يعد استعمار البكتيريا الجذرية المعززة لنمو النبات (PGPR) في الغلاف الجذري أمرا ضروريا لتأثيره المعزز للنمو. من الضروري توحيد طريقة الكشف عن استعمار الجذور البكتيرية. هنا ، نصف طريقة قابلة للتكرار لقياس الاستعمار البكتيري على سطح الجذر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس الاستعمار البكتيري على جذور أرابيدوبسيس ثاليانا في حالة الزراعة المائية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد قياس الاستعمار البكتيري على جذر Arabidopsis thaliana أحد أكثر التجارب شيوعا في دراسات التفاعل بين النبات والميكروب. طريقة موحدة لقياس الاستعمار البكتيري في الجذور ضرورية لتحسين التكاثر. قمنا أولا بزراعة A.thaliana المعقمة في ظروف الزراعة المائية ثم تلقيح الخلايا البكتيرية في الجذور بتركيز نهائي قدرهOD 600 من 0.01. في 2 أيام بعد التلقيح ، تم حصاد أنسجة الجذر وغسلها ثلاث مرات في الماء المعقم لإزالة الخلايا البكتيرية غير المستعمرة. ثم تم وزن الجذور ، وتم جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذر بواسطة دوامة. تم تخفيف تعليق الخلية في تدرج مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، متبوعا بالطلاء على وسط أجار Luria-Bertani (LB). تم تحضين الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات ، وبعد ذلك ، تم عد المستعمرات المفردة على ألواح LB وتطبيعها للإشارة إلى الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذور. تستخدم هذه الطريقة للكشف عن الاستعمار البكتيري في الجذور في ظروف التفاعل الأحادي ، مع قابلية استنساخ جيدة.
المقدمة
هناك طرق كمية ونوعية للكشف عن استعمار الجذور بواسطة سلالة بكتيرية واحدة. بالنسبة للطريقة النوعية ، يجب استخدام سلالة تعبر بشكل أساسي عن التألق ، ويجب فحص توزيع التألق وشدته تحت المجهر الفلوري أو أدوات البؤر بالليزر 1,2. يمكن أن تعكس هذه الاستراتيجيات الاستعمار البكتيري في الموقع3 ، لكنها ليست دقيقة مثل طرق عد الألواح التقليدية في القياس الكمي. إلى جانب ذلك ، نظرا لمحدودية عرض مناطق الجذر الجزئية فقط تحت المجهر ، يمكن أن تتأثر أحيانا بالتحيز الذاتي.
هنا ، نصف طريقة كمية ، والتي تتضمن جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة وعد وحدات CFU البكتيرية على طبق. تعت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الزراعة المائية المعقمة A. thaliana
- تحضير شتلات A. thaliana .
- تحضير وسط شتلات A. thaliana المستزرع والذي يتكون من وسط 1/2 MS (Murashige و Skoog) مع 2٪ (وزن / حجم) سكروز و 0.9٪ (وزن / مجلد) أجار.
- صب وسط التعقيم المحضر في أطباق بتري مربعة معقمة (13 سم × 13 سم) قبل التصلب. تجنب تجفيف الهواء للحفاظ على الرطوبة.
- اغمر بذور A. thaliana في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مملوء ب 1 مل من الماء المعقم عند 4 درجات مئوية لأكثر من 12 ساعة ، ثم عقم البذور ب 1 مل من 2٪ (حجم / حجم) كلوريد الصوديوم لمدة دقيقتين.
- اغسل البذور جيدا بالماء المعقم ست مرات لإزالة محلول كل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لاختبار دقة قدرة استعمار البكتيريا المكتشفة بهذه الطريقة في جذمور A. thaliana ، قمنا بتلقيح Bacillus velezensis SQR9 WT ومتحولة مشتقة Δ8mcp في A. thaliana rhizzosphere بشكل منفصل. Δ8mcp هو متحولة تفتقر إلى جميع جينات تشفير المستقبلات الكيميائية ، ولها استعمار منخفض بشكل ملحوظ6. قمنا بقياس استعمارهم في 2 أيام بعد التلقيح بواسطة مقايسة استعمار الجذر الحالية. أظهرت النتائج انخفاضا كبيرا في استعمار الجذر ل Δ8mcp ، مما يشير إلى أن هذه الحالة والطريق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لتحقيق قابلية استنساخ جيدة ، هناك أربع خطوات حاسمة لعملية الكشف عن الاستعمار لهذا البروتوكول. أولا ، من الضروري التأكد من أن عدد خلايا البكتيريا الملقحة هو نفسه تماما في كل تجربة. ثانيا ، من الضروري أيضا التحكم في كثافة تنظيف البكتيريا غير المستعمرة بالماء المعقم. ثالثا ، يجب أن تكون كل عملية تخفيف للعينة دوامة قبل إجراؤها للسماح للعينة بأن تكون في حالة خلط كاملة لتجنب أخطاء الامتصاص بسبب خصائص البكتيريا التي يسهل غرقها في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. لذلك ، نوصي باستخدام أداة دوامة لخلط التعليق البكتيري قبل كل امتصاص. را.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32370135) ، وبرنامج الابتكار التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية (CAAS-CSAL-202302) ، ومشروع العلوم والتكنولوجيا لكلية جيانغسو المهنية للزراعة والغابات (2021kj29).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 6 بئر لوحة | Corning | 3516 | |
| مرشح خلية التلطيخ | Solarbio | F8200-40 & micro; م | |
| قارئ صفيحة دقيقة | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige و Skoog متوسط | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| طبق بتري مربع | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
المراجع
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-exp....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
