Method Article

توليد وتحليل المصب للنسخ أحادي الخلية وأحادي النوى في عضويات الدماغ

DOI:

10.3791/66225

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد وتحليل المصب لعضويات الدماغ البشري باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنواة الواحدة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقد الماضي ، تطورت النسخ أحادية الخلية بشكل كبير وأصبحت طريقة مختبرية قياسية للتحليل المتزامن لملفات تعريف التعبير الجيني للخلايا الفردية ، مما يسمح بالتقاط التنوع الخلوي. من أجل التغلب على القيود التي تفرضها أنواع الخلايا التي يصعب عزلها ، يمكن استخدام نهج بديل يهدف إلى استعادة النوى المفردة بدلا من الخلايا السليمة للتسلسل ، مما يجعل التنميط النسخي للخلايا الفردية قابلا للتطبيق عالميا. أصبحت هذه التقنيات حجر الزاوية في دراسة عضويات الدماغ ، وتأسيسها كنماذج للدماغ البشري النامي. من خلال الاستفادة من إمكانات النسخ أحادية الخلية والنواة المفردة في أبحاث الأعضاء في الدماغ ، يقدم هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة يشمل الإجراءات الرئيسية مثل تفكك الأعضاء ، وعزل الخلية الواحدة أو النوى ، وإعداد المكتبة والتسلسل. من خلال تنفيذ هذه الأساليب البديلة ، يمكن للباحثين الحصول على مجموعات بيانات عالية الجودة ، مما يتيح تحديد أنواع الخلايا العصبية وغير العصبية ، وملامح التعبير الجيني ، ومسارات نسب الخلايا. هذا يسهل التحقيقات الشاملة في العمليات الخلوية والآليات الجزيئية التي تشكل نمو الدماغ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى السنوات الماضية ، ظهرت تقنيات الأعضاء كأداة واعدة لزراعة الأنسجة الشبيهةبالأعضاء 1،2،3. خاصة بالنسبة للأعضاء التي لا يمكن الوصول إليها بسهولة ، مثل الدماغ البشري ، توفر الكائنات العضوية الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على التطور ومظاهر المرض4. على هذا النحو ، تم استخدام عضويات الدماغ على نطاق واسع كنموذج تجريبي للتحقيق في اضطرابات الدماغ البشرية المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنموية أو النفسية أو حتى الأمراض التنكسية العصبية4،5،6.

مع ظهور تقنيات التنميط بالنسخ أحادية الخلية ، يمكن دراسة الأنسجة البشرية الأولية والنماذج المعقدة في المختبر بمستوى غير مسبوق من الدقة ، مما يوفر رؤى ميكانيكية حول تغيرات التعبير الجيني على مستوى المجموعات السكانية الفرعية للخلايا في الصحة والمرض والإبلاغ عن الأهداف العلاجية المفترضة الجديدة7،8،9. تقدم مجال العضوي من خلال استخدام التنميط النسخي أحادي الخلية لتقييم التركيب الخلوي وقابلية التكاثر ودقة تقنيات الدماغ العضوية10،11،12. مكن تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) من تصنيف الخلايا وتحديد عدم التنظيم الجيني في الكائنات العضوية المريضة13,14. الأهم من ذلك ، هو تعقيد الأنسجة العضوية التي تستلزم تنفيذ التقنيات التي تمكن من تنميط الخلايا الفردية. يؤدي توصيف المواد العضوية باستخدام طرق مثل التنميط بالنسخ السائب (تسلسل الحمض النووي الريبي السائب) إلى عدم تجانس خلوي مقنع وملامح التعبير الجيني التي يتم حسابها في المتوسط عبر جميع أنواع الخلايا داخل الأنسجة المعقدة ، مما يحد في النهاية من فهمنا للعمليات الجارية أثناء تطور الأعضاء في الصحة والمرض15،16،17. مع استمرار تقدم طرق scRNA-seq ، يتم إنشاء عدد متزايد من الأطالس ، ويتجلى ذلك في موارد مثل أطلس ألين للدماغ أو أطلس الخلية المفردة لعضويات الدماغ البشري بواسطة Uzquiano et al.18.

يعتمد تحقيق scRNA-seq الناجح من عضويات الدماغ على العزلة الفعالة والتقاط الخلايا السليمة. نظرا لأن تفكك عضويات الدماغ للحصول على خلايا فردية يعتمد على الهضم الأنزيمي ، فإنه يمكن أن يؤثر على أنماط التعبير الجيني عن طريق إحداث الإجهاد وتلف الخلايا19,20. وبالتالي ، فإن تفكك الأنسجة إلى خلايا فردية هو الخطوة الأكثر أهمية. النهج البديل هو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) ، والذي يسهل استخراج النوى الخالية من الإنزيم من الأنسجة الطازجة والمجمدة21,22. ومع ذلك ، فإن عزل النوى عن الأنسجة يطرح تحديات أخرى مثل إثراء أنواع الخلايا ذات الأهمية وانخفاض محتوى الحمض النووي الريبي للنوى مقارنة بالخلايا.

عادة ما يتم إجراء دراسات Transcriptome لعضويات الدماغ باستخدام scRNA-seq10،18،23. ومع ذلك ، قد يوفر عزل النوى المفردة طريقة متعامدة وتكميلية للتحقق من المظهر النسخي للعضويات. هنا ، نقدم صندوق أدوات ل scRNA- و snRNA-seq لعضويات الدماغ ونناقش النقاط الحرجة للحصول على أفضل بيانات التسلسل جودة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنفيذ البروتوكول الموصوف في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 1 التابع لمركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي (رقم الموافقة: 138/08) ، وفقا للمتطلبات وامتثالا لقواعد الاتحاد الأوروبي والقواعد الوطنية بشأن الأخلاقيات في البحث.

1. اشتقاق عضويات الدماغ الأمامي من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)

ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول لعدة خطوط iPSC مختلفة مستزرعة في مجموعة متنوعة من وسائط الخلايا الجذعية من شركات مختلفة (الجدول 1). يعتمد توليد عضويات الدماغ الأمامي بشكل كبير على iPSCs عالية الجودة والتقاء 60٪ -70٪ قبل بدء البروتوكول. هنا استخدمنا خط خلية متاح تجاريا (انظر جدول المواد).

  1. اليوم 0: تكوين الجسم الجنيني
    1. لمعالجة صفيحة 96 بئرا بمحلول بلوروني ، أضف 80 ميكرولتر من محلول بلوروني معقم مصفى بنسبة 2٪ لكل بئر من صفيحة قاع U ذات 96 بئرا. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الألواح المعالجة متعددة الطبقات في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع ويمكن استخدامها مباشرة دون أي خطوات غسيل لتشكيل الجسم الجنيني.
    2. قم بإزالة محلول pluronic من كل بئر باستخدام شفاط أو ماصة متعددة القنوات قبل بذر الخلايا.
    3. قبل البدء ، قم بإعداد الكواشف التالية للوحة واحدة ذات 96 بئرا: أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مع 5 مل من DMEM المسخن مسبقا: F12 medium. 11 مل من وسط الخلايا الجذعية المكمل ب 50 ميكرومتر Y-27632 ، صفيحة معالجة متعددة الأطراف (كما هو موضح أعلاه).
    4. قم بشفط الوسائط من بئر واحد من لوحة ذات 6 آبار من 60-70٪ من iPSCs المتقاربة. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 500 ميكرولتر من الكاشف القائم على التربسين واحتضانه لمدة 2-6 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة للانفصال المناسب للخلايا باستخدام الكاشف القائم على التربسين على كثافة الخلية وخصائص لاصقة مصفوفة الخلية لكل خط iPSC. لتجنب الإفراط في الهضم ، ينصح بفحص مورفولوجيا الخلية بعد 2 دقيقة من الحضانة باستخدام كاشف قائم على التربسين باستخدام مجهر المجال الساطع.
    5. افصل الخلايا باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل المعد مسبقا باستخدام وسيط DMEM: F12 لوقف التفكك.
    6. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم. نضح طاف والحفاظ على بيليه الخلية. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط الخلايا الجذعية المكمل ب 50 ميكرومتر Y-27632.
    7. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا وأضف العدد المطلوب من الخلايا إلى وسائط الخلايا الجذعية المكملة ب 50 ميكرومتر Y-27632. يتطلب توليد جسم جنيني واحد 3000-12000 خلية اعتمادا على خط الخلية.
    8. انقل معلق الخلية إلى خزان كاشف متعدد القنوات باستخدام ماصة سعة 10 مل. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، لوحة 100 ميكرولتر / بئر من تعليق الخلية في لوحة 96 بئر المعالجة سابقا pluronic.
    9. ضع صفيحة 96 بئرا في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ O2 و 5٪ CO2. لتجنب أي اضطراب أثناء تكوين الجسم الجنيني ، امتنع عن تحريك اللوحة.
  2. اليوم 2: فحص تكوين الجسم الجنيني
    1. افحص تكوين الجسم الجنيني باستخدام هدف 10x من مجهر المجال الساطع. يجب أن تظهر الأجسام الجنينية حوافا واضحة والحد الأدنى من موت الخلايا.
    2. نضح أكبر قدر ممكن من الوسط واستبدله ب 100 ميكرولتر / بئر من وسط الخلايا الجذعية. (حرجة) تتم إزالة الأجسام الجنينية بسهولة من البئر أثناء التبادل المتوسط. انتبه إلى عدم إزالتها ، لذلك راقب الوسيط بعد الطموح.
  3. اليوم 3: تحريض الأديم الظاهر العصبي
    1. نضح أكبر قدر ممكن من الوسط واستبدله ب 120 ميكرولتر / بئر من وسط الحث وضع اللوحة عند 37 درجة مئوية و 20٪ O2 و 5٪ CO2.
  4. اليوم 6: التضمين
    1. اعتمادا على خط iPSC ، يلزم 3 أو 4 أيام للحث على ظهور الأديم الظاهر العصبي. مراقبة الأجسام الجنينية بانتظام. بمجرد أن تصبح الحواف ساطعة ، تكون الأجسام الجنينية جاهزة للتضمين. استخدم إحدى الطريقتين المختلفتين اللتين يمكن استخدامهما لتضمين الجسم الجنيني كما هو موضح أدناه24.
    2. طريقة التضمين 1: تضمين ملفات تعريف الارتباط
      1. قم بإذابة حصة من هلام المصفوفة خارج الخلية غير المخفف على الجليد لمدة 1-2 ساعة. (حرج) احتفظ دائما بهلام مصفوفة خارج الخلية على الجليد لمنعه من التصلب. قم بإعداد الحصص مسبقا لتقليل وقت الذوبان ودورات الذوبان المتكررة.
      2. قطع طرف ماصة 200 ميكرولتر باستخدام كماشة مخلب وجمع 16-32 جثة جنينية في أنبوب طرد مركزي واحد 1.5 مل.
      3. نقل الأجسام الجنينية في 67 ميكرولتر من الوسائط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. أضف 100 ميكرولتر من جل المصفوفة خارج الخلية باستخدام طرف ماصة مقطوع 200 ميكرولتر واخلطه برفق.
      4. وزعي الأجسام الجنينية بالتساوي في طبق 6 سم وضعي الطبق لمدة 5-10 دقائق للسماح لهلام المصفوفة خارج الخلية بالتصلب.
      5. أضف حوالي 4 مل من وسائط التمايز واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 20٪ O2 و 5٪ CO2. في اليوم التالي ، ضع الطبق على شاكر مداري (84 دورة في الدقيقة). تأكد من انفصال جميع الأجسام الجنينية عن القاع. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستخدم طرف ماصة مقطوع ووسائط لفصلهما برفق.
    3. طريقة التضمين 2: التضمين السائل
      1. قم بإذابة قسمة من هلام المصفوفة خارج الخلية غير المخفف على الجليد لمدة 1-2 ساعة ووضع وسائط التمايز على الجليد. (حرجة) يجب أن تكون الوسائط باردة عند إضافة هلام مصفوفة خارج الخلية.
      2. بمجرد أن يصبح الوسط باردا ، أضف هلام مصفوفة خارج الخلية إلى التركيز النهائي البالغ 2٪. قطع طرف ماصة 200 ميكرولتر باستخدام كماشة مخالب ونقل ما يصل إلى 24 جثة جنينية إلى بئر واحد من صفيحة 6 آبار.
      3. قم بإزالة جميع الوسائط الزائدة وأضف حوالي 4 مل من 2٪ من هلام المصفوفة خارج الخلية / وسائط التمايز في بئر واحد من لوحة 6 آبار. ضع اللوحة على الفور على شاكر المداري (84 دورة في الدقيقة).
  5. اليوم 9-20: قم بإجراء تبادل وسائط كامل باستخدام وسائط التمايز كل 3-4 أيام.
  6. اليوم 21-30: نقل المواد العضوية إلى وسائط النضج وإجراء تبادلات وسائط كاملة كل 3-4 أيام.
  7. تفكك المواد العضوية: لتفكك النوى المفردة والخلايا ، استخدم المواد العضوية ذات الجودة العالية. لتجنب الكميات الزائدة من موت الخلايا ، قم بقطع المواد العضوية بانتظام لمنع تراكم النواة الميتة والسماح لها بالتعافي لمدة 2 أسابيع قبل فصلها لمزيد من التحليل.

2. اشتقاق خلية واحدة من المواد العضوية

ملاحظة: يتم إجراء تفكك الخلية المفردة باستخدام مجموعة تفكك الأنسجة العصبية (الجدول 2) ، والتي تستخدم التفكك الميكانيكي والأنزيمي. هنا نصف التفكك الميكانيكي اليدوي. كبديل ، يمكن استخدام آلة التفكك.

  1. تحضير محلول STOP و 0.04٪ BSA على الجليد. تحضير مزيج الانزيم 1 و 2 و 0.04٪ BSA في برنامج تلفزيوني ووضعه على الجليد.
  2. اجمع ما يصل إلى 5 مواد عضوية في بئر واحدة من صفيحة ذات 6 آبار ونضح الوسائط الزائدة واغسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة وسائط الثقافة. ضع المواد العضوية في منتصف البئر وباستخدام مشرط ، قم بفرم المواد العضوية جيدا.
  3. يضاف مزيج الإنزيم 1 ويوضع عند 37 درجة مئوية ، 20٪ O2 و 5٪ CO2 ، ويهز عند 90 دورة في الدقيقة لمدة 10-15 دقيقة.
  4. باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر ، أعد تعليق المواد العضوية عن طريق سحب ما يصل إلى 10x. أضف مزيج الإنزيم 2 واخلطه جيدا عن طريق السحب باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر. ضع عند 37 درجة مئوية ، 20٪ O2 و 5٪ CO2 ، اهتز عند 90 دورة في الدقيقة لمدة 10-15 دقيقة.
  5. أوقف عملية التفكك عن طريق تعليق محلول الخلية في 10 مل من محلول STOP البارد. قم بتصفية محلول الخلية باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي محلول الخلية المصفى لمدة 10 دقائق عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لتشكيل حبيبة.
  6. نضح الوسائط ، وترك حبيبات الخلية وإعادة تعليق الخلايا في 4 مل من البرد 0.04٪ BSA. قم بتصفية محلول الخلية باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
  7. الطرد المركزي محلول الخلية لمدة 10 دقائق عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية. نضح محلول BSA ، وترك بيليه الخلية. أعد تعليق الخلايا وفقا لدليل مجموعة snRNA-seq القائم على الموائع الدقيقة في وسط NSB +.

3. عزل النوى المفردة عن المواد العضوية

  1. نقل المواد العضوية إلى برنامج تلفزيوني مبرد وقطع كل عضوي إلى 4 قطع. اغسل المواد العضوية 2x باستخدام برنامج تلفزيوني مبرد.
  2. قطع بالمقص طرف ماصة ماصة 1000 ميكرولتر ونقل القطع العضوية إلى حارس 2 مل. نضح PBS تماما وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل NP40.
  3. ارتد 3x مع مدقة dounce A و 3x مع مدقة dounce B. نقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل. اغسل الحارس بمخزن مؤقت إضافي للتحلل NP40 بمقدار 1 مل وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. احتضان لمدة 5 دقائق في RT وبعد ذلك تعليق أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × غرام.
  4. نضح طاف تاركا 50 ميكرولتر من المادة الطافية خلفه. أضف 1 مل من NSB + دون إزعاج الحبيبات. يعاد التعليق بعد 5 دقائق من الحضانة.
  5. تعليق الطبقة أعلى تدرج Percoll (الطبقة السفلية: 1 مل من NSB + و 250 ميكرولتر من Percoll ، الطبقة الوسطى: 1 مل من NSB + و 188 ميكرولتر من Percoll ، الطبقة العليا: 1 مل من NSB + و 125 ميكرولتر من Percoll). (حرجة) قم بإجراء الطبقات بعناية فائقة لتجنب خلط الطبقات.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية ، نضح طاف وإعادة تعليقه في NSB +. قم بتصفية محلول النوى باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  7. قم بتلطيخ النوى وعدها باستخدام DAPI وغرفة نيوباور. أعد تعليق النوى وفقا لدليل مجموعة scRNA-seq القائم على الموائع الدقيقة.

4. إعداد المكتبة وتسلسلها

  1. قم بتحميل 10000 خلية ونواة في نظام الموائع الدقيقة وقم بإنشاء المكتبة وفقا لدليل مجموعة scRNA-seq القائمة على الموائع الدقيقة (جدول المواد).
  2. تسلسل المكتبات مع ما يقدر ب 6 × 108 قراءات لكل مكتبة snRNA-seq و 1.6 × 108 قراءات لكل مكتبة scRNA-seq ، مما يؤدي إلى تشبع تسلسل بنسبة 87٪ لمجموعة بيانات snRNA-seq و 36٪ تشبع تسلسل لمجموعة بيانات scRNA-seq.

5. التحليل

  1. إجراء تحليل التسلسل باستخدام خط أنابيب تحليل البيانات ل scRNA-seq و snRNA-seq والمحاذاة مع جينوم GRCh38 البشري. إخضاع مصفوفة العد التي تم إنشاؤها بواسطة خط الأنابيب هذا لمزيد من التحليل باستخدام R-package Seurat (الإصدار 4.1.1)25.
  2. قم بإنشاء كائن Seurat من خلال النظر في الجينات التي تم تمثيلها في 5 خلايا على الأقل ودمج الخلايا التي تحتوي على 300 جين على الأقل. قم بإجراء تصفية إضافية لمراقبة الجودة عن طريق الاحتفاظ بالخلايا التي تحتوي على أكثر من 1000 جين ولكن أقل من 4000 جين لمجموعة بيانات scRNA-seq وأكثر من 800 ، ولكن أقل من 4000 جين لكل نواة لمجموعة بيانات snRNA-seq. استبعاد خلايا مجموعات البيانات والنوى التي تتجاوز 5٪ من قراءات الميتوكوندريا.
  3. للتخفيف من تأثيرات الدفعات بين كلتا الطريقتين ، قم بدمج كل من مجموعات البيانات التي تمت تصفيتها ، وقم بالتطبيع والتصور عبر التقريب والإسقاط المتشعب الموحد (UMAP). حذف المجموعة 1 التي تعرض المعرف الجزيئي الفريد المنخفض (UMI) وعدد الجينات. بعد ذلك ، بالنسبة للمجموعات ، قم بتعيين هويات الخلايا بناء على جينات العلامات المعروفة ومجموعة البيانات العضوية البالغة من العمر 30 يوما من Ana Uzquiano et. (ملف الترميز التكميلي 1)18.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتحقيق في تكوين نوع الخلية من عضويات الدماغ باستخدام scRNA-seq و snRNA-seq ، تم حصاد عضويات الدماغ بعد 30 يوما من الثقافة حيث تظهر الكائنات العضوية في هذه المرحلة بالفعل حلقات ظهارية عصبية تتكون من أسلاف محاطة بأسلاف وسيطة وخلايا عصبية في مرحلة مبكرة 4,18. تعد مراقبة جودة المواد العضوية طوال فترة النمو والزراعة أمرا ضروريا للحصول على بيانات موثوقة أحادية الخلية ونواة واحدة.

تتشكل الكائنات العضوية من خلال تجميع iPSCs في أجسام جنينية (الشكل 1B ، C). عند التجميع ، من المتوقع أن تظهر هذه الأجسام الجنينية حوافا واضحة مع الحد الأدنى من الحطام الخلوي (الشكل 1C). بعد تحريض الأديم الظاهر العصبي ، تظهر الأجسام الجنينية سطوعا ملحوظا حول السطح مع منطقة داخلية أغمق نسبيا ، مما يشير إلى تحريض عصبي ناجح (الشكل 1 د). في الأسابيع التالية ، تطور الكائنات العضوية ما يسمى بالحلقات ، وهي هياكل تشبه الوردة العصبية ، تتكون بشكل أساسي من الخلايا الظهارية العصبية (الشكل 1E ، F). على الرغم من أنه يمكن الحفاظ على هذه المواد العضوية في الثقافة على مدى عدة أشهر ، تجدر الإشارة إلى أنه مع زيادة حجمها ، هناك زيادة مقابلة في موت الخلايا في الجزء الداخلي من الكائنات العضوية بسبب نقص العناصر الغذائية وتوافر الأكسجين ، مما يؤدي في النهاية إلى تطوير نواة نخرية.

من أجل استكشاف التنوع الخلوي داخل الكائنات العضوية القشرية من خلال تحليل التسلسل ، قمنا بعزل كل من الخلايا المفردة والنوى من الكائنات العضوية. لموازنة عدم التجانس المتأصل داخل دفعة واحدة من عضويات الدماغ ، أجرينا تسلسلا لأربعة عضويات مجمعة من دفعة واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، لأغراض المقارنة بين عمليات العزل ولإزالة تأثيرات الدفعات بين snRNA-seq ومكتبة scRNA-seq ، تم تقسيم هذه الكائنات العضوية إلى نصفين (ثمانية أنصاف في المجموع. الشكل 2). بعد العزل الأنزيمي للخلايا الفردية ، من الأهمية بمكان التأكد من بقاء بقاء الخلية أعلى من 80٪ ، مع ملاحظة أن الخلايا تحافظ على مورفولوجيا مستديرة (الشكل 3 أ ، ب). وبالمثل ، يجب أن ينتج العزل الميكانيكي للنوى الفردية نوى سليمة بأحجام مختلفة مع الحد الأدنى من الحطام الذي يمكن اكتشافه أو بدونه (الشكل 3C ، D).

كشف تحليل التسلسل أنه تم التقاط خلايا أكثر من النوى وتسلسلها. أظهرت كلتا مجموعتي البيانات جودة جيدة تم تقييمها من خلال ارتفاع عدد الجينات و UMI لكل خلية ونواة ، والنسبة المئوية المنخفضة لقراءات الميتوكوندريا (الشكل 4A-C). كما هو متوقع ، تشتمل قراءات الميتوكوندريا وكذلك الريبوسوم على جزء أعلى من إجمالي القراءات المستردة في مجموعة بيانات scRNA-seq مقارنة بمجموعة بيانات snRNA-seq. في مجموعة بيانات scRNA-seq ، احتوت معظم الخلايا على أقل من 30٪ من قراءات الريبوسوم ، بينما في مجموعة بيانات snRNA-seq ، احتوت غالبية النوى على أقل من 5٪ من قراءات الريبوسوم. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي غالبية الخلايا التي تم التقاطها داخل مجموعة بيانات scRNA-seq على أقل من 5٪ من قراءات الميتوكوندريا. بعد تصفية قراءات الميتوكوندريا ، اجتازت حوالي 10000 خلية و 3000 نواة عتبة الجودة.

كشف التحليل التكاملي لكلتا مجموعتي البيانات أن جميع المجموعات ممثلة في كلتا مجموعتي البيانات ، مما يشير إلى أن كلتا الطريقتين تستعيدان نفس أنواع الخلايا (الشكل 5A ، C). يظهر التعليق التوضيحي لمجموعة البيانات أن مجموعات الخلايا الرئيسية تتكون من الخلايا الدبقية الشعاعية ، والأسلاف الوسيطة ، والأسلاف تحت القشرية والخلايا العصبية ، بالإضافة إلى الخلايا العصبية ذات إسقاط الطبقة العميقة لحديثي الولادة وأنواع الخلايا الأقل تمثيلا مثل Cajal-Retzius ، والحافة القشرية وخلايا الضفيرة المشيمية (الشكل 5B). بشكل عام ، يمكن ل scRNA-seq و snRNA-seq استعادة جميع أنواع الخلايا المتوقع وجودها في عضو الدماغ20 البالغ من العمر 30 يوما.

تشكيل الجسم الجنيني إلى الجدول الزمني للنضج. صور الفحص المجهري مراحل تمايز الخلايا.
الشكل 1: توليد عضويات الدماغ من iPSCs. الدورة الزمنية لتوليد الأعضاء في الدماغ (أ). صور نموذجية للتمايز القشري الناجح من iPSCs (B) ، والتي تشكل أجساما جنينية (72 ساعة بعد البذر) (C) وتظهر تحريضا عصبيا ناجحا بعد 7 أيام من المزرعة (D). يصور Organoid حلقات مميزة في اليوم 15 (E) واليوم 30 (F). شريط المقياس: B-D 200 ميكرومتر ، E 400 ميكرومتر ، F 800 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنواة ؛ التفكك الأنزيمي ، طريقة التدرج بيركول.
الشكل 2: سير العمل للحصول على خلايا مفردة ونوى مفردة من عضويات الدماغ. يتم تفكك المواد العضوية إلى خلايا مفردة عن طريق فرم المواد العضوية بمشرط ، يليه الهضم الأنزيمي (أعلى). يتم عزل النوى عن طريق التفكك الميكانيكي ، يليه التنقية عبر تدرج Percoll (أسفل). يتم ترشيح الخلية المفردة وتعليق النوى وتحميلها في نظام الموائع الدقيقة لتوليد المكتبة وتسلسلها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

صور الفحص المجهري للخلية تظهر كثافات الخلايا المختلفة وأنماط التلوين. الطريقة تشمل تلطيخ.
الشكل 3: النتائج التمثيلية للخلايا والنوى المعزولة من عضويات عمرها 30 يوما. (أ) صورة نموذجية لخلايا ملطخة بالتريبان باللون الأزرق التقطت باستخدام عداد خلوي، و(ب) صورة مقربة مناظرة. (ج) تراكب صورة الحقل الساطع والفلورسنت لنوى DAPI الملطخة و (د) الصورة المقربة المقابلة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخططات الكمان تظهر تباين البيانات حسب الهوية. نتائج التحليل الإحصائي.
الشكل 4: مراقبة جودة تسلسل scRNA- و snRNA. توضح مخططات الكمان عدد UMI المطلق (A) ، وعدد الجينات (B) ، والميتوكوندريا (C) ، وقراءات الريبوسوم (D) للخلايا (الأزرق) والنوى (الوردي الأرجواني). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط UMAP يوضح مجموعات scRNAseq و snRNAseq ، تحليل التعبير الجيني في الخلايا العصبية.
الشكل 5: يستعيد scRNA-seq و snRNA-seq مجموعات خلايا مماثلة في عضويات عمرها 30 يوما. UMAP مدمج مدمج من المواد العضوية القديمة لمدة 30 يوما ، والتي تظهر نتائج scRNA-seq (الأزرق) و snRNA-seq (الوردي الأرجواني) (A) ، والملفات الشخصية المتكاملة والمشروحة والفردية ل scRNA-seq و snRNA-seq (B ، C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وسائط زراعة الخلايا ومكونات الطلاء الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مخازن التفكك ل scRNA و snRNA-seq. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

ملف الترميز التكميلي 1: ملف الترميز المستخدم لتحليل بيانات scRNA-seq و snRNA-seq. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برز التحليل النسخي للخلايا المفردة والنوى المفردة كأداة محورية لفهم الآليات التنظيمية الجينية داخل الأنسجة المعقدة. كلتا الطريقتين تمكن من دراسات النسخ من عضويات الدماغ. لضمان تجربة ناجحة بشكل عام ، تكون جودة المواد الأولية ذات أهمية عالية. لذلك ، من الضروري قطع المواد العضوية بانتظام لمنع تكوين نواة نخرية26. من الممكن أيضا التخلص من هذه المشكلة باستخدام ثقافة واجهة الهواء والسائل27. لتقليل تأثيرات الدفعات بسبب عدم التجانس العضوي ، نقترح استخدام أربعة عضويات على الأقل لكل استخراج. بدلا من ذلك ، من الممكن إجراء عمليات تسلسل متعددة للعضويات الفردية ، مما يسمح أيضا بفحص التباين داخل نفس الدفعة17. عند استخدام كلتا الطريقتين ، scRNA-seq و snRNA-seq ، بالتوازي ، يمكن أن يؤدي تقطيع المواد العضوية إلى قسمين وتقسيمها لكل طريقة إلى تقليل الاختلافات الناتجة عن عدم التجانس العضوي.

للحصول على ملف تعريف نسخي عالي الجودة لخلية أو نواة فردية ، من الأهمية بمكان أن يظل الغشاء الخلوي أو النووي سليما أثناء الإجراء بأكمله. لذلك ، من الأهمية بمكان تحسين كل من تركيز الإنزيم وتوقيت الهضم الأنزيمي ، والذي يحتاج إلى تعديل لعمر وحجم العضو العضوي. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري استخدام درجات الحرارة الصحيحة وسرعة الطرد المركزي وتجنب السحب القاسي. في حالة انخفاض الصلاحية ، يمكن استخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة بعد تفكك الكائنات العضوية إلى خلايا مفردة. تكميلي ، لعزل النوى ، من الضروري غسل العضو العضوي بعناية باستخدام برنامج تلفزيوني وتكييف عدد السكتات الدماغية مع الحارس مع حجم العضو العضوي. من المهم أيضا وضع طبقة من تدرج Percoll بعناية لتجنب الاضطرابات في الطبقات. إذا بقيت النوى التالفة بعد العزل ، ينصح بتنفيذ خطوة فرز عبر فرز الخلايا المنشطة بالفلورة22. بشكل عام ، يعد استخدام مثبطات RNAse أمرا حيويا لجميع الخطوات من تفكك العينة إلى إنشاء المكتبة للحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة لكل خلية أو نواة.

في هذه الدراسة ، أنتج scRNA-seq المزيد من الخلايا ، مما يسمح بنظرة عامة أوسع على مجموعات الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي الخلايا على المزيد من الحمض النووي الريبي ويسهل إثراؤها لأنواع معينة من الخلايا من خلال علامات السطح مقارنة بالنوى. ومع ذلك ، يعتمد تفكك الخلية المفردة على عملية إنزيمية يمكن أن تحفز نسخ الحمض النووي الريبي المرتبط بالإجهاد19,28. خاصة في الأمراض المرتبطة بزيادة الاستجابة للإجهاد ، يمكن أن يؤدي ذلك إلى القطع الأثرية التي يسببها التفكك20. علاوة على ذلك ، تبين أن عزل الخلية الواحدة أدى إلى فقدان مجموعات الخلايا الحساسة 3,29. في حين أن هذا قد لا يكون واضحا في هذه الدراسة ، إلا أنه نتيجة محتملة عند استخدام عضويات الدماغ القديمة التي تتميز بتنوع خلوي أعلى.

نظرا لأن مجموعتي البيانات تستعيدان نفس مجموعات الخلايا ، فإن اختيار طريقة العزل يعتمد بشدة على أسئلة البحث واكتساب الأنسجة وإدارة الوقت. بينما بعد التفكك ، أصبح تثبيت وتخزين الخلايا المفردة من عضويات الدماغ في الميثانول راسخا30 ، فإن عزل النوى المفردة عن عضويات الدماغ المجمدة لا يزال يتطلب التحسين.

بشكل عام ، توفر بروتوكولاتنا منصة متعددة الاستخدامات وقابلة للتكيف للتحقيق في الملف النسخي للخلايا والنوى الفردية في عضويات الدماغ ، مما يمهد الطريق لإجراء تحقيقات متعمقة في الأسئلة المتعلقة بالنمو والأمراض في نماذج الدماغ البشري في المختبر.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر فاليريا فرنانديز فالون على التعليمات الأصلية لمجموعة Miltenyi Neural Disdisation. نشكر أيضا منصة تكنولوجيا الجينوم الخاصة ب Max Delbrueck Centrum على توفير وصفة المخزن المؤقت للتحلل NP40 والمشورة القيمة لإعداد هذا البروتوكول. كما نشكر مارغريتا هيرتسوغ وألكسندرا تشيرنيشيف على الدعم التنظيمي للمختبر.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1،4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~ 1 M في H2O (DTT)Sigma  43816-10ML
1.5 مل DNA أنابيب ربط منخفضة VWR525-0130أنبوب الطرد المركزي الصغير
10x خط أنابيب Cellranger   ؛أنبوب الطرد المركزي
فالكون 15 مل
2-ميركابتو إيثانول (BME)لايف تكنولوجيز21985023
50 ملأنبوب الطرد المركزي
فالكون A83-01بيو تكنولوجيز379762
محلول مضاد حيوي / مضاد للفطريات (100X)لايفتكنولوجيز 15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 مكمل غذائي بدون فيتامين ALife Technologies12587010
ألبومين مصل البقر ، خالي من الأحماض الدهنية (BSA)Sigma AldrichA8806-5G & nbsp ؛
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER مصفاةVWRDHC-N01
المحسنة 40 & micro ؛ مNeolab352340
مصفاة الخلايا 70 & م (أبيض) نايلونسيجماCLS431751-50EA
تحكم الكروم & Next GEM AccessoryKit 10X Genomics1000204
الكروم التالي GEM Chip G مجموعة خلية واحدة ، 16 rxns10X الجينوم1000127
الكروم التالي GEM Single Cell Kit v3.110X الجينوم1000268
كامل،  كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTARoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM / F12Life Technologies11320074
مجموعة مطحنة المناديل Dounce 2 مل كاملSigma Aldrich10536355
Essential E8 FlexMedium Life TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting شرائحVWREVS-050 (734-2676)
مصل الأبقار الجنيني خالي من التتراسيكلين (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (طلاء)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecتفكك maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
اختبار ثقافة خلايا الصوديوم الهيبارينSigmaH3149-10KU
BDNFStemCell Technologies78005.3
الخلايا الجذعيةGDNF المؤتلفة البشرية78058.3
محلول الأنسولين البشريسيجما ألدريتشI2643-25MG
استبدال مصل بالضربة القاضيةلايفتكنولوجيز 10828028
LDN193189 هيدروكلوريد 98٪سيجما ألدريتش130-106-540
MEM حمض أميني غير أساسي (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 كلوريد المغنيسيوم (1M) حراري خال من RNAse ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276الخلايا الجذعية المتوسطة
mTeSR1StemCell Technologies85850الخلايا الجذعية المتوسطة
N2 Supplement الخلايا الجذعية17502048
طقم تفكك الأنسجة العصبيةMiltenyi Biotec BV & Co. KG130-092-628
تقنيات Neurobasal PlusLifeA3582901
NextSeq500 نظامIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS دولبيكو sInvitrogen14190169
PenStrep (البنسلين - الستربتومايسين)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
مثبط الصخور (Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
كلوريد الصوديوم كلوريد الصوديوم (5M) ، RNase خالية من 100 ملInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401الخلايا الجذعية المتوسطة
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368الخلايا الجذعية المتوسطة
TC-Platte 96 Well, جولةالقاع Sarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
تريبان بلوT8154-20mlإنزيم سيجما
تريب إل إكسبريس ، بدون فينول أحمرلايف تكنولوجيز12604013كاشف قائم على التربسين
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer ، درجة الحموضة 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo LifeSciencesBML-WN100-0005
فالكون فالكون خلية تقنيات تقنيات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715(2015).
  3. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  6. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929(2021).
  7. Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169(2021).
  8. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  9. Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
  10. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  11. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312(2022).
  12. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  13. Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
  14. Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
  15. Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
  16. Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
  17. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  18. Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
  19. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).
  20. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  21. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694(2021).
  23. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
  24. Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213(2023).
  25. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  26. Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350(2021).
  27. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  29. Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339(2022).
  30. Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44(2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell TranscriptomicsSingle Nuclei TranscriptomicsBrain OrganoidsOrganoid DissociationNuclei IsolationLibrary PreparationRNA SequencingSpatial TranscriptomicsCell Type RecoveryGene Expression Profiles

Related Articles