يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التروية الجراحية وعزل البنكرياس الخنازير لعزل الجزر

2.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66350

⸱

يونيو 7, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا لشراء بنكرياس الخنازير لعزل الجزر وتنقيتها

الملخص

زرع جزيرة البنكرياس هو علاج ناشئ لمرض السكري من النوع الأول. ومع ذلك ، فهي محدودة بمطابقة المانحين وتوفرهم. يوفر زرع جزر الخنازير بديلا واعدا لزراعة الخنازير، مع إمكانية إنتاج الجزر الوظيفية على نطاق واسع عند الطلب. إن محصول الجزر المعزولة وقابليتها للبقاء شديد التأثر بجودة البنكرياس المتبرع وطريقة الشراء ، ولا سيما مدة فترة نقص التروية الدافئة. لتحسين الحفاظ على الأعضاء وإنتاجية الجزر اللاحقة وقابليتها للحياة ، قمنا بتطوير بروتوكول للتروية الجراحية واستئصال بنكرياس الخنازير. يستخدم هذا البروتوكول قنية الأبهر تحت الكلوي المباشر وتروية الأعضاء لتقليل وقت نقص التروية الدافئ وتبسيط الإجراء للمشغلين الذين ليس لديهم خبرة جراحية واسعة. يؤدي التروية الشريانية اللاحقة للبنكرياس عبر الشريان الأورطي إلى طرد الدم الراكد من الأوعية الدموية الدقيقة ، وبالتالي تقليل تجلط الدم والضرر التأكسدي للأنسجة. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا للتروية الجراحية واستئصال بنكرياس الخنازير ، يليه عزل الجزر وتنقيتها

المقدمة

يحدث مرض السكري من النوع 1 بسبب تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا البنكرياس1. وبالتالي ، يعتمد المرضى على الأنسولين الخارجي ، مما يضعهم في تقلبات نسبة السكر في الدم عالية الخطورة مع نوبات فرط ونقص السكر في الدم2. زرع الجزر هو علاج محتمل لمرض السكري من النوع الأول. ومع ذلك، فإن التوافر المحدود للمتبرعين بأعضاء البنكرياس لا يزال يشكل عائقا رئيسيا أمام الاعتماد الواسع النطاق للإجراء2،3. يعد زرع الجزر من المتبرعين بالخنازير بديلا واعدا لأن هذه متاحة بسهولة. سيكون تحسين عزل جزيرة البنكرياس الخنازير وتوسيع نطاقه أمرا بالغ الأهمية لتقدم عملية زرع الجزيرة الغريبة.

على الرغم من نشر العديد من تقنيات شراء البنكرياس الخنازير سابقا ، إلا أن العديد من هذه الإجراءات تصف استئصال البنكرياس بعد تحريض الموت القلبي أو الاستئصال4،5،6،7،8،9،10. أحد العيوب الرئيسية لهذه التقنيات هو الوقت الإقفاري الدافئ المتغير (WIT) الذي يحدث بين وقت الموت القلبي وبدء التسريب داخل الشرايين و / أو داخل القناة لمحلول الحفظ. حتى 10 دقائق من WIT ستؤثر سلبا على إنتاجية الجزر والجدوى5. يتطلب تقليل WIT نضحا سريعا للبنكرياس بمحلول حفظ. أثناء شراء أعضاء البطن ، يعد قنية الأبهر متبوعا بالتروية داخل الجسم بمحلول جامعة ويسكونسن (UW) أمرا بالغ الأهمية لإزالة الدم ، ومنع تجلط الدم داخل الأوعية الدموية ، والحماية من التلف الإقفاري ، وتقليل الإصابة الخلوية11،12.

أظهرت الدراسات السابقة أنه أثناء شراء البنكرياس الخنازير ، فإن التنظيف بالضغط المنخفض لجذع الاضطرابات الهضمية والشريان المساريقي العلوي بمحلول UW يحسن محصول الجزيرة ونقائها4. ومع ذلك ، فإن الطرق المنشورة سابقا لشراء البنكرياس الخنازير تشمل قنية الأبهر المفتوحة ، والتي يمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية ، خاصة بالنسبة للخنازير الصغيرة13،14،15. في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة مع مساعدات بصرية مصاحبة للتروية الجراحية وشراء بنكرياس الخنازير ، متبوعا بعزل الجزر وتنقيتها تم تطوير هذه التقنية الجديدة لقنية الأبهر أثناء عزل البنكرياس خصيصا لتقليل الذكاء الاصطناعي والسماح بإجراء شراء البنكرياس في حقل غير دموي كوسيلة لتعظيم إنتاجية عزل الجزيرة وقابليتها للحياة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تتم الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في قسم الطب المقارن بكلية الطب بجامعة واشنطن. تعتبر خنازير يوركشاير البالغة التي يتراوح وزنها من 35 إلى 35 كجم مثالية لهذا الإجراء ؛ ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول للخنازير ذات الأحجام المختلفة اعتمادا على السياق التجريبي. يجب تنفيذ الإجراء بأكمله بطريقة معقمة في إعداد غرفة العمليات.

1. التحضير والتخدير قبل الجراحة

  1. تخدير الخنزير بمزيج من 4 ملغم/كغ من التيتامين والزولازيبام، و20 ملغم/كغ من الكيتامين، و2 ملغم/كغ من الزيلازين المحقون في العضل.
  2. إنشاء الوصول الوريدي المحيطي عبر الوريد الأذني.
  3. تحفيز التخدير العام مع استنشاق 1٪ -3٪ من الأيزوفلوران في 100٪ أكسجين وتنبيب القصبة الهوائية للخنزير.
    ملاحظة: قد يكون من المفضل استخدام البروبوفول أو أي عامل تحريض وريدي آخر مقابل المستنشق للتحريض من أجل إجراء تحريض وتنبيب أكثر سلاسة. تتم مراقبة العلامات الحيوية ، ثاني أكسيد الكربون2 في نهاية المد والجزر ، وتشبع الأكسجين ، وشكل الموجة القلبية باستمرار لتقييم عمق التخدير والحفاظ عليه. يتم تأكيد المستوى الجراحي للبطن باستخدام الموجات فوق الصوتية بجانب السرير.
  4. حلق وتحضير الخنزير باستخدام غلوكونات الكلورهيكسيدين من الشق القصي إلى الفخذ الثنائي.
  5. ثنى مجال الجراحة مع رؤية واضحة للبطن بالكامل (الشكل 1 أ).

2. الإعداد التشغيلي والتعرض لخلف الصفاق

  1. قم بإجراء شق شق شق البطن في خط الوسط (الشكل 1 ب).
    1. استخدم مشرطا من 10 شفرات وكي كهربائي لإجراء شق البطن في خط الوسط من عملية الخنجري إلى العانة. احرص على ثني الشق حول فتحة الجهاز البولي التناسلي السفلية للبطن.
  2. قم بإجراء دوران الحشوي الصحيح.
    1. قم بإخراج القولون الأيمن والأمعاء الدقيقة ، ولفهما بمنشفة معقمة.
    2. سحب القولون والأمعاء برفق إلى اليسار لفضح خلف الصفاق الأيمن مع تجنب التواء الأمعاء أو سوء الدوران.
  3. استنزاف المثانة (اختياري).
    1. إذا كانت المثانة ممتلئة وتؤثر على التعرض ، فأمسك المثانة بين ملقطي DeBakey واستخدم مشرطا من 11 شفرة لشق جدار المثانة البطني.
    2. ضع طرف شفط Yankauer في المثانة لتصريف البول وفك ضغط المثانة.
  4. قم بإعداد مجموعة ضام البطن لتسهيل التعرض الأمثل لخلف الصفاق الأيمن (الشكل 1C).

3. تشريح خلف الصفاق

  1. ابدأ تشريح خلف الصفاق (الشكل 2 أ).
    1. باستخدام الكي الكهربائي ، قم بشق الصفاق على يمين خط الوسط ، من مستوى الكلية اليمنى إلى تشعب الأبهر.
    2. كشف الشريان الأورطي تحت الكلوي ، والوريد الأجوف السفلي (IVC) ، والشريان الكلوي الأيمن والوريد
  2. الحصول على التحكم المحيطي في الشريان الأورطي تحت الكلوي البعيد مع حلقة وعاء كبير.
  3. ربط IVC (الشكل 2 ب).
    1. الحصول على التحكم المحيطي في مركز الحقن الوريدي في منتصف الأشعة تحت الكلىوية.
    2. اربط IVC باستخدام ربطة عنق حريرية 2-0.
  4. ربط الأوعية الكلوية (الشكل 2 ج).
    1. الحصول على التحكم المحيطي في الشرايين والأوردة الكلوية اليمنى واليسرى.
    2. اربط هذه الهياكل باستخدام 2-0 ربطات عنق حريرية.
    3. إذا كانت هناك شرايين كلوية متعددة ، فقم بالمثل بعزل وربطها كل من هذه الأوعية.

4. التسلخ داخل الصدر

  1. شق الفرجم النصفي الأيمن (الشكل 3 أ).
    1. سحب الكبد بلطف إلى أدنى لفضح النجمة النصفية اليمنى. ضع مشابك أليس على الجزء الغشائي من الفرجم النصفي الأيمن وقم بشق الحجاب الحاجز بين المشبكين باستخدام الكي الكهربائي.
    2. قم بتمديد بضع عضل الحجاب الحاجز إلى حوالي 7 سم أفقيا.
  2. الحصول على التحكم المحيطي في IVC داخل الصدر (الشكل 3 ب).
    1. ضع ربطة عنق حريرية 2-0 حول IVC داخل الصدر. التقط طرفي الخيط بمرقئ صغير دون سد IVC.
  3. قم بتمديد بضع الحجاب الحاجز إلى النجمة النصفية اليسرى (الشكل 3C).
    1. استخدم اثنين من مشابك أليس لسحب حافة بضع الحجاب الحاجز بشكل أدنى وتمتد إلى النجمة النصفية اليسرى.
      ملاحظة: تجنب دخول التامور أثناء بضع الحجاب الحاجز.
  4. كشف الشريان الأورطي الصدري الهابط في منطقة الصدر الخلفي الإنسي الأيسر.

5. قنية الأبهر تحت الكلوي ، والعزلة الحشوية ، والتروية

  1. مضاد للتخثر بشكل منهجي الخنزير.
    1. تطبيق الهيبارين الجهازي (100 وحدة / كغ) عن طريق الوصول الوريدي المحيطي. انتظر 3 دقائق قبل الشروع في قنية الأبهر.
  2. قم بالوصول إلى الشريان الأورطي تحت الكلوي باستخدام إبرة بزل دقيق 18 جم (الشكل 4 أ).
  3. مرر سلك j عبر الإبرة إلى الشريان الأورطي وقم بإزالة الإبرة فوق السلك.
  4. ضع غمدا 10Fr فوق السلك في الشريان الأورطي وقم بإزالة السلك (الشكل 4 ب).
  5. قم بتوصيل الأنبوب الوريدي بغمد 10Fr وبطريقة معقمة ، قم بغرس محلول UW من خلال الغمد. قم بغرس محلول UW بمعدل 40-60 قطرة / دقيقة.
    ملاحظة: لن يبدأ التدفق حتى يتم تشابك الشريان الأورطي الصدري. تأكد من أن الأنبوب الوريدي ليس في حالة شد لتجنب إزاحة غمد داخل الأبهر.
  6. إجراء العزل الحشوي والتروية في تتابع سريع.
    1. قم بتثبيت الشريان الأورطي تحت الكلوي باستخدام مشبك الأبهر.
    2. قم بتثبيت الشريان الأورطي الصدري الهابط باستخدام مشبك الأبهر.
    3. اربط IVC داخل الصدر بالتعادل 2-0 الذي تم وضعه سابقا.
    4. يجب تطبيق 100 ملغم/كغ كلوريد كلوريد للقتل الرحيم عن طريق الوصول الوريدي المحيطي.
      ملاحظة: يبدأ الموت القلبي بإعطاء KCl.
    5. قم بإجراء بضع الوريد في IVC تحت الكلى ، متفوقا على ربطة العنق 2-0 ، وأدخل الشفط ذو رأس المسبح من خلال بضع الوريد (الشكل 4C).
    6. قم بتنقية الأحشاء ب 2-3 لتر من محلول UW البارد.
    7. استمر في تشريح استئصال البنكرياس الكلي أثناء التروية.
      ملاحظة: يجب أن تصبح الأحشاء والبنكرياس على وجه الخصوص شاحبة حيث يتم ترشيح محلول UW في منطقة العضو الصلب (الشكل 5 أ).

6. استئصال البنكرياس الكلي

  1. حرر الأمعاء الدقيقة من التراجع لأن محلول UW يتهرب.
  2. ابدأ تشريح الاثني عشر وربط والطحال في البنكرياس أثناء التروية الحشوية. سحب المعدة بشكل متفوق لفضح البنكرياس. مع مزيج من التشريح الحاد والكي الكهربائي ، قم بتشريح البنكرياس من مرفقاته العقلية.
    ملاحظة: يلتف جسم البنكرياس بشكل فعال حول الوريد البابي. احرص على تجنب الوريد البابي الذي يمتد إلى الخلف إلى الفص الاثني عشر ثم إلى الأمام إلى الجسر والفصوص المتصلة.
  3. عزل قناة البنكرياس (الشكل 5 ب). حدد موقع قناة البنكرياس حيث تدخل الاثني عشر. اربط القناة باستخدام ربطتين حريريتين 3-0 وقم بتمرير القناة بين العلاقات.
  4. استئصال البنكرياس الكامل (الشكل 5 ج).
    1. قم بتشريح ما تبقى من فص الاثني عشر من الحلقة C للاثني عشر حتى يصبح متحركا بحرية.
    2. افصل البنكرياس عن مرفقاته المتبقية. قم بربط الأوعية الصغيرة بعناية وقسمها من الشريان المساريقي العلوي إلى البنكرياس.
    3. افصل البنكرياس عن الوريد البابي. تشريح جسم البنكرياس والفص المتصل من الوريد البابي. اربط أي فروع وريدية من الوريد البابي إلى البنكرياس ، بما في ذلك الوريد الطحالي.
      1. قم بتمرير جسر البنكرياس بين الفص المتصل وفص الطحال للسماح بالتعبئة الحرة من الوريد البابي.
        ملاحظة: احرص على عدم تعطيل فص الاثني عشر البنكرياس من فص الطحال.
  5. اغمر البنكرياس بالكامل في محلول UW المعقم البارد ، ضع الحاوية على الفور على الجليد. انقل البنكرياس إلى غطاء معقم لعزل الجزيرة. استمر في عزل جزيرة البنكرياس (الشكل 6).

7. قنية قناة البنكرياس

  1. ضع البنكرياس على صينية معقمة على الثلج داخل خزانة السلامة الحيوية.
  2. تشريح الأنسجة الليفية الزائدة والدم بعيدا عن البنكرياس.
  3. إذا لزم الأمر ، قم بقص القناة بشكل عرضي لتصور التجويف بشكل أفضل. حدد موقع القنية ودفعها إلى القناة باستخدام قسطرة بحجم مناسب (16 جم).
  4. قم بتثبيت القسطرة في مكانها برباط حريري 2.0 ولكن تجنب انسداد التجويف.
  5. قم بإعداد ثلاثة حلول لإزالة التلوث وغمر البنكرياس المقنن في كل محلول لإزالة التلوث لمدة 60 ثانية.

8. نضح وانتفاخ البنكرياس

  1. تحضير محلول هضم الإنزيم (الشكل 6).
    1. امزج 100 مجم من محاليل الكولاجيناز 1 و 2 المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل) مع الكمية المطلوبة من 1x HBSS و 10,000 U محلول الهيبارين. إذا كان نسيج البنكرياس المعزول بين 100 جم و 200 جم ، فقم بخلط الإنزيم مع 200 مل من إجمالي 1x HBSS ومحلول الهيبارين.
  2. نقع البنكرياس بمحلول الإنزيم.
    1. بقوة معتدلة خاضعة للرقابة ، قم بغرس محلول الإنزيم في 60 مل من الجرعات في قناة البنكرياس. استمر في هذه العملية حتى يتم حقن محلول الإنزيم بالكامل في البنكرياس.
      ملاحظة: يجب أن يتسبب التسريب الفعال في انتفاخ أنسجة البنكرياس.
    2. إذا تسرب بعض محلول الإنزيم من أنسجة البنكرياس إلى الدرج المعقم، فأعد حقن هذا المحلول المتبقي في البنكرياس في الخطوة 8.3 أو ضعه في حجرة ريكوردي في الخطوة 9.2.
  3. حقن أي محلول إنزيمي متبقي مباشرة في أي أجزاء من حمة البنكرياس ضعيفة الانتفاخ باستخدام إبرة 22 جم.

9. هضم البنكرياس

  1. ضع خزان الدائرة الذي يحتوي على 500 مل من 1x HBSS في حمام مائي مضبوطة على 47 درجة مئوية لتسخين محلول الخزان مسبقا.
    ملاحظة: يعمل محلول الإنزيم على النحو الأمثل عند 36-38 درجة مئوية ويجب الوصول إلى درجة الحرارة هذه في غضون 5 دقائق من بدء تشغيل المضخة التمعجية. درجة حرارة محتويات ريكوردي ، بما في ذلك البنكرياس المملوء بالإنزيم ، هي في البداية 4 درجات مئوية. من خلال التسخين المسبق لخزان الدائرة إلى 47 درجة مئوية ، ستختلط محتويات الخزان وغرفة Ricordi ، مما يجعل درجة حرارة الدائرة بأكملها تصل إلى 36-38 درجة مئوية في غضون 5 دقائق من بدء تشغيل المضخة التمعجية.
  2. قم بإزالة القسطرة والتخلص منها من قناة البنكرياس وقطع البنكرياس إلى قطع ~ 1-3 سم.
  3. تحضير دائرة الهضم. ستقوم المضخة التمعجية بتدوير المحلول من خزان دائرة الهضم ، عبر ملف التسخين ، وفي غرفة Ricordi (الشكل 6).
  4. ضع قطع البنكرياس مع تسعة كرات نيتريد السيليكون مقاس 1.5 سم داخل حجرة Ricordi واملأها حتى مستوى المرشح بمحلول الإنزيم المتبقي.
  5. لإغلاق غرفة Ricordi ، ضع الفلتر الشبكي والحشية المطاطية ، متبوعا بالغطاء على غرفة Ricordi. قم بتأمين غطاء غرفة Ricordi عن طريق شد البراغي والتأكد من أن الغرفة محكمة الغلق قبل المتابعة.
  6. ضع ملف التسخين في حمام ماء ساخن 47 درجة مئوية.
  7. ضع قنيات التدفق والتدفق في خزان دائرة الهضم التي تحتوي على 500 مل من 1x HBSS.
  8. ابدأ تشغيل المضخة بمعدل تدفق 450 مل / دقيقة حتى تمتلئ الغرفة بأكملها بمحلول الهضم. قلل معدل التدفق إلى 100 مل / دقيقة أثناء دوران السائل داخل الدائرة.
  9. رج غرفة الهضم يدويا لتحريك الأنسجة باستخدام رخام نيتريد السيليكون.
  10. بدءا من 8 دقائق من الهضم ، خذ عينة 1 مل من خزان الدائرة لتلوين الديثيزون (DTZ) لمراقبة تقدم الهضم.
    1. لتحضير تلطيخ DTZ ، قم بإذابة 10 مجم من DTZ في 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    2. أضف 10 ميكرولتر من صبغة DTZ المحضرة إلى 1 مل من عينة الهضم. افحص العينة تحت تكبير 4x. ستظهر الجزر باللون الأحمر الداكن إلى الأسود مع تلطيخ DTZ.
      ملاحظة: يكتمل الهضم عندما تكون معظم أو كل الجزر المرصودة "حرة" وسليمة ، مع تشتيت الأنسجة الأسينار في مجموعات أصغر.
  11. عندما يتم الحكم على اكتمال الهضم ، انقل الملف إلى الحمام الجليدي ، وقم بإزالة قنية التدفق من الخزان ، وقم بزيادة سرعة المضخة إلى 210-250 مل / دقيقة. دع الأنسجة المهضومة تستنزف من غرفة Ricordi إلى خزان الدائرة.
    ملاحظة: من المعتاد رؤية القليل جدا من الأنسجة المتبقية في غرفة ريكوردي بعد الهضم. عادة ما تبقى <10٪ من أنسجة البنكرياس غير المهضومة ، على الرغم من أن هذا قد يختلف بسبب عوامل خاصة بالعينة.
  12. قم بوزن الأنسجة المتبقية لتحديد كفاءة الهضم. انقل الأنسجة المهضومة من خزان الدائرة إلى أنابيب مخروطية سعة 250 مل يتم الحفاظ عليها باردة على الجليد.

10. جمع أنسجة البنكرياس

  1. جهاز الطرد المركزي لأنسجة البنكرياس المهضومة في أنابيب مخروطية سعة 250 مل عند 250 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية بدون فرامل.
  2. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي بحذر وشفط المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية مع تجنب تعطيل الحبيبات.
  3. أعد تعليق الكريات في كل أنبوب مخروطي برفق واجمعها في أنبوب مخروطي واحد سعة 250 مل. إذا كان هناك ≤50 مل من الأنسجة, أعد تعليق الحبيبات إلى حجم إجمالي قدره 100 مل في محلول جمع الجزر. إذا كان هناك >50 مل من الأنسجة, أعد تعليق الحبيبات إلى حجم إجمالي قدره 200 مل في محلول جمع الجزر. في حالة جمع أكثر من 100 مل من الأنسجة ، قم بتشغيل دورتين لتنقية معالج الخلايا.
  4. أعد تعليق الأنسجة في وسط RPMI لتكوين حجم إجمالي يبلغ 100 مل (بافتراض أنه تم جمع 50 مل من الأنسجة) وقم بتحميله في معالج الخلية.

11. تنقية الجزر باستخدام طريقة التدرج المستمر

  1. قم بتجهيز معالج الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بتحميل 125 مل من محلول التدرج عالي الكثافة في السابق التدرج المستمر ، ثم قم بتحميل محلول التدرج عالي الكثافة في معالج الخلية باستخدام مضخة مضبوطة عند 200 مل / دقيقة.
  3. ابدأ تشغيل وظيفة الطرد المركزي لمعالج الخلية عند 1,000 دورة في الدقيقة.
  4. حرر الهواء من النظام وأعد تجهيزه باستخدام محلول التدرج عالي الكثافة.
  5. أضف 125 مل من محلول التدرج عالي الكثافة و 130 مل من المحلول منخفض الكثافة إلى التدرج السابق.
  6. قم بتحميل 100 مل من تعليق الأنسجة المهضومة.
  7. قم بزيادة سرعة معالج الخلية إلى 2,000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق.
  8. قم بإعداد 16 أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل لجمع أجزاء الجزر المنقى. أضف 25 مل من وسط RPMI إلى كل أنبوب وقم بترتيب جميع الأنابيب بترتيب تصاعدي.
  9. اجمع كسور الجزر المنقاة في الأنابيب المخروطية المعدة للمجموعة.

12. تقييم الجزر وتلطيخها

  1. اجمع 100-200 ميكرولتر من كل جزء من أجزاء الجزيرة المنقاة وضعها في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا لتلوين DTZ لتقييم محتوى الجزيرة ومن كل جزء من التنقية. افحص كل جزء باستخدام الفحص المجهري الضوئي بتكبير 4x. ستظهر الجزر الصغيرة باللون الأحمر الداكن إلى الأسود مع تلطيخ DTZ.
  2. بمجرد تحديد الجزر الصغيرة ، حدد الكسور التي تحتوي على أعلى محتوى من الجزر. جهاز الطرد المركزي الجزء المنقى عند 250 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية بدون فرامل.
  3. استنشق المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الجزيرة في وسط نمو الجزرة. انقل الجزر المنقاة إلى 1-4 قوارير استزراع T-125.
  4. بعد التنقية ، قم بتقييم الجزر من حيث الكمية والجدوى والوظيفة.
    1. استخدم عداد خلايا الجزيرة لتقييم عدد الجزر وتوزيع حجمها (الشكل 7 أ). عادة ما ينتج عن البنكرياس بأكمله ما يعادل 1-2 مليون جزيرة صغيرة.
    2. من أجل تلطيخ الجدوى ، امزج 2 ميكرولتر من الكالسين AM و 2 ميكرولتر من homodimer الإيثيديوم -1 (CaAM / EthD-1) مع 1,000 ميكرولتر من PBS (الشكل 7 ب). اترك الجزر ملطخة لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بتقييمها بتكبير أقل من 4x أو 10x. سوف تلطخ الجزر الصغيرة القابلة للحياة باللون الأخضر بينما ستلطخ الجزر غير القابلة للحياة باللون الأحمر.

13. زراعة الخلايا لجزر البنكرياس

  1. خلال ال 48 ساعة الأولى ، استزراع الجزر في وسط الاسترداد عند 37 درجة مئوية لتوفير مغذيات كافية (~ 1,000 جزيرة / مل من وسط الاسترداد).
  2. من الأيام 2-21 ، استزراع الجزر في وسط النمو القياسي عند 37 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر الإعداد الجراحي وبضع البطن في خط الوسط في الشكل 1. يجب أن يكون شق شق شق شق البطن منحنيا لتجنب فتحة الجهاز البولي التناسلي (الشكل 1 ب). عند إعداد الضام ، قم بإرفاق عمود ضام Omni أو Bookwalter بالزاوية اليسرى السفلية من الطاولة. يتضمن التراجع المثالي شفرتين ضامتين لجدار البطن الأيمن ، واثنتان لجدار البطن الأيسر ، و 1-2 للقولون الأيمن والأمعاء الدقيقة ملفوفة بمنشفة معقمة (الشكل 1 ج). يمكن استخدام شفرات ضام جدار الجسم أو الحشائك أو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد زرع جزر البنكرياس باستخدام متبرعين بالخنازير استراتيجية واعدة لعلاج مرض السكري من النوع الأول. يعد عزل الجزر أمرا صعبا ، كما أن قابلية بقاء الجزيرة النهائية والمحصول معرضان بشدة لانخفاض ضغط الدم ونقص تروية الأنسجة التي تمت مواجهتها أثناء شراء الأعضاء16،17. لتحسين شراء البنكرياس والحفاظ عليه ، يقدم هذا البروتوكول طريقة جديدة لقنية الأبهر ، وعزل الحشوي ، والتروية أثناء شراء بنكرياس الخنزير قبل عزل الجزيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أفاد المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذه المخطوطة بمنحة ابتكار سريري من مؤسسة زراعة الأعضاء في أمريكا الوسطى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 م هيدروكسيد الصوديوم, 100 ملميليبور سيجما1310-73-2
10x HBSS, 500 مل (15 إلى 30 درجة; ج)ثيرموفيشر 14065056
1x D-PBS ، 500 ملثيرموفيشر 14200075
1x HBSS ، 1 لترثيرمو فيشر14025076
250 مل أنابيب مخروطية MilliporeSigmaCLS430236-6EA
أمفوتريسين ب [50 مجم]Millipore SigmaPHR1662
مطهر Povidone Iodine 10٪Millipore Sigma25655-41-8
BioRad التدرج السابقBioRad395
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتثيرمو فيشر10035-04-8
معالج خلية COBEموقع ئي باي317690 
خزان دائرة الهضم ، زجاجة جيبكو ، 1 لترثيرموفيشر 10341001
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)ثيرمو فيشر85190
ديثيزونثيرمو فيشر60-10-6
طقم توصيل سابق متدرجBioRad1652008
الهيبارين [1000 وحدة / مل]منتجات الطوارئ الطبية0409-2720-01
عازلة هيبس (1 م) ، 100 ملثيرموفيشر 15630080
مصل بشري ألبومين 25٪ ، 100 ملسيلبروجينHSA2001-25-1
إيزوفلورانكوفيتروسالبند #:11695067772
الكيتامينباترسونالبند #:07-894-8462
ليبيراز (100 مجم)ميليبور سيجما5401020001
حية / ميتة طقم الجدوى / السمية الخلويةThermo FisherL3224
Lympholyte 1.1 Media 500 ملCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 TubingMasterfle96419-16
Masterflex Peristaltic PumpMasterflex07522-30
PenStrep (2 مجم / مل)CelprogenPS-30-002
Pulmozyme (1 مجم / مل ، 2.5 مل / قارورة)Dornase Alfa8931278
Recovery Medium, PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
وسيط الثقافة القياسية ، PIM (S)Prodo Laboratories، Inc.PIM-S001GMP
Tzed & trade; (تيلتامين وزولازيبام) حقن CPattersonالبند #: 07-894-6240
حل جامعة ويسكونسن (UW) ، 3 لترحلول الزرع العالمية1000-0046-06
حمام مائيSigma AlderichCLS6783-1EA
XylazinePattersonالبند #: 07-891-6165

المراجع

  1. Gillespie, K. M. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).
  2. Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Anazawa, T., et al. Improved method of porcine pancreas procurement with arterial flush and ductal injection enhances islet isolation outcome. Transplant Proc. 42 (6), 2032-2035 (2010).
  5. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  6. Hilling, D. E., Rijkelijkhuizen, J. K., Tons, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Porcine islet isolation outcome is not affected by the amount and distribution of collagen in the pancreas. Xenotransplantation. 17 (3), 250-255 (2010).
  7. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  8. Otsuka, R., et al. Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation. J Clin Med. 11 (15), 4290(2022).
  9. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  10. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. 21 (6), 574-581 (2014).
  11. Hart, N. A., et al. Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver. Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).
  12. Tullius, S. G., et al. Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions. Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).
  13. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Arch Surg. 136 (3), 276-279 (2001).
  14. Lu, Y., et al. Adult pig islet isolation. J Vis Exp. (176), (2021).
  15. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplant. 19 (5), 613-628 (2010).
  16. Iwanaga, Y., Sutherland, D. E., Harmon, J. V., Papas, K. K. Pancreas preservation for pancreas and islet transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13 (4), 445-451 (2008).
  17. Pratschke, J., et al. Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation. Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).
  18. vander Windt, D. J., et al. Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated. Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).
  19. Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield. Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).
  20. Toso, C., et al. Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

جزر البنكرياسزرع الأعضاء من فصائل مختلفةتقننة الشريان الأبهرحفظ الأعضاءهضم البنكرياستنقية الجزرالطرد المركزي المتدرج
التروية الجراحية وعزل البنكرياس الخنازير لعزل الجزر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.