Method Article

الكشف القائم على تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي والقياس الكمي للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B

DOI:

10.3791/66249

⸱

December 15th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
13B BlackBio Biotech India Limited

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B (HBV) القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتحديده الكمي في الوقت الفعلي طريقة حساسة ودقيقة لتشخيص عدوى فيروس التهاب الكبد B ورصدها. هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياس الحمل الفيروسي للعينة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو سبب مهم لأمراض الكبد في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي إلى التهابات حادة أو مزمنة ، مما يجعل الأفراد عرضة للإصابة بتليف الكبد القاتل وسرطان الكبد. يعد الكشف الدقيق عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في الدم وقياسه أمرا ضروريا لتشخيص ومراقبة عدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي. الطريقة الأكثر شيوعا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B هي تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، والذي يمكن استخدامه للكشف عن الفيروس وتقييم الحمل الفيروسي لمراقبة الاستجابة للعلاج المضاد للفيروسات. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه في المصل البشري أو البلازما باستخدام مجموعة تستند إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي تحمل علامة IVD. تستخدم المجموعة البادئات والمجسات التي تستهدف المنطقة الأساسية المحفوظة للغاية لجينوم HBV ويمكنها تحديد جميع الأنماط الجينية HBV بدقة (A ، B ، C ، D ، E ، F ، G ، H ، I ، و J). تتضمن المجموعة أيضا تحكما داخليا داخليا لمراقبة تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل المحتمل. يعمل هذا الفحص لمدة 40 دورة ، وقطعه هو 38 قيراطا. لتحديد كمية الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في العينات السريرية ، يتم توفير مجموعة من 5 معايير قياس كمي مع المجموعة. تحتوي المعايير على تركيزات معروفة من الحمض النووي الخاص بفيروس التهاب الكبد B والتي تمت معايرتها وفقا لمعيارمنظمة الصحة العالمية الدولي الرابع للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B لاختبار الحمض النووي (رمز NIBSC 10/266). تستخدم المعايير للتحقق من صحة وظائف تضخيم الحمض النووي الخاص بفيروس التهاب الكبد B ولإنشاء منحنى قياسي ، مما يسمح بالقياس الكمي للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في العينة. تم الكشف عن الحمض النووي HBV منخفض يصل إلى 2.5 وحدة دولية / مل باستخدام مجموعة PCR. إن الحساسية العالية وقابلية التكرار للمجموعة تجعلها أداة قوية في المختبرات السريرية ، مما يساعد المتخصصين في الرعاية الصحية في تشخيص عدوى فيروس التهاب الكبد B وإدارتها بشكل فعال.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو فيروس DNA مزدوج تقطعت به السبل جزئيا من جنس Orthohepadnavirus وعائلة Hepadnaviridae 1. يمكن أن يؤدي إلى عدوى مزمنة تستمر طوال حياة المرء ، مما قد يؤدي إلى تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية2،3،4. وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، كان ما يقدر بنحو 296 مليون شخص يعيشون مع عدوى التهاب الكبد B المزمن في عام 2019 ، وأصيب 1.5 مليون شخص حديثا كلعام 5.

يعد تحديد وقياس الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في عينات المصل أو البلازما بمثابة طريقة قيمة للكشف عن الأفرا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم تشمل هذه الدراسة أي مشاركين بشريين أو عينات سريرية. كانت المادة البيولوجية الوحيدة المستخدمة هي المعيار الدولي الرابعلمنظمة الصحة العالمية للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B لاختبار الحمض النووي (رمز NIBSC 10/266). هذا المعيار هو مادة مرجعية متاحة للجمهور لا تحتوي على أي معلومات شخصية أو بيانات يمكن التعرف عليها. على هذا النحو ، لم تكن هناك حاجة إلى موافقة أخلاقية لهذه الدراسة.

1. استخراج الحمض النووي

  1. استخراج الحمض النووي الفيروسي من المصل البشري أو عينة البلازما. قم بتخزين الحمض النووي المستخرج في -20 درجة مئوية حتى استخدامه مرة أخرى في تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    ملاحظة: الحجم الموصى به من المصل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر الشكل 1 رسم تخطيطي لسير العمل للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه من البلازما / المصل البشري. يظهر مخطط تضخيم للمعيار 2 (المستخدم كجهاز كمبيوتر) و NTC لكل من HBV و IC في الشكل 2. يوضح الشكل 3 منحنيات التضخيم لعينة إيجابية لفيروس التهاب الكبد B ، وعينة سلبية من HBV ، وعينة مع تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل. يوضح الشكل 4 منحنى التضخيم وقيمة Ct ل HBV وتركيز HBV الذي تم الحصول عليه بال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تعيين رمز NIBSC 10/266 لوحدة 9،55،000 وحدة دولية / مل عند إعادة تكوينها في 0.5 مل من الماء الخالي من النيوكلياز وفقا لمعلومات المورد21. يمكن اعتبار هذا عينة إيجابية عالية الحمل HBV. كان الحمل الفيروسي HBV الذي حددته مجموعة الحمل الفيروسي المستخدمة في هذه الدراسة 6،65،900 وحدة دولية / مل (الشكل 4). نظرا لأن كفاءة استخراج الحمض النووي لأي مجموعة استخراج الحمض النووي ليست 100٪ ، فغالبا ما يتم فقد بعض الحمض النووي أثناء عملية التنقية. على الرغم من أن الحمل الفيروسي الذ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرتبط المؤلفون بشركة Kilpest India Limited ، الشركة المصنعة لمجموعة الحمل الفيروسي HBV المستخدمة في هذه الدراسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نعرب عن تقديرنا لبرافين وكوسوم وشاندان وإيشا وراشمي وبابلي وشيفاني وأنكيتا وشيخة لمساعدتهم الفنية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4th المعيار الدولي لمنظمة الصحة العالمية لفيروس التهاب الكبد B رمز الحمض النوويNIBSC: 10/266يقصد بالمعيار الدولي الرابع لمنظمة الصحة العالمية بشأن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B (HBV) ، رمز NIBSC 10/266 ، استخدامه لمعايرة الكواشف المرجعية الثانوية المستخدمة في تقنيات تضخيم الحمض النووي HBV (NAT).
ABI في الوقت الحقيقي أجهزة PCR ثيرموفيشر العلميABI 7500 ؛ QuantStudio 5هذا هو جهاز PCR في الوقت الحقيقي  
HBV و HCV و HIV Multiplex 14/198NIBSCرمز NIBSC: 14/198هذا كاشف ثلاثي موجبة منخفض جدا لمقايسات NAT التي تحتوي على التهاب الكبد B (HBV) والتهاب الكبد C (HCV) وفيروس نقص المناعة البشرية -1 (HIV-1)
QIAGEN آلة PCR في الوقت الحقيقيQiagenRotor-Gene Qهذه آلة PCR في الوقت الفعلي  
طقم الحمل الفيروسي TRUPCR HBV Kilpest India Limited3B294هذه مجموعة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي تستخدم في هذه الدراسة للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وتحديد الحمل الفيروسي
TRUPCR مجموعة استخراج الحمض النووي الفيروسيKilpest India Limited3B214هذه مجموعة استخراج الحمض النووي المستخدمة لاستخراج الحمض النووي الفيروسي HBV من NIBSC: 10/266 و NIBSC: 14/198

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis B VirusHBV DNAReal Time PCRViral Load QuantificationPCR KitDNA DetectionClinical SamplesStandard CurvePCR EfficiencySerological Tests

Related Articles