البروتين محل الاهتمام (كانت بلازميدات تاو المستخدمة عبارة عن تركيبات pCMV tau-Flag ؛ 5036 زوجا من القواعد) في وسط مصل مخفض أو خال من المصل إلى حجم نهائي يبلغ 32 ميكرولتر¹². أضف 0.8 ميكرولتر من كاشف محسن النقل (2 ميكرولتر لكل ميكروغرام من الحمض النووي). تخلط جيدا باليد.
   ملاحظة: نجد أن مشتق RFP يعمل بشكل أفضل (mApple أو mCherry) ، ولكن يمكن استخدام GFP أيضا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تضمين بنية الحمض النووي للتعبير عن الحمض النووي الريبي الصغير (shRNA) لإسكات الجينات لاختبار آليات الأنماط الظاهرية التي لوحظت مع التعبير عن البروتين محل الاهتمام. للقيام بذلك ، قم بتضمين 150 نانوغرام من كل من تركيبات الحمض النووي الثلاثة في مزيج الحمض النووي واضبط كمية كاشف محسن النقل وفقا لذلك. يمكن أن يؤثر تغيير معلمات الحمض النووي أو كاشف الشفط على كفاءة النقل ويمكن تعديله بناء على الحاجة إلى عمليات نقل أكثر أو أقل كفاءة.
3. أضف 32 ميكرولتر من مزيج نقل الدهون إلى كل أنبوب من الحمض النووي. هز بلطف باليد لخلط. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
4. أضف ببطء 64 ميكرولتر من مزيج كاشف الحمض النووي / النقل إلى الخلايا عن طريق وضع طرف الماصة أسفل سطح الوسط مباشرة والتحرك بحركة أفعوانية في جميع أنحاء البئر. هز برفق انزلاق الغرفة باليد 3x بعد إضافة جميع الآبار لخلط المزيد ووضع شريحة الغرفة في الحاضنة. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO₂ لمدة 2 ساعة.
   ملاحظة: قلل من مقدار الوقت الذي تكون فيه الخلايا العصبية خارج الحاضنة لأنها حساسة جدا للتغيرات في درجة الحرارة ودرجة الحموضة ، والتي يمكن أن تحدث بسرعة.
5. إجراء تغيير نصف متوسط 2 ساعة بعد النقل باستخدام وسائط مكيفة + جسم مضاد Neurofascin. مباشرة قبل التغيير المتوسط ، قم بتجميع 1.5 مل من NBM المكيف الخالي من المضادات الحيوية من الخلايا المزروعة على لوحة 24 بئرا. أضف 0.75 ميكرولتر من الجسم المضاد Neurofascin 186 (NF-186) (500 نانوغرام / مل) إلى الوسط المكيف.
   ملاحظة: يكتشف الجسم المضاد NF-186 مجالا خارج الخلية من neurofascin يتم تخصيبه في الجزء الأولي من المحور العصبي (AIS) لتحديد محور التصوير بشكل نهائي.
6. قم بإجراء تغيير متوسط كامل بعد 18 ساعة من النقل باستخدام وسط مكيف يحتوي على الجسم المضاد الثانوي. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب الاقترانية إلى AlexaFluor 647 إلى 3 مل من NBM المكيف (الخالي من المضادات الحيوية) المجمع من لوحة 24 بئرا. تخلط جيدا.

4. تصوير الخلايا العصبية

1. الاستعداد للتصوير 2 أيام بعد transfection. قم بتسخين ملحق غرفة الخلية الحية للمجهر متحد البؤر إلى 37 درجة مئوية (بما في ذلك الهدف 60x وزيت العدسة) وموازنة الغرفة إلى 5٪ CO₂.
2. استخدم هدف تكبير عالي وغرفة خلية حية لتصوير الخلايا.
   ملاحظة: نحن نستخدم هدف 60x 1.40 NA على مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ولكن يمكن أيضا استخدام أنظمة مجهر مضان أخرى (مثل القرص الدوار) أو أنظمة الفحص المجهري الفلوري واسعة المجال إذا كانت قادرة على تحقيق معدلات إطارات تصوير عالية.
3. حدد بصريا الخلايا العصبية المنقولة في القناة التي تحتوي على بروتين الشحن باستخدام العدسات. بعد ذلك ، قم بتصوير الخلايا العصبية لتحديد AIS في قناة Cy5 (الشكل 1).
4. اضبط مجال الرؤية على مربع مستطيل من 32 بكسل × 128 بكسل وانقله لتصوير منطقة من المحور العصبي ~ 50-150 ميكرومتر بعيدة عن AIS. لاحظ وسجل اتجاه نقل البضائع واتجاه عائد الاستثمار. ستظهر النقاط الموجودة على المربع في الأعلى واليمين ، على التوالي ، لأي صور وأفلام لاحقة. سجل أي جانب من الصورة هو الأقرب إلى جسم الخلية وأي من الجوانب الأقرب إلى الطرف المحوري بحيث يمكن رسم خط الكيموغراف في الخطوة 5.1 بالاتجاه الصحيح.
   ملاحظة: عند اختيار منطقة الاهتمام، يجب أن تكون المساحة المصورة لمحور عصبي معزول مستقيمة نسبيا وتتقاطع مع مجال الرؤية في كل طرف. يجب أن يكون الجزء بأكمله ضمن نفس المستوى البؤري. يجب أن تعرض المنطقة بوضوح النقل النشط للبضائع. عادة ما تعبر الخلايا العصبية شديدة السطوع عن بروتين الشحن والبروتينات ذات الأهمية بمستويات من المحتمل أن تكون سامة للخلايا العصبية ويجب تجنبها.
5. اضبط طاقة الليزر 561 على 1.40 ، والثقب على 7.8 ، والحجم على 128 بكسل² ، والسرعة على 32 إطارا / ثانية. اضبط الكسب لتصور نقل حويصلات البضائع الفردية دون أن تحجبها إشارة الخلفية (عادة ما بين 10 و 50 ينتج عنها أجهزة كيموجراف عالية الجودة).
   ملاحظة: يمكن تحقيق طاقة الليزر المنخفضة للغاية بسبب كاشفات GaAsP عالية الحساسية وتمنع التأثيرات السمية الضوئية المحتملة والتبييض الضوئي للبضائع المتحركة. يتم تعيين حجم الثقب على أوسع نطاق ممكن لزيادة العمق البؤري لضمان تصوير عائد الاستثمار بالكامل لأن المحور قد لا يكون مسطحا تماما على سطح الشريحة.
6. اضبط عائد الاستثمار عن طريق تحديد رسم عائد استثمار مستطيل ... من القائمة المنسدلة عائد الاستثمار . ارسم عائد الاستثمار بحيث يغطي مجال الرؤية بالكامل. انقر بزر الماوس الأيمن فوق عائد الاستثمار وحدد استخدام كتحفيز ROI: S1.
7. قم بإعداد إعداد ND عن طريق تضمين الخطوات التالية في علامة التبويب إعداد ND.
   ملاحظة: هذا هو بروتوكول الاستحواذ المكون من خمس خطوات الذي يتم إعداده مرة واحدة ثم يتم تنفيذه بواسطة البرنامج في كل مرة يتم فيها جمع الأفلام.
   1. الحصول على صورة لجمع الصورة المرجعية للتحفيز المسبق.
   2. التحفيز; عائد الاستثمار: S1 ؛ الفاصل الزمني: لا تأخير; المدة 1.64 ثانية ، الحلقات: 7. تعمل هذه الخطوة على تبييض مضان الخلفية بعدة نبضات من الليزر.
   3. الحصول على صورة. تجمع هذه الخطوة صورة مرجعية لما بعد التحفيز.
   4. في الانتظار؛ لا يوجد إجراء 2 دقيقة. توفر هذه الخطوة فترة استرداد للبضائع الفلورية لإعادة ملء عائد الاستثمار المبيض.
   5. اقتناء; الفاصل الزمني: لا تأخير; المدة 5 دقائق ، الحلقات: 8,615. تجمع هذه الخطوة الصور بأقصى معدل لفترة التصوير البالغة 5 دقائق.
8. بعد إعداد بروتوكول إعداد الكثافة المحايدة، انقر فوق الزر تطبيق إعدادات التحفيز ضمن علامة التبويب إعداد الكثافة المحايدة . انقر فوق تشغيل الآن عندما تكون جاهزا لتصوير نقل البضائع. سيؤدي هذا إلى بدء بروتوكول اكتساب ND من الخطوة 4.7.
   ملاحظة: على الرغم من ضبط معدل الإطارات على 32 إطارا / ثانية ، فقد يكون معدل الإطارات العملي أبطأ (~ 28.7 إطارا / ثانية). يجب تسجيل هذه القيمة لتحليل kymograph الدقيق في القسم 5. من الناحية المثالية ، يتم إجراء تصوير نقل الخلايا الحية بأسرع معدل إطارات ممكن (على سبيل المثال ، >25 إطارا / ثانية) لفك تشفير حركات البضائع بشكل أفضل.
9. إعادة تعيين مجال الرؤية إلى الصورة بأكملها ؛ بعد ذلك ، قم بجمع وحفظ صورة للخلية العصبية الكاملة في قنوات 561 و 647 مع تضمين مربع عائد الاستثمار. سجل إحداثيات XY حيث تم التقاط الصورة لتأكيد ما بعد التثبيت للتعبير عن البروتين محل الاهتمام.
10. اجمع مقاطع فيديو النقل من خليتين عصبيتين على الأقل لتحليلها. تأكد من أن كل نسخة مكررة مستقلة تأتي من وسائل المتغيرات المقاسة من حصاد الخلايا العصبية الأولية الفردية (أي ليس الخلايا العصبية الفردية).
    ملاحظة: بالنسبة لحصاد معين من الخلايا العصبية الأولية ، نقوم بجمع مقاطع فيديو من 2-4 خلايا عصبية لكل حالة.
11. إصلاح الخلايا عن طريق إزالة الوسط واحتضانها مع 4 ٪ بارافورمالدهيد مسخن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت واغسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق لكل منها في TBS.
    ملاحظة: لتثبيت بارافورمالدهايد ، نستخدم المخزن المؤقت للهيكل الخلوي ، وهو مخزن مؤقت شائع يحافظ على بنية الهيكل الخلوي (10 mM 2- (N-morpholino) حمض إيثان سلفونيك [MES] ، 138 mM KCl ، 3 mM MgCl₂ ، و 4 mM EGTA ، درجة الحموضة 6.1). يمكن أيضا استخدام المخازن المؤقتة الأخرى (مثل TBS و PBS) للتثبيت.
12. تأكد من أن الخلايا العصبية التي تم تحليلها تعبر عن كل من البروتين محل الاهتمام وبروتين الشحن الموسوم بالفلورسنت من خلال تلطيخ التألق المناعي. صبغة تاو البشرية (Tau12) لتأكيد تعبير تاو الخارجي و β-III tubulin (Tuj1) للتحقق من أن الخلايا العصبية ظلت سليمة طوال عملية التصوير.
    ملاحظة: نلاحظ التعبير المشترك لكل من تركيبات الحمض النووي في جميع الخلايا المنقولة تقريبا باستخدام هذه الطرق.

5. توليد وتحليل Kymographs

ملاحظة: يمكن إنشاء Kymographs وتحليلها باستخدام مجموعة متنوعة من البرامج المختلفة. نصف بإيجاز برنامج KymoAnalyzer (الإصدار 1.01) المتاح مجانا باستخدام ستة مكونات إضافية ImageJ (v. 1.51n)¹⁶. يمكن تنزيل هذه المكونات الإضافية من المطورين على موقع مختبر Encalada (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer). يمكن العثور على إرشادات أكثر تفصيلا حول استخدام هذا البرنامج في هذا الموقع.

1. قم بتجميع الأفلام التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.9 استنادا إلى الظروف التجريبية ونسخها نسخا متماثلا. قم بتشغيل ماكرو BatchKymographGeneration وحدد المجلد المناسب. ارسم خط متعدد الكيموغراف لتتبع المحور العصبي الذي يبدأ بالنهاية القريبة في تلك الصورة المحددة. يتم تخزين أجهزة القياس الصوتي الناتجة في المجلد المحدد (الشكل 2).
2. قم بتعيين المسارات يدويا عن طريق تشغيل ماكرو المسارات، وتحديد مجلد فيلم فردي، وتحديد نعم لإضافة مسار، ثم النقر لتعقب مسار كل جسيم. قم بإجراء النقرة الأولية في الجزء العلوي من المسار وانقر مرة أخرى في كل نقطة يغير فيها الجسيم السرعة أو الاتجاه بحيث يغطي الخط المتعدد تتبع الجسيم على الكيموغراف. بعد وضع الخط المتعدد على المسار بأكمله ، انقر فوق موافق. كرر حتى يتم تعيين جميع المسارات.
3. قم بتشغيل وحدات الماكرو المتبقية ، مع تعيين معدل الإطارات وحجم البكسل بناء على معلمات التصوير. أولا ، قم بتشغيل CargoPopulation ، ثم NetCargoPopulation ، ثم الشرائح. أدخل حجم البكسل ومعدل الإطارات للأفلام عندما يطلب منك ذلك (0.22 ميكرومتر و 28.7 إطار / ثانية ، على التوالي ، مع هذه الإعدادات). أخيرا ، قم بتشغيل ماكرو poolData لحساب بيانات معلمات النقل وتجميعها من جميع مخططات kymographs في المجلد المحدد.
4. ارسم النتائج من ملفات البيانات وقارن الظروف المختلفة مع النسخ المتماثلة المستقلة التي تمثلها القيم المتوسطة لجميع الخلايا العصبية التي تم تحليلها ضمن حالة تجريبية لحصاد الخلايا العصبية الفردية.

النتائج

باستخدام هذه الطرق ، قمنا بتمييز النقل المحوري في وجود أشكال من بروتين تاو من النوع البري أو المرتبط بالمرض لفحص الآليات المحتملة للسمية العصبية المرضية التي يسببها تاو في المرض^12،13. يقوم برنامج KymoAnalyzer بحساب وتجميع مجموعة متنوعة من المعلمات المختلفة من جميع أجهزة kymographs داخل مجلد معين. يتم حساب معدلات النقل فقط عندما تكون البضائع في حالة حركة (السرعة القطاعية) وكذلك المعدل الإجمالي ، بما في ذلك التوقف المؤقت (السرعة الصافية). يتم حساب كمية البضائع كإجم...

المناقشة

هناك أدلة متزايدة على أن البروتينات المرضية المتعددة المرتبطة بمجموعة متنوعة من الاضطرابات التنكسية العصبية تعطل النقل العصبي السريع في الخلايا العصبية. وهذا يمثل آلية مشتركة محتملة للسمية العصبية عبر هذه الأمراض. لفهم العملية التي تعطل بها هذه البروتينات النقل بشكل أفضل ، نحتاج إلى أدوات ونماذج تسمح لنا بمعالجة أسئلة محددة. تسمح الطريقة الموضحة هنا بفحص الآليات التي تعمل بها البروتينات المرضية للتأثير سلبا على نقل البضائع في الخلايا العصبية الحصين الأولية من القوارض.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.4٪ تريبان بلو	جيبكو	15250-061
1.7 مل أنابيب الطرد المركزي	الدقيقة DOT	RN1700-GMT
2.5٪ تربسين	جيبكو	15090-046
حقنة 3 مل مع إبرة 21 جرام	فيشر	14-826-84
10 مل حقنة بلاستيكية	فيشر	14-823-2A
14 جرام إبرة	فيشر	14-817-203
15 جرام إبرة	Medline	SWD200029Z
16 جرام إبرة	فيشر	14-817-104
18 جرام إبرة	فيشر	14-840-97
22 جرام إبرة	فيشر	14-840-90
32٪ بارافورمالدهايد	فيشر	50-980-495
AlexaFluor 647 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L)	Invitrogen	A21244	RRID: AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
ملقط كبسولة Arruga Micro Embryonic ، منحني ؛ 4 "  ؛	مكمل Roboz	RS-5163	الأوتوكلاف
B-27 (50x) ، مصل خال	المصل Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	فيشر	08-774-124
حمض البوريك	سيجما	B6768-1KG
كلوريد الكالسيوم	سيجما	C7902
Castroviejo 3 1/2 "طويل 8 × 0.15 مم مقص حاد بزاوية	Roboz	RS-5658	جهاز أوتوكلاف
عد			التلقائي أو اليدوي
مع مرفق	غرفة الخلية الحية
			التصوير متحد البؤر
D- (+) -الجلوكوز	Sigma	G7528
DNase I (ورثينجتون)	فيشر	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus	Solution Vortech المستحضرات الصيدلانية ، المحدودة	NDC 0298-9373-68	البنتوباربيتال الصوديوم. يمكن استخدام طرق أخرى معتمدة للقتل الرحيم   ؛
مصل الأبقار الجنيني	Invitrogen	16000044
محلول كاشف الجنتاميسين	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	بديل الجلوتامين
محلول الملح المتوازن هانكس	جيبكو	24020-117
ImageJ الإصدار 1.51n	ImageJ		Life-Line الإصدار 2017 30 مايو: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (الإصدار 1.01)	Encalada Lab		جميع وحدات الماكرو ال 6: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	الاستخدام مع كاشف محسن التعداء P3000
كلوريد المغنيسيوم	فيشر	AC223211000
MES هيدرات	سيجما	M8250
مقص تشريح دقيق 3.5 بوصة مستقيم حاد / حاد	Roboz	RS-5910	الأوتوكلاف
Neurobasal Plus متوسط	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) ماوس IgG2a	UC Davis / NIH NeuroMab	75-172	RRID: AB_2282826 ؛ 250 نانوغرام / مل ؛ يعمل في الخلايا العصبية للفئران ، وليس في الخلايا العصبية للفأر
Neurofascin 186 (D6G60) إشارات خلية IgG للأرانب		15034	RRID: AB_2773024 ؛ 500 نانوغرام / مل ؛ يعمل في الخلايا العصبية للفئران ، لم نختبر في الخلايا العصبية للفئران
مصل ربلة الساق حديثي الولادة	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
طبق بتري ، زجاج 100 × 10 مم	فيشر	08-748B	للتشريح ؛ طبق الأوتوكلاف
بتري ، زجاج 100 × 20 مم	فيشر	08-748D	لوضع قرون الرحم في. الأوتوكلاف
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
أنابيب الطرد المركزي المخروطية من مادة البولي بروبلين (15 مل)		14-955-238
(50 مل)	فيشر	14-955-238
كلوريد البوتاسيوم	فيشر	P217-500
أسيتات الصوديوم	Sigma	S5636
بورات الصوديوم ديكاهيدرات	VWR	MK745706
مقص تشغيل مستقيم شفرة حادة / شارب	فيشر	13-810-2
مرشحات حقنة الأوتوكلاف ، 0.22 ومايكرو ؛ m	VWR	514-1263
ملقط تضميد الإبهام ، مسنن ، 4.5 "	Roboz	RS-8100	الأوتوكلاف
الصغير ؛ - الشريحة 4 قاع زجاجي جيد	المرجع	نفسه 80427