مقالة منهجية

إنشاء عيوب مركبة الخيوط العظمية في الفئران: نموذج موحد للتحقيق في العلاج التجديدي للخياطة

2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66417

⸱

مايو 10, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

في هذه المقالة

ملخص

نصف الإجراءات الجراحية التفصيلية للعيوب المركبة العظمية في خياطة الجلسنة في الفئران ، جنبا إلى جنب مع التحقيقات في التكهنات قصيرة وطويلة المدى للنموذج. نهدف إلى بناء نموذج موحد لتطوير العلاجات التجديدية للخياطة.

الملخص

غالبا ما تتزامن العيوب الجلدية واسعة النطاق مع اضطراب خياطة الجمجمة ، مما يؤدي إلى ضعف في استعادة العيوب الجلدية وتطور الجمجمة (يحدث الأخير في الجمجمة النامية). ومع ذلك ، فإن عدم وجود نموذج موحد يعيق التقدم في التحقيق في العلاجات التجديدية للخياطة ويشكل تحديات لإجراء تحليلات مقارنة عبر دراسات متميزة. لمعالجة هذه المشكلة ، يصف البروتوكول الحالي عملية النمذجة التفصيلية للعيوب المركبة العظمية في خياطة الجلسنة في الفئران.

تم إنشاء النموذج عن طريق حفر ثقوب مستطيلة كاملة السماكة بقياس 4.5 مم × 2 مم عبر الغرز الإكليلية. تم القتل الرحيم للفئران ، وتم حصاد عينات الجمجمة بعد الجراحة في اليوم 0 ، والأسبوع 2 ، والأسبوع 6 ، والأسبوع 12. أكدت نتائج التصوير المقطعي المحوسب من العينات التي تم جمعها مباشرة بعد الجراحة التأسيس الناجح للعيب المركب العظمي للخياطة ، بما في ذلك إزالة الخيط الإكليلي وأنسجة العظام المجاورة.

أظهرت البيانات من الأسبوعين6 و 12بعد الجراحة ميلا طبيعيا للشفاء لإغلاق العيب. أكد التلوين النسيجي صحة هذا الاتجاه من خلال إظهار زيادة الألياف المعدنية والعظام الجديدة في مركز العيب. تشير هذه النتائج إلى اندماج الخيوط التدريجي بمرور الوقت بعد العيوب الجلدية ، مما يؤكد أهمية التدخلات العلاجية لتجديد الخيط. نتوقع أن يسهل هذا البروتوكول تطوير علاجات تجديد الخيوط ، وتقديم رؤى جديدة حول الاستعادة الوظيفية للعيوب الجليسية وتقليل النتائج السلبية المرتبطة بفقدان الخيط.

المقدمة

الغرز القحفية هي وصلات ليفية كثيفة بين عظام الجمجمة ، تعمل كمفاصل لتسهيل حركة الجمجمة الطفيفة وتوفير وسادة واقية للدماغ تحت الضغط1. في السنوات الأخيرة ، سلطت الأبحاث المتزايدة الضوء على الدور المحوري لخيوط الجمجمة في نمو الجمجمة ، والتوازن القحفي الوجهي ، وإمكانات إصلاح العظم المتأصلة2،3،4،5،6،7،8. خلال فترات النمو والتطور ، تعمل الغرز القحفية كمراكز نمو رئيسية في الجمجمة4. يحدث تكوين عظام جديد في الجبهات العظمية على جانبي الغرز ، بينما تحافظ الخلايا الموجودة داخل الغرز على حالة وسيطة غير متمايزة ، مما يضمن تمدد متوازن للجمجمة جنبا إلى جنب مع نمو الدماغ1. يؤدي فقدان خيوط الجمجمة في هذا الوقت إلى تناقض بين نمو الجمجمة والدماغ ، مما يؤدي إلى مشاكل خطيرة مثل إصابات الدماغ ، واستسقاء الرأس ، وزيادة الضغط داخل الجمجمة ، والخلل الوظيفي المعرفي3،9.

إلى جانب ذلك ، تلعب خيوط الجمجمة دورا مهما في تحديد تشخيص العيوب الجلدية5،7،10. يتم توزيع إمكانات التجدد عبر سطح الجلسنة بشكل غير متساو ، حيث تظهر خيوط الجمجمة قدرات فائقة بشكل ملحوظ مقارنة بالمناطق غير الخيطة10،11. تشير إحدى الدراسات إلى أن سرعة التئام العيوب الجليزية ترتبط عكسيا بالمسافة بين خياطة الجمجمة وموقع الإصابة10. على وجه التحديد ، تؤدي إزالة الغرز الإكليلي والسهمي إلى عدم التئام عيوب العظام الجداري7 ، مع التأكيد على ضرورة تجديد الخيط في عيوب الجلالة. ومع ذلك ، فإن تركيز الدراسات الحالية ينصب في الغالب على استعادة البنية العظمية القحفية مع إهمال تجديد اللحمة المتوسطة للخياطة.

فيما يتعلق بالتقدم في تجديد الخيوط ، لوحظت نتائج واعدة مع زرع اللوحات العظمية المحتوية على الخيط والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) والمواد الحيوية الاصطناعية. عندما تم زرع اللوحات العظمية مع الغرز في عيوب الجلالة ، فقد نجحت في الاندماج والشفاء ، على عكس تلك التي لا تحتوي على خيوط جراحية تظهر عدم الاتحاد وعدم القدرة على تكوين السمحاق أو الأم الجافية أو الخلايا العظمية5. وبالمثل ، فإن زرع الخلايا الجذعية الجذعية المشتقة من نخاع العظام في العيوب المركبة العظمية السهمية سهل تكوين فجوات تشبه الخيط12. وتجدر الإشارة إلى أن دراسة حديثة سلطت الضوء على تحقيق تجديد الخيط باستخدام Gli1 + MSCs ، مما يسمح بالتحكم في الضغط داخل الجمجمة ، وتصحيح تشوه الجمجمة ، وتعزيز الوظيفة العصبيةالمعرفية 13. مع تطور الطب التجديدي والهندسة الطبية الحيوية ، يركز الباحثون بشكل متزايد على المواد الحيوية لهندسة الأنسجة نظرا لخصائصها القابلة للتكيف والقابلةللتخصيص 14. والجدير بالذكر أن أغشية البولي تترافلورو إيثيلين أثبتت فعاليتها في إعادة بناء عظام الجمجمة واللحمة المتوسطة للخياطة في وقت واحد15،16.

ومع ذلك ، تفتقر الأبحاث القحفية الوجهية إلى النماذج الراسخة لاستكشاف العلاجات التجديدية للخياطة ، على عكس النماذج الناضجة نسبيا في إصلاح الأنسجة الأخرى مثل العظام والجلد والغضاريف والعضلات17. يقيد عدم وجود نموذج موحد دراسة العلاجات التجديدية للخياطة ويجعل من الصعب إجراء تحليل مقارن عبر الدراسات المختلفة. لذلك ، أثبتت دراستنا عيبا مركبا عظميا في خياطة الفئران الجلجلية وقابلا للتكرار. من خلال هذه الطريقة ، نهدف إلى تطوير التدخلات السريرية المناسبة لإعادة بناء خياطة الجمجمة ، وتقديم وجهات نظر جديدة حول الإصلاح الوظيفي للعيوب الجلدية وتقليل النتائج غير المواتية الناتجة عن فقدان الخياطة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لكلية غرب الصين لطب الأسنان بجامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2021-597). تم الحصول على ما مجموعه 12 (3 فئران في كل نقطة من النقاط الزمنية الأربع) من فئران Sprague-Dawley (SD) (ذكر ، 300 جرام ، 8 أسابيع) من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. التحضير قبل الجراحة

  1. المواد الجراحية
    1. قم بإعداد الأدوات الجراحية المعروضة في الشكل 1 أ ، بما في ذلك الملقط المنحني ، ومشرط معقم يمكن التخلص منه ، ومصعد السمحاق ، وإبرة الري ، وكرات القطن ، وقبضة منخفضة السرعة ، ومحرك جراحي ، وأزيز دائري منخفض السرعة للأسنان (الشكل 1 ب ، قطر 1.2 مم و 0.8 مم ، على التوالي) ، حامل إبرة ، خيوط 3-0 أحادية الشعيرات ، ومقص مستقيم.
  2. التعقيم والتطهير
    1. تعقيم الأدوات عن طريق التعقيم بالبخار (125-135 درجة مئوية ، 20-25 دقيقة) مقدما.
    2. استخدم الإيثانول لتعقيم المعدات الطبية الحساسة للحرارة ، مثل ماكينات الحلاقة الكهربائية.
    3. استخدم الأقمشة الطبية غير المنسوجة المعقمة لتغطية منصة التشغيل وتطهير البيئة المحيطة بنسبة 75٪ من الإيثانول.
  3. تخدير
    1. تحضير للجراحة مع فترة تأقلم مدتها أسبوع واحد.
    2. حقن الفئران داخل الصفاق بالزيلازين (10 مجم / كجم) والكيتامين (100 مجم / كجم) قبل 20 دقيقة من الجراحة للتخدير أو استخدام أي بروتوكول تخدير مناسب لتحقيق التخدير العام.
      ملاحظة: عادة ما يسري مفعول كوكتيل الكيتامين والزيلازين المخدر الذي يتم إعطاؤه داخل الصفاق في الفئران في غضون 10-15 دقيقة ، ويصل إلى ذروة التخدير بعد حوالي 35-40 دقيقة من الحقن. لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء التخدير ، من الأفضل وضع الفئران على وسادة تدفئة.
    3. يجب تطبيق حقنة تحت الجلد قبل الجراحة من الكاربروفين بمعدل 5 ملغ/كغ لتوفير التسكين.
    4. استخدم "طريقة قرصة إصبع القدم" لتحديد ما إذا كانت الفئران واعية وسريعة الاستجابة أم لا.

2. العملية الجراحية

  1. إعداد الموقع
    1. ضع الجرذ في وضع الانبطاح مع تمديد رأسه بشكل طبيعي عموديا ، دون الحاجة إلى أجهزة أو قيود خاصة للحفاظ على هذا الموقف (الشكل 2 أ).
    2. ضع مرهما بيطري ، أي الفازلين ، على عيون الفئران لمنع جفاف القرنية.
    3. قم بإزالة الشعر من فروة الرأس بين جسر الأنف ومفصل العمود الفقري العنقي باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية (الشكل 2 ب). تطهير المنطقة الجراحية بحركات دائرية تشع من المركز بمحلول يودوفور 2٪ متبوعا بنسبة 75٪ إيثانول. استخدم ستارة جراحية لتغطية ظهر والفراء المحيط بالشق.
  2. فتح موقع الجراحة
    1. بدءا من منتصف عظم الأنف ، قم بعمل شق جلدي طولي بطول 2 سم بمشرط يمكن التخلص منه بعد خط الوسط للجمجمة (الشكل 2 ج).
    2. قم بعمل شق في خط الوسط السمحاق الذي يعكس النقطة الأولية ومدى طبقة الجلد بمشرط (الشكل 2 د). بعد ذلك ، ارفع السمحاق برفق على جانبي الشق باستخدام مصعد السمحاق (الشكل 2E1) لكشف العظام الجدارية والعظام الأمامية والخيوط الإكليلية (الشكل 2E2).
      ملاحظة: عند شق السمحاق ، احرص على عدم الإضرار بالغرز القحفية لمنع النزيف المفرط عند القطع. يعد التعرض الكافي للخياطة الإكليلية أمرا في غاية الأهمية للإجراءات التالية.
    3. اشطف الجرح بمحلول ملحي وجفف المنطقة الجراحية بكرات قطنية.
  3. إنشاء نموذج عيب مركب خياطة عظمية
    1. اضبط المحرك الجراحي على 35,000 دورة في الدقيقة عن طريق تدوير المقبض (الشكل 1 أ ، السهم الأصفر) ، ثم قم بتشغيل المفتاح (الشكل 1 أ ، السهم الأبيض).
    2. بدءا من أي نقطة على الخيط الإكليلي ، قم بتطبيق القوة الرأسية باستخدام دبر دائري قطره 1.2 مم حتى يشعر بالإحساس بالاختراق.
      ملاحظة: أوصي بنقطة منتصف الخيط الإكليلي (المشار إليها بالأسهم الصفراء في الشكل 2E2) كنقطة انطلاق للاختراق. عند الطحن ، يجب أن تبقى تدريبات الأسنان عموديا على سطح الجمجمة. توخي الحذر حتى لا تستمر في الحفر بعد اختراق السماكة الكاملة للجمجمة لمنع أي ضرر إضافي للفئران ، بما في ذلك تلف الدماغ أو النزيف الدماغي.
    3. من نقطة الاختراق ، حرك البر بشكل جانبي على طول الخيط الإكليلي لإنشاء أخدود تحديد المواقع بطول 4 مم تقريبا (الشكل 2F1). قم بإزالة أنسجة العظام مع البر على جانبي أخدود تحديد المواقع لتشكيل عيب مستطيل كامل السماكة في البداية (الشكل 2F2).
    4. استخدم بري دائري بقطر 0.8 مم لتحسين التفاصيل (الشكل 2G1) ، بما في ذلك طحن الزوايا اليمنى وتنعيم هوامش العيوب ، مما يؤدي في النهاية إلى تحقيق عيب مستطيل قياسي بعرض 2 مم وطول 4.5 مم (الشكل 2G2).
      ملاحظة: لتحقيق الإزالة الكاملة للخياطة الإكليلية مع الحفاظ على الغرز السهمية والأمامية في الفئران SD 300 جم ، يبلغ الحد الأقصى لطول العيب الممكن حوالي 4.5 مم. بالنظر إلى عرض الخيط الإكليلي في الاتجاه الأمامي الخلفي (الشكل التكميلي S1) ، تم تعيين عرض العيب على 2 مم.
    5. قم بإنشاء عيبين عبر النصفين الأيسر والأيمن من الخيط الإكليلي للمقارنة الذاتية.
    6. الحفاظ على الري المستمر للمحلول الملحي أثناء إجراء الحفر للحماية من الإصابة الحرارية للجمجمة والدماغ. في غضون ذلك ، استخدم كرات القطن لتجفيف منطقة العملية.
  4. التحقق من أبعاد العينة
    1. تحقق بانتظام من طول وعرض العيوب باستخدام الفرجار الورني (الشكل 2H1 ، H2) لضمان الاتساق عبر جميع العينات.
  5. إغلاق موقع الجراحة
    1. أغلق الجلد ب 3-0 خيوط أحادية الشعيرات (الشكل 2I).
  6. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق في الجسم الحي مباشرة بعد الجراحة (μCT)
    1. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بإجراء فحوصات التصوير المقطعي المحوسب في الجسم الحي على جميع الفئران مباشرة بعد الجراحة لتأكيد نجاح العملية الجراحية ومراقبة اتجاهات التعافي من العيوب لكل فرد.

3. رعاية ما بعد الجراحة

  1. وفقا لبروتوكولات رعاية ، يجب تطبيق المسكنات المعمول بها حسب الضرورة بعد الجراحة ، على سبيل المثال ، كاربروفين (5 مجم / كجم ، الاستخدام تحت الجلد).
  2. انقل الفئران إلى وسادة تسخين ثابتة (37 درجة مئوية) للتعافي بعد الجراحة.
  3. بمجرد أن تكون واعيا تماما ، انقل الفئران إلى قفص السكن الذي يحتوي على فراش نظيف.
    ملاحظة: راقب الفئران باستمرار بعد الجراحة. لا تتركهم دون رقابة حتى يتمكنوا من الحفاظ على الرق. احتفظ بالفئران التي يتم تشغيلها معزولة عن غيرها حتى تتعافى تماما.
  4. إجراء إدارة التسكين ومراقبة ما بعد الجراحة لمدة 24 ساعة ، متبوعة بتقييمات يومية طوال الأسبوع الأول بعد الجراحة. راقب الفئران 1-2x على الأقل في الأسبوع بعد ذلك.

4. جمع العينات وتحليل البيانات

  1. تحضير العينة
    1. اجمع عينات الجمجمة في اليوم 0 بعد الجراحة ، والأسبوع 2 ، والأسبوع 6 ، والأسبوع 12. قتل الفئران باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 .
    2. قم بتثبيت العينات في 4٪ بارافورمالدهيد عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة قبل إجراء مزيد من التحليل.
  2. تقييم μCT
    1. إجراء فحوصات التصوير المقطعي المحوسب على عظام الجمجمة في اليوم 0 ، الأسبوع 6 ، الأسبوع 12 مع معلمات المسح التالية: إمكانات أنبوب الأشعة السينية ، 70 كيلو فولت ؛ شدة الأشعة السينية ، 0.2 مللي أمبير ؛ مرشح ، AL 0.5 مم ؛ وقت التكامل ، 1 × 300 مللي ثانية ؛ وحجم فوكسل ، 10 ميكرومتر.
    2. احصل على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد وصور مقطعية باستخدام برنامج معالجة الصور (انظر جدول المواد).
    3. قياس حجم العيب المتبقي وإجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج المقابلة (انظر جدول المواد).
  3. تلطيخ نسيجي
    1. قم بإزالة كلسات عظام الجمجمة في محلول حمض رباعي الأسيتيك ثنائي الإيثيلين بنسبة 12٪ (وزن / حجم) (الرقم الهيدروجيني = 7.2) عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أسابيع.
      ملاحظة: قم بإزالة الكلس من العينات مع تغيير المحلول كل 3 أيام. استخدم شاكر لتسريع العملية. يشار إلى الاكتمال عندما تخترق إبرة 25 جم العينة بسهولة.
    2. استمر في الجفاف وتضمين البارافين وتحضير أقسام 6 ميكرومتر باستخدام البروتوكولات القياسية18.
    3. إجراء تحليل نسيجي باستخدام الهيماتوكسيلين والأيوزين (H&E) وتلوين ماسون ثلاثي الألوان باتباع بروتوكول المجموعة18.

النتائج

في هذه الدراسة ، تم إنشاء عيب مركب خياطة الفئران العظمية عن طريق حفر ثقب مستطيل 4.5 مم × 2 مم عبر الخيط الإكليلي. تم تصوير الرسم التخطيطي الجراحي ومخطط تدفق البحث في الشكل 3. أكدت الصورة ثلاثية الأبعاد وعرض المقطع العرضي لعينات ما بعد الجراحة لمدة 0 يوم ، أي العينات التي تم جمعها مباشرة بعد الجراحة ، الإنشاء الناجح لعيب جليزي كامل السماكة ، بما في ذلك الإزالة الكاملة للخياطة الإكليلية وكذلك الهياكل العظمية المجاورة في كلا الطرفين (الشكل 4 أ). كشفت صور التصوير المقطعي المحوسب ونتائج التحليل الإحصائي المقابلة في 6 أسابيع بعد العملية عن ميل طبيعي نحو إغلاق العيوب مصحوبا بعقيدات متكلسة غير منتظمة تشكلت داخل العيب (الشكل 4). أصبح هذا الاتجاه أكثر وضوحا بعد 12 أسبوعا من الجراحة (الشكل 4) ، مما يشير إلى اندماج الخيط المحتمل مع تقدم الوقت. تم إجراء مزيد من التحليل النسيجي باستخدام تلطيخ H & E و Masson ثلاثي اللون. بعد أسبوعين من الجراحة ، لاحظنا امتدادا واستمرارا ملحوظا للأم السمحاق والجافية ، والتي شكلت نسيجا ليفيا كثيفا وسميكا وأغلقت منطقة العيب بشكل فعال (الشكل 5). والجدير بالذكر أنه في هذه المرحلة الزمنية المبكرة ، تم الكشف عن ظهور ألياف معدنية ملطخة باللون الأزرق ، والتي خضع وجودها لزيادة كبيرة بحلول وقت 6 أسابيع بعد الجراحة (الشكل 5). بحلول 12 أسبوعا بعد الجراحة ، لوحظت قطع كبيرة من العظام الجديدة في مركز العيوب (الشكل 5) ، مما يؤكد التشخيص السلبي للتكلس اللحمي وإغلاق الخيط. تؤكد نتائج الشفاء الطبيعية غير المواتية للعيوب المركبة العظمية للخياطة على ضرورة تجديد خياطة الجمجمة من خلال التدخلات العلاجية ، مثل زرع المواد الحيوية13،15،16.

figure-results-1
الشكل 1: الأدوات الجراحية. (أ) تم ترقيم العناصر الجراحية بترتيب الاستخدام ، بما في ذلك (1) ملقط منحني ، (2) مشرط معقم يمكن التخلص منه ، (3) مصعد السمحاق ، (4) إبرة الري ، (5) كرات قطنية ، (6) قبضة منخفضة السرعة ، (7) محرك جراحي (يمثل السهم الأصفر مقبض RPM والسهم الأبيض يمثل المفتاح) ، (8) أزيز دائري منخفض السرعة للأسنان ، (9) حامل إبرة ، (10) 3-0 خيوط أحادية ، و (11) مقص مستقيم. (ب) أزيز دائري منخفض السرعة بقطر 1.2 مم و 0.8 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: إجراء جراحي. (أ) ضع الجرذ في وضع الانبطاح. (ب) حلق شعر فروة الرأس باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. (ج) شق الجلد بمشرط يمكن التخلص منه. (د) شق السمحاق بمشرط. (هاء 1 ، هاء 2) ارفع السمحاق لكشف الغرز الإكليلية باستخدام مصعد السمحاق. تشير الأسهم الصفراء إلى خيوط إكليلية. (F1) تحمل أخدود تحديد المواقع. (F2) قم بإنشاء عيب مستطيل مبدئيا مع دبر دائري 1.2 مم. (G1 ، G2) قم بقص العيب ببر دائري 0.8 مم للحصول على شكل مستطيل قياسي 4.5 × 2 مم. (H1 ، H2) معايرة عرض وطول العيب باستخدام الفرجار الورني. (I) أغلق الجلد باستخدام 3-0 خيوط أحادية. يستخدم هذا التصوير جثة ، يتم تركها عمدا دون اغتصاب لتسهيل تحسين التصور التشريحي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: رسم تخطيطي للعيب المركب العظمي الجلدي واستراتيجية البحث لهذه الدراسة. الاختصارات: H & E = الهيماتوكسيلين واليوزين ؛ μCT = التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: ميل إغلاق عيب مركب خياطة العظم الجلسي. (أ) صور تمثيلية μCT ومناظر مقطعية للعيوب المركبة العظمية للخياطة في اليوم 0 بعد الجراحة والأسبوع 6 والأسبوع 12. تصور المقاطع العرضية المواقع المشار إليها بالخطوط الصفراء المتقطعة في صور ثلاثية الأبعاد. قضبان المقياس = 2 مم. (ب) التحليل الكمي لحجم العيب المتبقي بعد الجراحة من خلال تقييمات التصوير المقطعي المحوسب. ن = 6 مكررات / مجموعة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD. ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Dunnett للمقارنات المتعددة. ص<0.001. الاختصارات: PO = ما بعد الجراحة. μCT = التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: الاختلافات النسيجية في العيوب المركبة العظمية والخياطة. (أ) H & E و (ب) تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان للعيوب المركبة العظمية في أسبوع PO 2 ، الأسبوع 6 ، والأسبوع 12. تشير الخطوط العريضة المتقطعة الحمراء إلى الأنسجة الليفية التي تغلف منطقة العيب. تمثل النقوش الخماسية السوداء الألياف المعدنية الملطخة باللون الأزرق. تسلط الأشكال الخماسية الصفراء الضوء على العظم الجديد المتشكل في مركز العيب. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر ؛ 200 ميكرومتر (insets). الاختصارات: PO = ما بعد الجراحة. H & E = الهيماتوكسيلين واليوزين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: عرض الخيط الإكليلي في الاتجاه الأمامي الخلفي (صورة الجلثة المستوية السهمية). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تركز نماذج العيوب الجلجية التقليدية ، سواء كانت تنطوي على خيوط الجمجمة أم لا ، بشكل أساسي على إصلاح الأنسجة الصلبة ، وغالبا ما تتجاهل التجديد الحيوي لللحمة المتوسطة للخياطة19،20. في أبحاث تجديد الخيط ، أدت النماذج السابقة ، مثل تلك التي أجراها Mardas et al.15،16 ، باستخدام تريفين بار لإنشاء عيب دائري 5 مم عبر خياطة السهمية للفئران ، إلى فقدان كبير للأنسجة الصلبة ، وبالتالي الابتعاد عن الهدف الأساسي المتمثل في تجديد خياطة. وبالمثل ، فإن منهجية Wilk et al.7 ، التي تشمل إزالة كل من الغرز الإكليلية السهمية واليمنى وخلق عيب خطير في العظام الجدارية اليمنى ، على الرغم من أنها مفيدة ، إلا أنها أدخلت تعقيدات ومتغيرات مربكة محتملة بسبب وجود مواقع عيوب متعددة. في المقابل ، يخلق بروتوكولنا عيوبا مستطيلة ثنائية على طول الخيط الإكليلي ، بهدف نموذج بحث أكثر انسيابية واستهدافا. تشمل الغرز القحفية الرئيسية الغرز الإكليلية ، والسهمية ، والميتوبية ، والخيوط اللامدوية21. تختلف عن الغرز الميتوبية والسهمية ، والتي يتم ترتيبها طوليا على الجمجمة ، تقع الغرز الإكليلية واللامدوية بشكل عرضي ويمكن تقسيمها إلى نصفين ، مما يسهل إنشاء عيبين بظروف متطابقة. على عكس خياطة lambdoid ، فإن المجال الجراحي المكشوف بشق فروة الرأس يسهل الوصول إليه لسلسلة من الإجراءات في الخيط الإكليلي. إن إنشاء عيوب في كل من النصفين الأيسر والأيمن من الخيط الإكليلي وتطبيق تدخلات مختلفة على كل موقع يسهل مقارنة أكثر وضوحا للعلاجات المتميزة من خلال ضبط النفس. علاوة على ذلك ، يسمح هذا النهج بالمقارنة بين الجوانب المعالجة وغير المعالجة ، مما يوفر نظرة ثاقبة للتفاوتات بين عملية الشفاء المتدخلة وعملية الشفاء الطبيعية. لذلك ، تشير دراستنا إلى أن إنشاء عيوب مركبة في الخيوط العظمية على جانبي الغرز الإكليلية في الفئران هو نموذج جراحي مناسب لدراسة العلاجات التجديدية للخياطة.

يسترشد اختيار أبعاد العيوب بدقة باعتبارات عملية وتشريحية. بالنسبة لهذا النموذج الحيواني المحدد ، يكمن التحدي الأساسي في إزالة الخيط الإكليلي تماما مع الحفاظ على الغرز السهمية والأمامية ، مع الحد الأدنى من إزالة الأنسجة العظمية. لذلك ، فإن الإستراتيجية المثلى تستلزم إنشاء عيب مستطيل دقيق على طول الخيط الإكليلي. لا غنى عن هذا القرار الاستراتيجي ، حيث أن أي لحمة متوسطة متبقية في خياطة الإكليل أو الغرز المجاورة يمكن أن تؤدي إلى عدم الدقة في تقييم التأثير التجديدي الحقيقي للعلاج. وبالتالي ، أنشأنا أكبر طول عيب ممكن لذكور 300 جرام من الفئران SD عند حوالي 4.5 مم. علاوة على ذلك ، مع الأخذ في الاعتبار عرض الخيط الإكليلي في الاتجاه الأمامي الخلفي (حوالي 1.5 مم في المستوى السهمي ، كما هو موضح في الشكل التكميلي S1) ، قمنا بتعيين عرض العيب عند 2 مم لضمان الإزالة الكاملة للخياطة من سطح الجمجمة إلى عمقها. تجدر الإشارة إلى أن الأبعاد المحددة للعيب ، سواء في الطول أو العرض ، قد تتطلب تعديلا بناء على عوامل مثل نوع وعمره ، بالإضافة إلى الأهداف التجريبية. خلقت دراسة أخرى عيبا رفيعا مستطيلا بعرض 0.3-0.4 مم على طول الخيط الإكليلي ، لاستيعاب الحجم الأصغر للفئران13.

والجدير بالذكر أن صعوبة إنشاء هذا النموذج الجراحي تكمن في بناء عيوب مستطيلة قياسية وموحدة. من الضروري الحفاظ على الاتساق في شكل العيب لضمان جرعة موحدة من العوامل النشطة بيولوجيا عبر العينات ، وبالتالي تقليل الاختلافات بين المجموعات وداخل المجموعة. في هذا الصدد ، أثناء عملية إزالة مركب الخيط العظمي ، استخدمنا في البداية دبر دائري بقطر 1.2 مم لتحديد موقع الخيط الإكليلي ولإنشاء مخطط تقريبي للعيب المستطيل كامل السماكة (الشكل 1 ب). بعد ذلك ، تحولنا إلى أصغر بر دائري (قطر 0.8 مم) لتحسين المنعطفات ذات الزاوية اليمنى وتنعيم حواف العيوب (الشكل 1 ب). لضمان اتساق طول كل عيب وعرضه ، تم استخدام الفرجار الورني لتجنب الإفراط في الطحن أو النقص أثناء عملية الحفر. على الرغم من هذا النهج ، كشف فحص μCT أن العيب المستطيل الذي أنشأناه لا يزال على شكل قوس إلى حد ما (الشكل 4) ، مما يشير إلى الحاجة إلى مزيد من التحسين لطريقة النمذجة للحصول على أشكال طحن دقيقة.

لتقييم التشخيص ، توفر فحوصات التصوير المقطعي المحوسب أكثر الوسائل المباشرة ، بما في ذلك تقييم التئام أنسجة العظام وحالة الغرز القحفية ، سواء كانت مغلقة أو دون عائق. علاوة على ذلك ، فإن التحقيق على المستوى النسيجي المرضي ضروري لدراسة تجديد خياطة الجمجمة. يساعد التلوين النسيجي المرضي في التمييز بين عدم إغلاق العيوب بسبب تكوين الأنسجة الوسيطة ، أو تثبيط العظام التصالحي ، أو احتلال مساحة المواد. من المحتمل أن تمتلك فقط الأساليب التي تسهل تجديد الأنسجة الوسيطة إمكانية تجديد خياطة الجمجمة. إلى جانب ذلك ، على الرغم من عدم وجود تجارب ذات صلة أثناء بناء النموذج ، يوصى بشدة بالكشف عن التعبير على مستوى البروتين لعلامات MSC للخياطة داخل الأنسجة المتجددة بعد التدخلات العلاجية. يساهم هذا التحليل ، باستخدام تقنيات مثل التألق المناعي أو الكيمياء المناعية أو قياس التدفق الخلوي ، في تأكيد نجاح تجديد الخياطة. تشمل علامات MSC الخاصة بالخياطة Cd51 و Cd200 و Gli1 و Axin2 و Prrx1 و Ctsk والمزيد1،22.

باختصار ، أبلغت هذه الدراسة عن عملية النمذجة التفصيلية للعيوب المركبة العظمية في خياطة الجلسنة في الفئران لدراسة تشخيص عيوب الجليزة المتقاطعة وتطوير العلاجات المناسبة لتجديد الغرز الجمجمة. من المناسب ملاحظة أن مجال تجديد خياطة الجمجمة هو بالفعل مكان مناسب ، مع عدم وجود نماذج أو طرق قياسية سائدة في الأدبيات لتجديد خيوط الجمجمة. وبالتالي ، نعتقد أن بروتوكولنا يوفر أساسا منهجيا متينا للتحقيق في مناهج تجديد الخياطة ويقدم وجهات نظر مبتكرة حول الاستعادة الوظيفية للعيوب الجلدية ، مع الهدف النهائي المتمثل في تحسين نوعية حياة المرضى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 82100982 (FL) ، 82101000 (HW) ، 82001019 (BY) ، إدارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان 2022NSFSC0598 (BY) ، 2023NSFSC1499 (HW) وتمويل البحث من مدرسة غرب الصين / مستشفى طب الأسنان بجامعة سيتشوان (RCDWJS2021-5). تم إنشاء الشكل 3 باستخدام Biorender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ بارافورمالديهايدBiosharpBL539A
2٪ محلول اليودوفورتشنغدو جينشان الكاشف الكيميائي المحدودةلا شيء
75 ٪ الإيثانولتشنغدو جينشان الكاشف الكيميائي المحدودةلا شيء
كرات القطنHaishi Hainuo Group Co., Ltd. لا شيء
مسحات القطنLakong Medical Devices Co., لا شيء
ملقط منحنيتشنغدو شيفنغ المحدودةلا يوجد
برنامج Dataviewer و Ctan لتقييمات حجم العيوب المتبقيةBrukerNone
Dental منخفض السرعة دائريDreybird Medical Equipment Co.، Ltd.RA3-012
RA1-008
مشرط معقم يمكن التخلص منههانغتشو هواوي للمستلزمات الطبية المحدودةلا يوجد
محاقن يمكن التخلص منها (22 جم)Chengdu Shifeng Co.، Ltd.SB1-089 (IX)
ماكينة حلاقة كهربائيةJASEBM320210
حمض رباعي الأسيتيك ثنائي الإيثيلين (EDTA)BioFroxx1340GR500
Hematoxylin و Eosin Stain KitBiosharpBL700B
إبرة الري (23 جم) شركةSichuan New Century Medical Polymer Products Co.، Ltd.لا شيء
منخفضة السرعةقوانغتشو Dental Guard Technology Co.، Ltd.لا شيء
ماسون s Trichrome Stain KitSolarbioG1340
الأقمشة الطبية غير المنسوجةHenan Yadu Industrial Co., Ltd. لا شيء
المقطعي المحوسب الدقيقة (& micro; CT) Scanco Medical AGµ CT45
يحاكي 20.0 للصور المقطعيةتجسيدلا
توجد حاملات إبرةتشنغدو شيفنغ المحدودةلا شيء
مصعد Periostealتشنغدو شيفنغ المحدودةلا شيء
محلول ملحيسيتشوان كيلون الصيدلانية المحدودةلا شيء
برنامج Scanco medical visualizer for 3D imagereconstruction Scanco Medical AGNone
SPSS Statistics 20.0 للتحليل الإحصائيIBMNone
Sprague-Dawley rats Byrness Weil Biotech Ltdلا شيء
مقص مستقيمChengdu Shifeng Co.، Ltd.لا يوجد
محرك جراحيMARATHONN3-140232
خيوط جراحية (3-0 شعيرات أحادية)هانغتشو هواوي للمستلزمات الطبية المحدودةاي
قبضة التصوير

المراجع

  1. Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
  2. Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
  3. Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., Helms, J. A., Longaker, M. T. Cranial suture biology. Curr Top Dev Biol. 66 (4), 287-328 (2005).
  4. Slater, B. J., et al. Cranial sutures: A brief review. Plast Reconstr Surg. 121 (4), 170-178 (2008).
  5. Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 17 (4), 386-396 (2015).
  6. Maruyama, T., Jeong, J., Sheu, T. -J., Hsu, W. Stem cells of the suture mesenchyme in craniofacial bone development, repair and regeneration. Nat Commun. 7 (1), 10526(2016).
  7. Wilk, K., et al. Postnatal calvarial skeletal stem cells expressing PRX1 reside exclusively in the calvarial sutures and are required for bone regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  8. Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial suture-derived stem cells and their contribution to cranial bone repair. Front Physiol. 8, 956(2017).
  9. Kajdic, N., Spazzapan, P., Velnar, T. Craniosynostosis-recognition, clinical characteristics, and treatment. Bosn J Basic Med Sci. 18 (2), 110-116 (2018).
  10. Park, S., Zhao, H., Urata, M., Chai, Y. Sutures possess strong regenerative capacity for calvarial bone injury. Stem Cells Dev. 25 (23), 1801-1807 (2016).
  11. Quarto, N., Behr, B., Longaker, M. T. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells: Implications for tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (10), 3185-3197 (2010).
  12. Kaku, M., et al. Mesenchymal Stem Cell-Induced Cranial Suture-Like Gap in Rats. Plast Reconstr Surg. 127 (1), 69-77 (2011).
  13. Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), e18 243-256 (2021).
  14. Koons, G. L., Diba, M., Mikos, A. G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater. 5 (8), 584-603 (2020).
  15. Mardas, N., Kostopoulos, L., Karring, T. Bone and suture regeneration in calvarial defects by e-PTFE-membranes and demineralized bone matrix and the impact on calvarial growth: an experimental study in the rat. J Craniofac Surg. 13 (3), 453-462 (2002).
  16. Kostopoulos, L., Karring, T. Regeneration of the sagittal suture by GTR and its impact on growth of the cranial vault. J Craniofac Surg. 11 (6), 553-561 (2000).
  17. Mosaddad, S. A., Hussain, A., Tebyaniyan, H. Exploring the use of animal models in craniofacial regenerative medicine: A narrative review. Tissue Eng Part B Rev. , (2023).
  18. Tan, X., et al. PgC3Mg metal-organic cages functionalized hydrogels with enhanced bioactive and ROS scavenging capabilities for accelerated bone regeneration. J Mater Chem B. 10 (28), 5375-5387 (2022).
  19. Yazdanian, M., et al. Fabrication and properties of βTCP/Zeolite/Gelatin scaffold as developed scaffold in bone regeneration: in vitro and in vivo studies. Biocybern Biomed Eng. 40 (4), 1626-1637 (2020).
  20. Soufdoost, R. S., et al. In vitro and in vivo evaluation of novel Tadalafil/β-TCP/Collagen scaffold for bone regeneration: A rabbit critical-size calvarial defect study. Biocybern Biomed Eng. 39 (3), 789-796 (2019).
  21. Russell, W. P., Russell, M. R. Anatomy, head and neck, coronal suture. StatPearls. , (2022).
  22. Menon, S., et al. Skeletal stem and progenitor cells maintain cranial suture patency and prevent craniosynostosis. Nat Commun. 12 (1), 4640(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة