حمض الريتينويك المغلف بمستحلب النانو الموجبة كمساعد لتعزيز الاستجابات الجهازية والمخاطية الخاصة ب OVA

غالبا ما تستخدم المواد المساعدة لتعزيز فعالية اللقاح عن طريق تحفيز الجهاز المناعي على الاستجابة بقوة أكبر للقاح ، وبالتالي زيادة المناعة ضد ممرض معين¹. يشير المستحلب النانوي (NE) المساعد إلى نظام تشتت غروي مع استقرار ديناميكي حراري عن طريق استحلاب نسبة معينة من طور الزيت والطور المائي لإنتاج مستحلب على شكل ماء في الزيت (W / O) أو زيت في الماء (O / W) ². يمكن لمستحلب النانو O / W أن ينتج السيتوكينات والكيموكينات في موقع الحقن ، ويحفز التجميع السريع وتكاثر الخلايا المناعية المهمة مثل الخلايا الوحيدة ، والعدلات ، والحمضات ، ويعزز الاستجابة المناعية ، ويحسن مناعة المستضدات³. حاليا ، تم ترخيص ثلاثة مواد مساعدة للمستحلب النانوي (MF59 و AS03 و AF03) للاستخدام في اللقاحات وأظهرت سلامة وفعالية جيدة⁴.

ومع ذلك ، فقد تمت معالجة المناعة المخاطية بشكل سيئ من خلال التركيبات المساعدة المرخصة حاليا في التطعيم بالحقن التقليدي⁵. تم الإبلاغ عن أن حمض الريتينويك (RA) يحفز توجيه الخلايا المناعية المعوية ، لكن قطبية منخفضة ، وضعف قابلية الذوبان في الماء ، وضعف الضوء والاستقرار الحراري تحد من استخدامه للتطعيم المعوي القوي. توفر المستحلبات النانوية فرصا لزيادة التوافر البيولوجي للأدوية شديدة المحبة للدهون ، كما أن قلب الزيت للمواد المساعدة لمستحلب O / W مناسب لإذابة المواد غير القطبية مثل RA⁶. لذلك ، يمكن استخدام المستحلبات النانوية كناقلات لالتهاب المفاصل الروماتويدي من أجل تحقيق تأثير الاستجابة المزدوجة للمناعة الجهازية والمناعة المخاطية.

بالمقارنة مع أنظمة التوصيل المحايدة أو الأنيونية ، تتمتع أنظمة التوصيل الكاتيوني بقدرات تغليف وتوصيل مستضد فعالة نسبيا ، والتي يمكن أن تعزز مناعة المستضدات^7،8،9. تعتبر شحنة السطح الكاتيوني لمجموعة متنوعة من الأنظمة المساعدة مهمة لتأثيراتها المساعدة^10،11،12. تعتبر الشحنة الكاتيونية عاملا مهما في إطالة فترة الاحتفاظ باللقاح في موقع الحقن ، وزيادة عرض المستضد وإطالة تحفيز المناعة الخلوية في الجسم¹².

بناء على الاعتبارات المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير مستحلب نانوي كاتيوني للمشاركة في توصيل RA والمستضدات بشكل فعال. تم تحديد حجم الجسيمات وإمكانات زيتا للمستحلب النانوي باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، وتم تقييم الاستجابات المناعية الجهازية والمخاطية للمستحلب النانوي جنبا إلى جنب مع OVA عن طريق الحقن العضلي¹³.

تم إجراء التجارب على وفقا لدليل استخدام ورعاية المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية وأخلاقيات المختبر في الجامعة الطبية العسكرية الثالثة.

1. تحضير المستحلبات النانوية (NEs)

1. لتحضير الطور المائي، قم بإذابة 0.15 جم من بوليسوربات 80 في 28.2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع التحريك عند 40 درجة مئوية.
2. لإعداد طور الزيت ، استخدم تركيبة طور الزيت للمستحلب النانوي الموضح في الجدول 1. قم بإذابة ثلاثي السورنيتان 85 و DOTAP و RA في السكوالين مع التحريك عند 40 درجة مئوية.
3. لإعداد مستحلب O / W الأولي ، قم بتحريك طور الزيت مغناطيسيا عند 1400 دورة في الدقيقة مع إضافة الماء ببطء وقطرة بمعدل 1 مل / دقيقة. قم باستحلاب الخليط مسبقا باستخدام مستحلب عالي القص عند 30000 دورة في الدقيقة لمدة 6 دقائق.
4. بالنسبة للتجانس عالي الضغط (HPH) ، عالج مستحلب O / W الأساسي المحضر أعلاه بمجانس عالي الضغط لمدة 12 دورة عند 900 بار للحصول على مستحلب نانو متجانس في نطاق 160-190 نانومتر.
5. في نهاية العملية ، اجمع المستحلب في قارورة سعة 50 مل وقم بتعقيم المستحلب بالتصفية من خلال غشاء مرشح PES 0.2 ميكرومتر.
6. قم بتوصيل القارورة بخط Schlenk من خلال القسطرة ، وقم بتدوير المحبس ثلاثي الاتجاهات لتوصيل النظام بأنبوب التفريغ وتشغيل مضخة التفريغ لإنشاء فراغ في القارورة. بعد ذلك ، قم بتدوير المحبس ثلاثي الاتجاهات ، وقم بتوصيل النظام بأنبوب الأرجون واملأه بالأرجون. كرر هذه الخطوة 3x للتأكد من أن القارورة مملوءة بالأرجون.
7. استبدل الفلين وأغلقه بغشاء بارافين ، ولف القارورة بورق القصدير واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. توصيف المستحلبات النانوية

1. حجم الجسيمات والكشف عن إمكانات زيتا
   1. قم بتشغيل الجهاز وانتظر 30 دقيقة حتى يستقر مصدر ضوء الليزر.
   2. قم بتخفيف NE 50 ضعفا بالماء عالي النقاء وأضف 1 مل من العينة إلى خلية العينة المقابلة.
   3. لقياس حجم الجسيمات ، اضبط درجة الحرارة على 25 درجة مئوية ، وحدد الماء كوسيط تشتت ، وحدد الأطباق البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة كخلية قياس. تحميل العينات والقياس تلقائيا. أبلغ عن القيمة المتوسطة لثلاثة قياسات متكررة لكل عينة كنتيجة نهائية.
   4. لقياس جهد زيتا ، اضبط درجة الحرارة على 25 درجة مئوية. نظرا لاختيار الطور المائي كوسط تشتت ، حدد نموذج Smoluchowsi ، والخلية الشعرية المطوية كخلية قياس. تحميل العينات والقياس تلقائيا. أبلغ عن متوسط ثلاثة قياسات مكررة لكل عينة كنتيجة نهائية.
2. تحديد معدل التغليف ومعدل تحميل الدواء
   1. لتحديد كمية RA المحملة في NE ، استخدم الإيثانول المطلق لإزالة الاستحلاب واستخراج RA من NE. إلى 5 ميكرولتر من العينة ، أضف 995 ميكرولتر من الإيثانول وحدد محتوى RA للمحلول باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 355 نانومتر. قارن الامتصاص بمنحنى قياسي. استخدم المعادلة التالية:
      التغليف = الحمل الفعلي RA / وزن الدواء المضاف
      معدل تحميل الدواء = تحميل RA الفعلي / جودة العينة

3. إجراءات التحصين وجمع العينات

1. إجراءات التحصين والتجميع
   1. مجموعة إناث Balb / C الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ويزن حوالي 18-21 جم في مجموعات من 5 للتحصين في اليوم 0 ، اليوم 14 ، اليوم 28 وفقا للمجموعات التجريبية التالية: (1) مجموعة PBS ، (2) مجموعة البومين البيضاوي (OVA) ، (3) مجموعة OVA + NE-RA (OVA / NE-RA) ، (4) مجموعة OVA + CNE-RA (OVA / CNE-RA).
   2. تحصين جميع الفئران عن طريق الحقن العضلي في عضلات الفخذ العلوية مع 200 ميكرولتر من تركيبات اللقاح المختلفة: 100 ميكرولتر من المستحلب و 15 ميكروغرام OVA يمتص في 100 ميكرولتر من PBS ، مختلطة قبل تناوله. حقن 100 ميكرولتر / الساق الخلفية. بالنسبة للفئران في المجموعة الضابطة ، قم بإدارة برنامج تلفزيوني وحده.
   3. القتل الرحيم: القتل الرحيم لجميع الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغ / كغ من بنتوباربيتال الصوديوم 1 ٪ بعد أسبوعين من الانتهاء من التطعيمات الثلاثة.
   4. جمع العينات ومعالجتها: بعد القتل الرحيم ، استخدم المقص لفتح صدر الفئران وإدخال حقنة مباشرة في القلب لشفط حوالي 0.5 مل من الدم الكامل. اترك الدم يقف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم جهاز طرد مركزي عند 1800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المصل والقسمة واحفظيها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
   5. جمع الدم الكامل والطحال وسائل غسل المهبل (VLF) وسائل غسل القصبات الهوائية (BALF) وسائل غسل الأنف (NLF) وسائل غسل الأمعاء الدقيقة (SILF).
2. عزل الخلايا الليمفاوية الطحالية
   1. نقع الفئران في الإيثانول 75 ٪ (v / v) لتعقيم قصير ، ونقل الفئران إلى مقعد نظيف. قطع الجلد على البطن الأيسر مع مقص ، وفضح وإزالة الطحال.
   2. ضع الطحال في طبق بتري يحتوي على 3 مل من PBS ، وطحنه ومرشحه في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام غربال (200 شبكة ، 70 ميكرومتر) وقضيب طحن.
   3. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 650 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وقم بتعليق الراسب ب 3 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   4. أضف 10 مل من PBS إلى الأنبوب واهتز جيدا لإنهاء التفاعل ، ثم قم بطرده عند 650 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من PBS ، أضف 20 ميكرولتر من تخفيف الخلية إلى عداد الخلايا الآلي لعد الخلايا.
   6. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 650 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وقم بتخفيف الخلايا إلى 1 × 10⁶ خلايا / مل مع 1640 وسط كامل (1٪ بنسلين - ستربتومايسين ، 10٪ مصل بقري جنيني).
3. جمع VLF: شطف المهبل 4x مع 75 ميكرولتر من 1٪ BSA / PBST ، والجمع بين محلول غسل وجمع في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل ، وأجهزة الطرد المركزي في 5000 × غرام في 4 °C لمدة 20 دقيقة وجمع طاف مع ماصة وتخزينها في -80 °C.
4. مجموعة BALF و NLF
   1. تطهير الفئران بعد التضحية مع 75٪ (v / v) الإيثانول. امسك بطن الفأر وقم بتصويب الرقبة. استخدم المقص لعمل شق طولي في جلد عنق الفأر واستخدم الملقط لفصل العضلات وكشف القصبة الهوائية بشكل كاف.
   2. قطع القصبة الهوائية من خلال فتحة عرضية صغيرة وأدخل الخرطوم باتجاه الرئتين ، وإرفاق المحقنة بالخرطوم وحقن 0.5 مل من PBS في الرئتين والانسحاب ، كرر الشطف 3x وأجهزة الطرد المركزي عند 650 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، قم بتخزين المادة الطافية (BALF) عند -80 درجة مئوية.
   3. عكس الخرطوم إلى تجويف الأنف ، قم بتوصيل المحقنة بالخرطوم وحقن 0.5 مل من PBS ، وسوف يتدفق السائل عبر تجويف الأنف إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. نضح الغسيل من أنبوب الطرد المركزي وكرر الشطف 2x ، ثم الطرد المركزي عند 650 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وقم بتخزين المادة الطافية (NLF) عند -80 درجة مئوية.
5. مجموعة سيلف
   1. تحضير محلول PBS يحتوي على مثبط التربسين 0.1 مجم / مل ، 50 ملي متر / لتر EDTA-2Na ، 1 مللي متر / لتر فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) كمحلول غسل الأمعاء الدقيقة. يقلب في درجة حرارة الغرفة ليذوب ويخزن على حرارة 4 درجات مئوية.
   2. قطع الأمعاء الدقيقة مفتوحة على طول أنبوب الأمعاء وانغمس في 3 مل من سائل غسل الأمعاء الدقيقة. امزج بالهز الرأسي عند 15 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي عند 1440 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة وجمع المادة الطافية باستخدام ماصة ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بتخزين المادة الطافية (SILF) في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

4. تقييم استجابة الأجسام المضادة الخاصة ب OVA بعد الإعطاء العضلي

1. تحديد مستويات مصل IgG ، والفئات الفرعية من IgG1 ، IgG2a ومستويات sIgA المحددة في VLF و BALF و NLF و SILF بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
2. بالنسبة لطلاء المستضد ، قم بتخفيف OVA إلى 5 ميكروغرام / مل مع عازل طلاء ، وقم بتغطية ألواح ELISA المكونة من 96 بئرا طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من محلول OVA لكل بئر.
3. اغسل ألواح ELISA 5x باستخدام PBST وقم بحظرها عن طريق الحضانة ب 250 ميكرولتر من 1٪ BSA / PBST عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
4. اغسل ألواح ELISA 5x باستخدام PBST ، ثم أضف 100 ميكرولتر من العينة المخففة كما هو موضح أدناه ليتم اختبارها واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. مصل مخفف ، VLF ، BALF ، NLF مع 0.5٪ BSA / PBST ، تمييع SILF مع 20٪ مصل عجل الجنين (FCS) / PBST.
   1. ابدأ بتخفيف المصل 1000x باستخدام إجراء تخفيف من خطوتين: قم بتخفيف 20 ميكرولتر من المصل إلى 1 مل ، ثم قم بتخفيف 25 ميكرولتر من هذا المصل المخفف إلى 500 ميكرولتر. استخدم هذا التخفيف من المصل للكشف عن IgG1 ، IgG2a.
5. أضف 200 ميكرولتر من المصل المخفف عند 1000x إلى الصف الأول من اللوحة المطلية وأضف 100 ميكرولتر من 0.5٪ BSA / PBST إلى جميع الآبار باستثناء الصف الأول. انقل 100 ميكرولتر من الصف الأول إلى الصف الثاني وامزج 10 أضعاف مع الماصة. كرر هذه الخطوة حتى الصف 8 وتخلص من 100 ميكرولتر من السائل ، وقد تم الحصول على مصل بتركيزات مختلفة للكشف عن IgG.
6. قم بإجراء تخفيف 1: 1 من BALF و NLF و SILF للكشف عن IgA. استخدم نفس إجراء التخفيف ل VLF مثل إجراء المصل.
7. اغسل ألواح ELISA 5x باستخدام PBST. أضف 100 ميكرولتر من الماعز المترافق HRP المضاد للفأر IgG / IgG1 / IgG2a / IgA (مخفف 1: 10000 مع PBST) إلى الآبار المناسبة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
8. اغسل ألواح ELISA 5x باستخدام PBST ، وأضف 100 ميكرولتر من ركيزة TMB ELISA (حساسة للغاية) ، وانقل اللوحة إلى مكان محمي من الضوء لمدة 5 دقائق. أضف على الفور 100 ميكرولتر من محلول توقف 450 نانومتر لركيزة TMB لإيقاف التفاعل.
9. قم بقياس الامتصاص (OD) عند 450 نانومتر لكل بئر واحسب عيار الجسم المضاد عن طريق أخذ 2.1 مرة من قيمة مصل فأر المجموعة الفارغة كقيمة استجابة إيجابية.

5. مقايسة ELISpot

1. اتبع إرشادات ELISpot Plus ، واستخدم الماوس IFN-γ (ALP) من المجموعة لإجراء المقايسات.
2. أخرج اللوحة من العبوة محكمة الغلق واغسلها 4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني معقم (200 ميكرولتر / بئر). رطب اللوحة ب 1640 وسط كامل (200 ميكرولتر / بئر) واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. قم بإزالة الوسط وإضافة التركيز المعدل لمعلق الخلايا الليمفاوية المحضر في الخطوة 3.2.2 (100 ميكرولتر / بئر) إلى اللوحة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من التحفيز ، أي 1640 وسط كامل يحتوي على 20 ميكروغرام / مل OVA257 ~ 264 أو OVA323 ~ 339 أو 1640 وسط كامل. ضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 48 ساعة. لف اللوحة بورق الألمنيوم لتجنب التبخر.
4. تخلص من تعليق الخلية واغسل اللوحة 5x باستخدام PBS (200 ميكرولتر / بئر). خفف الجسم المضاد للكشف (R4-6A2-بيوتين) إلى 1 ميكروغرام / مل في PBS يحتوي على 0.5٪ مصل عجل الجنين (PBS-0.5٪ FCS). أضف 100 ميكرولتر / بئر واحتضانها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. اغسل اللوحة كما في الخطوة 5.2. تمييع streptavidin-ALP (1: 1000) في PBS-0.5٪ FCS وإضافة 100 ميكرولتر / بئر ، احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
6. اغسل اللوحة كما في الخطوة 5.2. قم بتصفية محلول الركيزة الجاهز للاستخدام (BCIP / NBT-plus) من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر وأضف 100 ميكرولتر / بئر. تطور حتى تظهر بقع مميزة.
7. توقف عن نمو اللون عن طريق غسله جيدا في ماء الصنبور ، وقم بإزالة البلاستيك اللين واترك اللوحة حتى تجف.
8. افحص النقاط وعدها في قارئ ELISpot.

6. التحليل الإحصائي

1. تحليل الاختلافات بين بيانات 4 مجموعات عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا بمقارنة Tukey المتعددة بعد الاختبار. عبر عن جميع النتائج كمتوسط ± SD. اعتبرت قيمة P أقل من 0.05 معنوية.

في المجموع ، تم تحضير أربع تركيبات مستحلب نانوي وتميزت بحجم جسيماتها (الشكل 1) ، وإمكانات زيتا وكفاءة تغليفها كما هو موضح في الجدول 2. تركز حجم الجسيمات حول 160-190 نانومتر وإضافة DOTAP عكست إمكانات زيتا للمستحلب النانوي. تم الكشف عن مصل IgG الخاص ب OVA ومستوى الأجسام المضادة للمجموعة الفرعية في المصل بعد 2 أسابيع من التحصين الثالث. زاد اللقاح المساعد للمستحلب النانوي بشكل كبير من عيار الأجسام المضادة IgG و IgG1 و IgG 2a الخاص ب OVA في المصل (الشكل 2). والأهم من ذلك ، تم تعزيز مستويات sIgA المحددة في سائل غسل المهبل وسائل غسل الأمعاء الدقيقة بشكل كبير عندما تم مساعدة OVA مع CNE-RA (الشكل 3). في فحص ELISpot ، لم يتم العثور على بقع مهمة.

الشكل 1: قطر الحجم والتوزيع. (أ) قطر الحجم وتوزيع NE-RA. (ب) قطر الحجم وتوزيع CNE-RA. d.nm هو متوسط قطر الجسيمات في نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مصل IgG الخاص ب OVA ومستويات الأجسام المضادة لمجموعته الفرعية في المصل. تم الانتهاء من مصل IgG الخاص ب OVA ومستويات الأجسام المضادة للمجموعة الفرعية في المصل بعد 2 أسابيع من التطعيمات الثلاثة. (أ) قيمة Log2 لعيار IgG. (ب) الكثافة البصرية IgG1 عند 450 نانومتر. (ج) الكثافة البصرية IgG2a عند 450 نانومتر. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD (ن = 5) ، ***: P<0.001. تظهر مقارنات الاختلافات بين المجموعات ومجموعة PBS مباشرة فوق الأعمدة في الشكل ويشار إليها على النحو التالي: ns: لا أهمية ، #p<0.05 ، # # #p<0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: sIgA الخاص ب OVA. sIgA خاص ب OVA في سائل غسل المهبل ، سائل غسل القصبات الهوائية ، سائل غسل الأنف ، سائل غسل الأمعاء الدقيقة. أ: سائل غسل المهبل، ب: سائل غسل القصبات الهوائية، ج: سائل غسل الأنف، د: سائل غسل الأمعاء الدقيقة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD (n = 5) ، ns: لا أهمية ، * p < 0.05 ؛ ص<0.001. تظهر مقارنات الاختلافات بين المجموعات ومجموعة PBS مباشرة فوق الأعمدة في الشكل ويشار إليها على النحو التالي: ns: لا أهمية ، # # #p<0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: صياغة مرحلة الزيت من NEs.

الجدول 2: الخصائص الفيزيائية والكيميائية للشمال الشرقي.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح في هذا العمل.