مقالة منهجية

نموذج فأر معدل لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة المتكررة التي تتضمن نافذة الجمجمة الرقيقة وقرع السوائل

DOI:

10.3791/66440

⸱

أبريل 19, 2024

 ,  ,  ,  , 
1College of Physical Education and Health Sciences, Zhejiang Normal University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول نموذجا معدلا للفأر لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة المتكررة (rmTBI) الناتجة عن طريق طريقة إصابة الرأس المغلقة (CHI). يتميز النهج بنافذة جمجمة رقيقة وقرع سائل لتقليل الالتهاب الذي يسببه عادة التعرض للسحايا ، إلى جانب تحسين قابلية التكاثر والدقة في نمذجة rmTBI في القوارض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة هي اضطراب عصبي غير متجانس للغاية سريريا. هناك حاجة ماسة إلى نماذج حيوانية لإصابات الدماغ الرضحية (TBI) قابلة للتكرار للغاية مع أمراض محددة جيدا لدراسة آليات علم الأمراض العصبية بعد إصابات الدماغ الرضية الخفيفة واختبار العلاجات. وقد ثبت أن تكرار العواقب الكاملة لإصابات الدماغ الرضية في النماذج الحيوانية يمثل تحديا. لذلك ، فإن توافر نماذج حيوانية متعددة من إصابات الدماغ الرضية ضروري لمراعاة الجوانب والشدة المتنوعة التي شوهدت في مرضى إصابات الدماغ الرضية. CHI هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا لتصنيع نماذج القوارض من rmTBI. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة عرضة للعديد من العوامل ، بما في ذلك طريقة التأثير المستخدمة ، وسمك وشكل عظم الجمجمة ، وتوقف التنفس أثناء ، ونوع دعم الرأس والشلل المستخدم. الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار مزيج من نافذة الجمجمة الرقيقة وطرق إصابة قرع السوائل (FPI) لإنتاج نموذج فأر دقيق ل rmTBI المرتبط ب CHI. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو تقليل العوامل التي يمكن أن تؤثر على دقة واتساق نمذجة CHI و FPI ، بما في ذلك سمك عظم الجمجمة والشكل ودعم الرأس. من خلال استخدام طريقة نافذة الجمجمة الرقيقة ، يتم تقليل الالتهاب المحتمل بسبب حج القحف و FPI ، مما يؤدي إلى تحسين نموذج الماوس الذي يكرر السمات السريرية التي لوحظت في المرضى الذين يعانون من إصابات الدماغ الرضية الخفيفة. تشير نتائج التحليل السلوكي والنسيجي باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) إلى أن rmTBI يمكن أن يؤدي إلى إصابة تراكمية تنتج تغييرات في كل من السلوك والتشكل الإجمالي للدماغ. بشكل عام ، يقدم rmTBI المعدل المرتبط ب CHI أداة مفيدة للباحثين لاستكشاف الآليات الأساسية التي تساهم في التغيرات الفيزيولوجية المرضية البؤرية والمنتشرة في rmTBI.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل إصابات الدماغ الرضية الخفيفة، بما في ذلك الارتجاج والارتجاج الفرعي، غالبية جميع حالات إصابات الدماغ الرضية (>80٪ من جميع إصابات الدماغ الرضية)1. عادة ما ينتج إصابات الدماغ الرضية الخفيفة عن السقوط وحوادث المرور وأعمال العنف والرياضات التي تتطلب الاحتكاك (مثل كرة القدم والملاكمة والهوكي) والقتال العسكري 2,3. يمكن أن يؤدي TBI الخفيف إلى أحداث بيولوجية عصبية تؤثر على الوظائف السلوكية العصبية طوال حياة المريض وتزيد من خطر الإصابة بالأمراض التنكسية العصبية4،5،6. توفر النماذج الحيوانية وسيلة فعالة ومضبوطة لدراسة إصابات الدماغ الرضية الخفيفة ، على أمل زيادة تعزيز تشخيص وعلاج إصابات الدماغ الرضية الخفيفة. تم تطوير نماذج مختلفة لإصابات الدماغ الرضية الخفيفة ، مثل التأثير القشري المتحكم فيه (CCI) ، وانخفاض الوزن (WD) ، وإصابة قرع السوائل (FPI) ، ونماذج TBIالانفجار 7,8. لا يوجد نموذج تجريبي واحد يمكن أن يحاكي التعقيد الكامل لعلم الأمراض الناجم عن إصابات الدماغ الرضية 9,10. يعد عدم تجانس هذه النماذج مفيدا لمعالجة السمات المتنوعة المرتبطة بمرضى إصابات الدماغ الرضية الخفيفة والتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية المقابلة. ومع ذلك ، فإن كل نموذج حيواني من إصابات الدماغ الرضية له حدوده3 ، مما يحد من معرفتنا الحالية فيما يتعلق بإصابات الدماغ الرضية الخفيفة الحيوانية وأهميتها السريرية.

يتم استخدام نماذج WD و CCI لتكرار الحالات السريرية مثل فقدان الأنسجة الدماغية ، والورم الدموي الحاد تحت الجافية ، والإصابة المحورية ، وارتجاج الدماغ ، وخلل الحاجز الدموي الدماغي ، وحتى الغيبوبة بعد TBI3،11،12. يتضمن نموذج WD إحداث تلف في الدماغ عن طريق ضرب الأم الجافية أو الجمجمة بأوزان تسقط بحرية. يمكن أن يؤدي تأثير جسم مرجح على جمجمة سليمة إلى تكرار الإصابات البؤرية / المنتشرة المختلطة. ومع ذلك ، ترتبط هذه الطريقة بضعف الدقة والتكرار في موقع الإصابة ، وإصابة الارتداد ، وارتفاع معدل الوفيات بسبب كسور الجمجمة3،11،12. يتضمن نموذج CCI تطبيق معدن يحركه الهواء للتأثير على الأم الجافية المكشوفة مباشرة. بالمقارنة مع طراز WD ، فإن طراز CCI أكثر دقة وقابلية للتكرار ، لكنه لا ينتج عنه إصابة منتشرة بسبب القطر الصغير للطرف المتأثر11. أثناء نمذجة FPI ، يتم إزاحة أنسجة المخ لفترة وجيزة وتشوهها عن طريق الإيقاع. يمكن أن يؤدي FPI إلى إصابة بؤرية / منتشرة مختلطة وتكرار النزيف داخل الجمجمة وتورم الدماغ وتلف المادة الرمادية التدريجي بعد إصابات الدماغ الرضية. ومع ذلك ، فإن FPI لديها معدل وفيات مرتفع بسبب تلف جذع الدماغ وانقطاع النفس المطول 3,12. يمكن أن يؤدي حج القحف المتضمن في نماذج WD و CCI و FPI التقليدية إلى كدمة قشرية ، وآفات نزفية ، وتلف الحاجز الدموي الدماغي ، وتسلل الخلايا المناعية ، وتنشيط الخلايا الدبقية ، ووقت النمذجة المطول ، والنتائج المميتة المحتملة 3,12.

يتميز TBI الخفيف بدرجة GCS (مقياس غلاسكو للغيبوبة ، GCS) في حدود 13 إلى 152. يمكن أن يكون TBI الخفيف إما بؤريا أو منتشرا ويرتبط بكل من الإصابات الحادة ، مثل انهيار التوازن الخلوي ، والسمية المثيرة ، ونضوب الجلوكوز ، وضعف الميتوكوندريا ، واضطراب تدفق الدم ، وتلف المحور العصبي ، وكذلك الإصابات تحت الحادة ، بما في ذلك تلف المحور العصبي ، والتهاب الأعصاب ، والتسمم 2,3. على الرغم من التقدم الكبير في تحديد الفيزيولوجيا المرضية المعقدة لإصابات الدماغ الرضية ، فإن الآليات الأساسية لإصابات الدماغ الرضية الخفيفة / إصابات الدماغ الرضية لا تزال بعيدة المنال وتتطلب مزيدا من التحقيق9. بالنظر إلى أن CHI هو النوع الأكثر شيوعا من TBI12 ، يقدم هذا البروتوكول نهجا جديدا لإنشاء نموذج ماوس يتم التحكم فيه بدقة أكبر من rmTBI باستخدام جهاز FPI معدل لأداء التأثير في نافذة الجمجمة الرقيقة13. من خلال تجنب الإصابات الناجمة عن حج القحف ، وسمك الجمجمة المتغير وعدم الدقة التي يسببها الشكل ، وإصابة الارتداد ، يهدف هذا النهج إلى التغلب على العيوب الرئيسية المرتبطة بنماذج WD و CCI و PPI. يعد تطبيق تأثير FPI على نافذة الجمجمة الرقيقة مناسبا لتقييم تلف الأوعية الدماغية بعد rmTBI ويساعد على تقليل معدلات الوفيات المرتفعة في بعض النماذج ، مما يؤدي إلى تشابه أقرب مع السمات السريرية لمرضى إصابات الدماغ الرضية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتضمنة في هذا البروتوكول بموجب موافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (جامعة تشجيانغ للمعلمين ، رقم التصريح ، dw2019005) وامتثالا ل REACH ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. يمكن العثور على المواصفات الفنية في جدول المواد.

1. إجراءات التعامل مع

  1. الفئران المنزلية في بيئة خاضعة للرقابة مع درجة حرارة 22-24 درجة مئوية ، والرطوبة تتراوح بين 40 ٪ -60 ٪ ، ودورة الضوء / الظلام 12 ساعة ، وتوفير الوصول إلى المياه وتشاو الماوس القياسية. لغرض هذه التجربة ، تم استخدام 25 من ذكور الفئران ICR (25-30 جم ، 8 أسابيع).
  2. قم بتخصيص الفئران عشوائيا إما في المجموعة الضابطة (n = 12) أو مجموعة rmTBI (n = 13). لمنع العدوان المحتمل من الفئران الوهمية تجاه الفئران التي خضعت ل rmTBI ، افصلها في أقفاص متميزة.
  3. إعطاء الفئران ما لا يقل عن 1 أسبوع للتأقلم مع بيئة قفصهم قبل البدء في التجربة. تضمن فترة التأقلم هذه أن تصبح الفئران على دراية بمحيطها وتقلل من الآثار المحتملة للتوتر أو القلق على الاستجابات الفسيولوجية أو السلوكية أثناء الدراسة.

2. إعداد جهاز TBI

  1. تصنيع نموذج rmTBI في الفئران باستخدام جهاز FPI معدل (انظر جدول المواد; الشكل 1 أ) 13. قبل استخدام جهاز FPI ، افحص بعناية جميع التوصيلات بحثا عن علامات التسرب أو التشقق ، مع إيلاء اهتمام خاص للتقاطعات بين الأسطوانة والأنبوب ، وبين الموصل ثلاثي الاتجاهات والأنبوب. لتحديد ضغوط التأثير بدقة ، تم تركيب محول ضغط إلى نقطة التأثير على جهاز إصابة قرع السوائل13.
  2. قم بإجراء فحص دقيق لجهاز FPI للتأكد من أن المكبس يتحرك بسلاسة داخل الأسطوانة وأنه يمكن إجراء التأثيرات بشكل فعال (الشكل 1 ب). تحقق من عدم وجود فقاعات هواء داخل النظام. إذا تم اكتشاف فقاعات هواء ، أضف الماء المقطر بعناية إلى النظام باستخدام حقنة سعة 50 مل واطرد فقاعات الهواء عن طريق دفع قضيب الأسطوانة بسرعة عبر موصل قريب من 3 اتجاهات و / أو من خلال المحقنة.
    ملاحظة: يتكون نظام FPI من الماء المقطر داخل الأسطوانة والأنابيب المتصلة. من الضروري معايرة الجهاز قبل التشغيل لضمان دقة النتائج وموثوقيتها.

3. إعداد الجمجمة الرقيقة

ملاحظة: لا ينبغي إجراء جراحة وإعداد الجمجمة الرقيقة في ضوء الفئران الأخرى. نافذة الجمجمة الرقيقة مفيدة لتقييم تلف الأوعية الدماغية بعد إجراء FPI.

  1. الالتزام بمتطلبات مركز من خلال توجيه المشغل التجريبي لارتداء رداء وقناع معقم أثناء جميع إجراءات التعامل مع.
  2. قم بتعقيم سطح طاولة المختبر وجهاز FPI وأنابيب التخدير ومساحة العداد المجاورة قبل بدء التجربة باستخدام رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪.
  3. وزن الفئران في كل من مجموعات وهمية و rmTBI قبل الجراحة ومقارنة أوزانهم مع تلك المسجلة 1 أسبوع قبل التجربة. استبعد من الدراسة أي فأر يظهر صحة سيئة مثل معطف الفرو الخشن أو الإسهال أو فقدان الوزن أو الخمول. بالإضافة إلى ذلك ، استبعد الفئران التي يقل وزنها عن 20 جراما لضمان قدرتها على تحمل التأثيرات المتكررة. هذه التدابير حاسمة في الحفاظ على رعاية وضمان نتائج تجريبية موثوقة.
  4. تخدير الفئران باستخدام 4٪ -5٪ إيزوفلوران (في أكسجين 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة) لمدة 3-4 دقائق في غرفة الحث. إدارة مادة تشحيم للعيون (انظر جدول المواد) لعيون للحفاظ على التشحيم طوال الجراحة. لتخفيف الألم، يتم تطبيق البوبرينورفين تحت الجلد (0.05 ملغ/كغ) عند نقطة المنتصف بين الأذنين قبل 20 دقيقة من التخدير وبعد ذلك كل 6 ساعات لمدة 24 ساعة. علاوة على ذلك، في نهاية التخدير، يتم تطبيق جرعة واحدة تحت الجلد من 5 ملغ/كغ كاربروفين لكل.
  5. تطهير الرأس بعد أن يفقد الماوس ردود الفعل تصحيح وسحب دواسة. تقليم الفراء على رأس الماوس باستخدام مقص جراحي واستخدام ماكينة حلاقة لإزالة الفراء المتبقي. تطهير فروة الرأس مع ثلاثة تطبيقات متسلسلة من الكلورهيكسيدين 2 ٪ ، تتخللها 75 ٪ الدعك الإيثانول.
  6. ضع وسادة جراحية معقمة يمكن التخلص منها تحت والمنطقة المحيطة به لضمان النظافة المناسبة. قم بعمل شق 1.5 سم باستخدام مقص جراحي صغير ناعم على طول خط الوسط لفروة رأس الفأر لكشف موقع الجراحة بالكامل (الشكل 2 أ).
  7. قم بتأمين الماوس باستخدام قضبان الأذن غير الطرفية في إطار تجسيمي تقليدي (انظر جدول المواد). اضبط موضع رأس الماوس في إطار مجسم على مستوى مسطح أو زاوية مائلة طفيفة وفقا للمنطقة المستهدفة المحددة التي سيتم فحصها. نظف الفراء من منطقة الجراحة لتجنب الالتهاب لاحقا.
  8. حافظ على درجة حرارة جسم الماوس عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تسخين تقليدية متساوية الحرارة (انظر جدول المواد).
  9. أثناء عملية تركيب محور الجراحة والتأثير (أنثى Luer Lock) ، حافظ على تخدير الماوس (دون استجابة لقرصة إصبع القدم أو الذيل) باستخدام مخروط الأنف الذي يوفر تركيزا مستمرا بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران ، يتم تنظيمه بواسطة مبخر معاير.
  10. نظف المنطقة الجراحية حول نافذة الجمجمة الرقيقة بعناية باستخدام قطعة قطن معقمة مبللة بالمحلول الملحي.
  11. قم بإنشاء نافذة جمجمة رفيعة ، قطرها حوالي 2.5 مم وسمكها 20 ميكرومتر ، في القشرة الحركية الأمامية اليمنى باستخدام مثقاب دقيق مسطح الرأس (انظر جدول المواد ، الشكل 2 ب) وشفرة جراحية مجهرية. حدد موقع الجراحة عند 1.5 مم أمام البريغما و 1.3-2.0 مم جانبي لخط الوسط (الشكل 2 ج).
    1. لمنع المثقاب الصغير من اختراق الجمجمة أثناء إنشاء نافذة الجمجمة الرقيقة ، قم بترطيب الجمجمة بشكل متقطع بالمحلول الملحي أثناء الطحن باستخدام المثقاب الصغير.
    2. تأكد من سمك الجمجمة عن طريق فحص الجمجمة الرقيقة برفق باستخدام الطرف المسطح لإبرة حقنة دقيقة وتقييم نعومتها. تقدير وضوح الأوعية الدقيقة القشرية المكشوفة بصريا لتحديد سمك الجمجمة.
    3. للتحقق من سمك الجمجمة ، ضع محلول ملحي معقم على المنطقة الرقيقة وافحصه بصريا باستخدام مجهر تشريح تقليدي (انظر جدول المواد). يمكن أن تساعد هذه التقنية في ضمان ترقق الجمجمة بشكل كاف.
      ملاحظة: قم بتليين عين الماوس طوال فترة تحضير الجمجمة الرقيقة بالكامل وإجراء نمذجة rmTBI لمنع الجفاف. إن ترقق الجمجمة إلى أقل من 15 ميكرومتر ينطوي على خطر الإصابة بصدمة قشرية خفيفة قد تؤدي إلى التهاب قشري خفيف14.
  12. قم بتوصيل قفل Luer الأنثوي المعدل (قطره الداخلي 2.2 مم ، تم إنشاؤه من محور إبرة 19G ، كما هو موضح في الشكل 2D) بموقع الجمجمة الرقيق. قم بتأمين قفل Luer بالغراء وأسمنت الأسنان (الشكل 2E).
    ملاحظة: عند استخدام الغراء لتثبيت قفل Luer الأنثوي في المنطقة المحيطة بنافذة الجمجمة الرقيقة ، من الضروري تجفيف منطقة الجمجمة تماما ومنع المادة اللاصقة من دخول النافذة نفسها. يمكن أن يقلل اللاصق داخل النافذة بشكل كبير من قوة تأثير FPI.

4. إجراء نمذجة rmTBI المرتبط ب CHI

  1. أدخل rmTBI باستخدام طريقة قرع السائل الجانبي مع جهاز FPI معدل كما هو موضح سابقا13,15.
  2. بعد الانتهاء من نافذة الجمجمة الرقيقة وإجراءات محور التأثير ، انقل الماوس من جهاز التجسيم إلى منصة الصدمة.
  3. بالنظر إلى الآثار المحتملة للتخدير على وقت منعكس تصحيح وشدة الإصابة بعد الإيقاع9،16 ، راقب عمق التخدير من خلال تقييم ردود الفعل المنسحبة والجفنية (الشكل 2F).
  4. قم بتوصيل قفل Luer الأنثوي ، الذي تم لصقه على نافذة الجمجمة الرقيقة ، بقفل Luer الذكري في نهاية أنبوب جهاز FPI (الشكل 2G).
    ملاحظة: في نمذجة rmTBI ، تم إطالة التخدير الناجم عن الإيزوفلوران في الفئران بسبب تحريض انقطاع النفس وفقدان الوعي عن طريق الإيقاع.
  5. قدم اثنين من إصابات الدماغ الرضية الخفيفة (فاصل 48 ساعة) مع الجهاز المعدل. قم بتطبيق تأثير FPI الأول مباشرة بعد الانتهاء من جراحة نافذة الجمجمة الرقيقة وتثبيت Luer Lock. قم بإدارة تأثير FPI فقط بمجرد أن يظهر الماوس عودة منعكس الانسحاب إلى قرصة مخلب في كل مناسبة (الشكل 2H). يمكن أن يؤدي تطبيق تأثير FPI في الفئران المخدرة بشدة إلى انقطاع النفس والموت لفترة طويلة.
    1. لتطبيق تأثير FPI ، ارفع البندول إلى الدرجة المحددة على طول المنقلة على الجهاز وحرر البندول باستخدام برنامج التحكم13,15. يجب أن يحقق التأثير شدة قرع تبلغ 2.0 ± 0.1 ضغط جوي ، باتباع البروتوكولات المعمول بها المستخدمة في دراسات القوارض10،17،18. استبعاد من الاختبارات الإضافية إذا لم يسجل التأثير بين 1.9-2.1 ضغط جوي أو إذا حدث كسر في الجمجمة أثناء FPI.
    2. بالنسبة للفئران الوهمية ، قم بتثبيتها على الجهاز ، لكن لا تحقق التأثير.
  6. بعد الاصطدام ، افصل اتصال Luer Lock على الفور ، وانقل الفئران إلى وسادة تسخين متساوية الحرارة للتعافي. بعد أن يستعيد الفأر اليقظة والوعي ، أعده إلى قفصه المنزلي دون إزالة قفل Luer الأنثوي. إدارة تأثير FPI الثاني ، بنفس الطريقة ، بعد 48 ساعة.
  7. بعد rmTBI ، قم بإزالة قفل Luer الأنثوي والأسمنت السني بعناية. خياطة فروة الرأس باستخدام لاصق الأنسجة واستخدام ملقط مسطح لقرص فروة الرأس لتسهيل عملية اللصق (انظر جدول المواد; الشكل 2I).
  8. لمنع الالتهاب والعدوى وتخفيف الألم وعدم الراحة بعد الجراحة ، ضع مزيجا من الإريثروميسين ومرهم ديكلوفيناك الصوديوم بنسبة 1: 1 (انظر جدول المواد) على الجرح. نقل الفئران إلى وسادة التدفئة متساوي الحرارة للتعافي.
  9. سجل مدة منعكس التصحيح ، والذي يبدأ عند إزالة الماوس من الجهاز التجسيمي ووضعه بشكل جانبي على منصة التصادم ل FPI ويستمر حتى يتمكن الماوس من الوقوف في وضع مستقيم بشكل مستقل.
  10. بعد أن يستعيد الفأر اليقظة والوعي ، أعده إلى قفصه المنزلي. عادة ما تكون الفئران واعية تماما وقادرة على المشي في غضون 1.5 ساعة بعد الإصابة.
  11. في الأيام التالية لنمذجة إصابات الدماغ الرضية ، راقب الفئران بحثا عن علامات مختلفة بما في ذلك أنماط التنفس ، ووجود مخاط حول الأنف والفم ، واحمرار أو تورم أو إفرازات أو إعادة فتح منطقة الجرح. استبعاد من الدراسة مع واحد أو أكثر من الأعراض غير الطبيعية المذكورة أعلاه.
    ملاحظة: يسمح الحقن المجهري المسبق ل AAV-GCaMP6s بمراقبة التوازن العصبي الأساسي Ca2 + والإثارة في القشرة المصابة من خلال نافذة الجمجمة الرقيقة باستخدام المجهر الماسح بالليزر ثنائي الفوتون15.

5. اختبار متاهة موريس المائية (MWM)

ملاحظة: MWM (انظر جدول المواد) هي طريقة معترف بها على نطاق واسع لتقييم التعلم المكاني وعجز الذاكرة في الفئران بعد إصابات الدماغ الرضية.

  1. قم بإجراء اختبار MWM بدءا من 7 أيام بعد الإصابة (DPI). يبلغ قطر المسبح الدائري ل MWM 120 سم وارتفاعه 50 سم ، مع الحفاظ على درجة حرارة الماء عند 25 درجة مئوية. افصل البركة الدائرية إلى أربعة أرباع ، مع منصة الهروب ، وهي منصة مستديرة يبلغ قطرها 6 سم وارتفاعها 30 سم ، مغمورة 1 سم تحت سطح الماء في الربع الشمالي الشرقي.
  2. ضع كاميرا مباشرة فوق المسبح الدائري لتسجيل مسار حركة الفئران. ضع علامة على الفئران بشريط أسود على ظهورها لتسهيل التعرف عليها بواسطة برنامج الحصول على الصور ولتسجيل البيانات ، بما في ذلك زمن الوصول ومسافة السباحة ومسار الحركة.
  3. ضع الفئران في الماء ، في مواجهة الجدار الداخلي لكل من الأرباع الأربعة ، مرة واحدة لكل ربع. بمجرد أن تجد الفئران المنصة ، اسمح لها بالراحة هناك لمدة 10 ثوان. إذا فشل الماوس في العثور على النظام الأساسي في غضون 60 ثانية ، فاطلب من المشغل توجيه الماوس إلى النظام الأساسي ، واتركه يستريح على المنصة لمدة 10 ثوان ، ثم أعد الماوس إلى قفصه المنزلي للراحة.
  4. كرر لكل ماوس تجربة الاستحواذ 4x يوميا. بعد تجارب الاستحواذ ، في 12 نقطة في البوصة ، قم بإجراء تجربة مسبار مكاني لمدة 60 ثانية وسجل عدد المرات التي عبرت فيها الفئران منطقة المنصة الأصلية ومدة بقاء الماوس في الربع حيث توجد المنصة.
  5. بعد كل تجربة ، جفف الفئران بسرعة بمنشفة أو ضعها تحت مصباح تدفئة للحفاظ على درجة حرارة أجسامها ومنع انخفاض حرارة الجسم أثناء تجربة الاستحواذ لمدة 60 ثانية من DPI 7 إلى DPI 11.
  6. بعد الانتهاء من الإجراءات التجريبية الموضحة أعلاه ، قم بتخدير الفئران باستخدام بنتوباربيتال (45 مجم / كجم ، أي p.) عند 13 نقطة في البوصة. محلول ملحي متساوي التوتر Perfuse transcardially ، يليه التروية مع 4 ٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (درجة الحموضة 7.2). استرجع أدمغة تلطيخ اعتلال الدماغ الكبدي التقليدي لتقييم التغيرات الجسيمة في مورفولوجيا القشرية والحصين. يمكن العثور على وصف مفصل لبروتوكول تلطيخ HE في المنشورات السابقة13،15.
  7. بعد الانتهاء من جميع التجارب ، القتل الرحيم للفأر عن طريق حقن جرعة زائدة من بنتوباربيتال (≥100 مجم / كجم ، i.p.) إذا لم تكن هناك حاجة إلى عينات فئران. قبل حصاد الأنسجة أو التخلص من الذبيحة ، راقب الماوس حتى لا يكون هناك نبضات قلب لمدة 60 ثانية على الأقل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة طريقة لتحفيز rmTBI من خلال نافذة الجمجمة الرقيقة ، والتي تقدم حلا لإصابة الدماغ الناتجة عن تحضير حج القحف أثناء نمذجة TBI الإيقاعية التقليدية. من خلال استخدام إجراء قرع السوائل المعدل هذا مع الجهاز المعدل ، تم تحقيق دقة محسنة وقابلية استنساخ تأثير FPI13. يتميز جهاز التصادم المعدل بتعدد الاستخدامات لاستخدامه في كل من نمذجة CHI و FPI ، مع أو بدون حج القحف في الجمجمة. علاوة على ذلك ، يتم تعديل شدة الإصابة عن طريق ضبط معلمات الإصابة ، مثل زاوية سقوط بندول التصادم ، أو عن طريق إضافة وسادات رغوية إضافية مغلقة الخلية من أسيتات الإيثيلين - الفينيل ذات صلابة متفاوتة إلى اللوحة الطرفية لعمود المكبس.

يوفر نموذج rmTBI المعدل مزايا كبيرة ، مثل إنتاج علم الأمراض البؤري والمنتشر دون تعريض الجافية القشرية ، مما يقلل من الالتهاب الناتج عن التعرض السحائي و / أو FPI المباشر على الحمة. علاوة على ذلك ، يقلل هذا النموذج من الاختلافات في سمك عظم الجمجمة وشكلها لتحقيق نتائج إصابة موثوقة. لذلك ، فإن نموذج rmTBI المعدل فعال وموثوق به في محاكاة العجز العصبي المرضي والسلوكي المرتبط بأعراض ما بعد الارتجاج (PCS) ذات الصلة سريريا عبر درجات الإصابة المختلفة. على وجه الخصوص ، هذا النموذج مفيد للتحقيق في الآليات المرضية TBI التي تعتمد على دقة نماذج إصابات الدماغ الرضية الحيوانية وقابليتها للتكاثر ، خاصة للتحقيق في الآليات الخفيفة المتعلقة بإصابات الدماغ الرضية.

سمح الفرع الجانبي الأمامي للشريان الدماغي الأوسط للفأر والوريد الأنفيالذيلي 19 ، الواقع أسفل الجمجمة الرقيقة ، بتصور واضح تحت الكاميرا. بعد إيقاعين rmTBI ، كل منهما عند ضغط يبلغ حوالي 2.0 ضغط جوي ، أظهرت جميع الفئران أورما دموية تحت الجافية عند 0 نقطة في البوصة. على الرغم من أن سلامة الجمجمة الرقيقة لا يبدو أنها معرضة للخطر. ومع ذلك ، لوحظ انخفاض في عدد الأوعية الدقيقة جنبا إلى جنب مع التغيرات في مورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة (الشكل 2H) ، كما ورد سابقا15. بحلول 2 نقطة في البوصة ، تم حل الأورام الدموية إلى حد كبير. تنتج الوفيات في المقام الأول عن التأثير أثناء خضوع الفأر للتخدير العميق ، مما قد يطيل انقطاع النفس بشكل كبير. يمكن أن يؤدي التقييم المنتظم لعمق التخدير قبل التأثير من خلال ردود الفعل الجفنية والانسحاب إلى تقليل الوفيات بشكل كبير. تشمل العوامل الإضافية التي يمكن أن تؤثر على معدلات الوفيات بعد قرع السوائل إجهاد الفأر وصلابة الجمجمة والجنس والعمر. في دراسة سابقة باستخدام نفس بروتوكول rmTBI ، مات فأر C57BL / 6J15. في هذا البروتوكول ، تم استخدام ذكور الفئران ICR فقط لإدخال الإجراءات بأكملها.

أظهرت كل من الدراسات البشرية والحيوانية أنه حتى تأثيرات الرأس تحت الارتجاج المتكررة يمكن أن تسبب إصابات واسعة النطاق للمادة البيضاءالمجهرية 20،21،22 ، والتي ترتبط بأداء معرفي أسوأ21،22. في 7-12 نقطة في البوصة ، يمكن أن ينتج rmTBI إعاقات في التعلم المكاني والذاكرة ، والتي تم فحصها باستخدام نموذج MWM. ويبين الشكل 4 النتائج التي تم الحصول عليها من هذا التقييم.

أظهر تحليل تجربة الاستحواذ الأخيرة في MWM زيادة كبيرة (p< 0.05) في زمن الوصول بواسطة الفئران rmTBI للوصول إلى المنصة المغمورة ، مقارنة بالمجموعة الضابطة. في تجربة المسبار ، أظهر تحليل النسبة المئوية للوقت المستغرق في ربع المنصة الأصلي انخفاضا كبيرا (p<0.01) في مجموعة rmTBI بالنسبة للمجموعة الضابطة ، مما يشير إلى انخفاض في التعلم المرجعي المكاني وقدرات الذاكرة في الفئران مع rmTBI.

تم استخدام الطريقة الموصوفة هنا في منشور سابق15 باستخدام الفئران C57BL / 6J. وبصرف النظر عن MWM ، تم إجراء ثلاثة تحليلات إضافية على النحو المبين أدناه.

تم استخدام OFT لتقييم قدرات الحركة والاستكشاف من خلال قياس متوسط سرعة السفر والمسافة الإجمالية المقطوعة والنسبة المئوية للمسافة المقطوعة في المناطق الوسطى. قم بإجراء اختبار المجال المفتوح (OFT) عند 6 نقطة في البوصة لتقييم الحركة والاستكشاف والقلق لدى الفئران. جهاز الاختبار بقياس 40 × 40 × 40 سم ، والذي تم تقسيمه إلى 16 منطقة (قياس كل منها 18 × 18 سم). تم وضع الماوس في وسط الجهاز وسمح له بالاستكشاف بحرية لمدة 5 دقائق. تم تسجيل المسافة المقطوعة في المركز 4 مناطق ، والمسافة الإجمالية المقطوعة ، ومتوسط سرعة الحركة ، والوقت المستغرق في المناطق الحدودية. تم تقييم مستويات القلق بناء على النسبة المئوية للمسافة المقطوعة في المناطق المركزية والوقت الذي تقضيه القوارض في المناطق الحدودية خلال فترة مراقبة مدتها 5 دقائق. عند 6 نقطة في البوصة ، قد لا يكون ل rmTBI تأثير كبير على قدرات قاطرة الفئران العامة ، ويمكن أن يسبب قلقا كبيرا ويغير السلوك الاستكشافي ، كما هو موضح في الشكل 415. علاوة على ذلك ، فإن نموذج rmTBI المعدل يؤدي إلى إصابات محورية منتشرة ، والتي يمكن تقييمها من خلال اختبارات سلوكية إضافية ، مثل اختبار القدرة المعرفية الموصوف في هذا البروتوكول.

وقد تبين أن RmTBI يضعف العمل المكاني والذاكرة المرجعية في الفئران ، كما هو موضح في الشكل 515. تم تقييم هذه الوظائف المعرفية باستخدام اختبار Y-maze. تم إجراء الاختبار عند 8 نقطة في البوصة لقياس عجز الذاكرة العاملة على المدى القصير في الفئران. لسلوك التناوب التلقائي: تم استخدام جهاز متاهة Y من الأكريليك (ارتفاع 20 سم وطول 50 سم وعرض 10 سم في الأسفل). بعد وضع الماوس في وسط الجهاز والسماح له بالاستكشاف لمدة 8 دقائق ، تم تسجيل إدخالات الذراع. يعرف سلوك التناوب التلقائي بأنه الدخول المتتالي للفأر إلى الأذرع الثلاثة على مجموعات ثلاثية. احسب معدل التناوب التلقائي (٪) على النحو التالي (مجموعات ثلاثية متتالية / إجمالي عدد إدخالات الذراع ناقص 2) × 100. بالنسبة للذاكرة المرجعية المكانية ، أثناء التدريب لمدة 8 دقائق ، أغلق ذراعا واحدا من جهاز Y-maze بشكل عشوائي. بعد 1 ساعة بعد التعرض الأولي ، يتم إعادة إدخال الماوس في المتاهة مع فتح جميع الأذرع الثلاثة والسماح له بالاستكشاف بحرية لمدة 3 دقائق. يتم تسجيل الوقت المستغرق في استكشاف الذراع الجديدة مقابل الذراعين الآخرين. احسب مؤشر التفضيل كوقت يقضيه في ذراع الرواية مقابل الوقت المستغرق في الأذرع الثلاثة.

علاوة على ذلك ، نقترح تقييم الآفات الهيكلية الإجمالية في الدماغ باستخدام تلطيخ بسيط باعتلال الدماغ الكبدي (الشكل 6)15 عند الانتهاء من جميع الاختبارات السلوكية. استخدم المنطقة القشرية المقسمة إكليليا من 1 مم من الأمام إلى موقع الآفة إلى الهامش الخلفي للآفة ، ومنطقة الحصين مقطعة إكليليا في المنطقة النموذجية على شكل هلال (Bregma: -1.7 إلى -2.2 مم). عد الخلايا العصبية في كل شريحة من ستة حقول عشوائية باستخدام شبكة بصرية (تكبير 400x) ومتوسط عدد الخلايا العصبية يوفر الكثافة الرقمية لكل مجال بصري (الكثافة الرقمية). تم العثور على مناطق الدماغ المتضررة من rmTBI لإظهار درجات متفاوتة من إصابات الخلايا العصبية15. على وجه التحديد ، أظهرت القشرة الحركية مدى أكثر قوة وتنوعا من هذه الإصابات من الحصين. أظهر تلطيخ HE تحولا كبيرا نحو مورفولوجيا pyknotic من الخلايا العصبية الطبيعية (الشكل 6A ، B ، E ، F). علاوة على ذلك ، لوحظ أن المصفوفة خارج الخلية أصبحت مرتخية على وجه التحديد في منطقة الآفة (الشكل 6F). إلى جانب المناطق المرصودة ذات المصفوفة المخففة ، أظهرت الفئران rmTBI أيضا زيادة كبيرة في تلطيخ فرط اللون ، الذي ينظر إليه على أنه لون أحمر أغمق ، في عدد كبير من الخلايا العصبية تحت الحبيبية في التلفيف المسنن وبعض الخلايا العصبية القشرية و CA1. ومن المثير للاهتمام أن أنماط التلوين هذه لم تقدم أي علامات مصاحبة للانكماش السيتوبلازمي أو نواة pyknotic (الشكل 6C ، D ، G ، H ، K) 15. تم تفصيل طرق التلوين السلوكية (باستثناء اختبار WMM) و HE المذكورة أعلاه في منشور حديث ، والذي قدم نموذج rmTBI المعدل15.

figure-results-1
الشكل 1: جهاز FPI المعدل ولقطة شاشة البرنامج. (أ) أداة FPI المعدلة. (ب) تعرض لقطة الشاشة الشكل الموجي لضغط FPI والقياس التلقائي وتصدير معلمات ضغط التأثير في الوقت الفعلي مثل وقت الارتفاع ووقت السقوط ومدة نصف العرض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: نموذج الفأر المعدل ل rmTBI في الفئران ICR. (أ) يتم إجراء شق في خط الوسط لكشف المنطقة الجراحية. (ب) صنعت نافذة جمجمة رقيقة على القشرة الحركية. يتم استخدام وضوح الأوعية الدقيقة القشرية المكشوفة لتحديد سمك الجمجمة. (ج) يمكن أيضا التحقق من سمك الجمجمة عن طريق فحص الجمجمة الرقيقة برفق باستخدام الطرف المسطح لإبرة حقنة دقيقة وتقييم نعومتها. (د) لصقت أنثى Luer Lock بنافذة الجمجمة الرقيقة. (ه) تم تأمين قفل Luer الأنثوي المرفق عن طريق وضع الأسمنت السني. (F) تمت مراقبة عمق التخدير عن طريق فحص منعكسي انسحاب الجفن والمخلب. (ز) حدث تأثير FPI بعد عودة منعكس الانسحاب إلى قرصة مخلب. (H) صورة ما بعد rmTBI لنافذة الجمجمة الرقيقة عند 0 نقطة في البوصة. (ط) تم خياطة فروة الرأس بمادة لاصقة منديلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: آثار rmTBI على التعلم المرجعي المكاني والذاكرة في الفئران ICR. (أ) تم تسجيل تتبع الملاحة للفئران خلال تجربة الاستحواذ الأخيرة عند 11 نقطة في البوصة ، (ب) مسار المسبار المكاني في تجربة المسبار المسجل عند 12 نقطة في البوصة ، و (ج) وقت الهروب الذي استغرقته الفئران لتحديد موقع المنصة خلال تجربة الاستحواذ الأخيرة. كشفت النتائج أن مجموعة rmTBI استغرقت وقتا أطول بكثير للوصول إلى المنصة المخفية من المجموعة الضابطة (p<0.05). (د) كانت النسبة المئوية للوقت الذي قضته الفئران في ربع المنصة الأصلي بالنسبة إلى إجمالي وقت الملاحة أثناء تجربة المسبار أقل بكثير في مجموعة rmTBI منها في المجموعة الضابطة (p<0.01). ن = 8. * p < 0.05 ، ** p < 0.01 مقابل التحكم بواسطة اختبار t غير المزاوج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: آثار rmTBI على الحركة والاستكشاف والقلق في الفئران C57BL / 6J. (أ) آثار تمثيلية للتحكم وحركة الفئران rmTBI خلال 5 دقائق OFT. (ب-ه) تظهر البيانات الملخصة المسافة المقطوعة في المناطق المركزية ، وإجمالي المسافة المقطوعة ، ومتوسط سرعة السفر والوقت المستغرق في المناطق المحيطة ، على التوالي. التحكم ، ن = 13 ؛ rmTBI ، ن = 12. ص<. 01 مقابل التحكم عن طريق اختبار t غير المقترن. تم تعديل هذا الرقم من15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تأثيرات rmTBI على العمل المكاني والذاكرة المرجعية في الفئران C57BL / 6J. (أ، ب) آثار تمثيلية للتحكم وحركة الفئران rmTBI أثناء العمل المكاني وتقييمات الذاكرة المرجعية في متاهة Y. اختبار التناوب التلقائي Y maze هو طريقة شائعة الاستخدام لتقييم الذاكرة قصيرة المدى في نماذج القوارض15. (ج) ملخص لمعدلات التناوب التلقائي للتحكم وفئران rmTBI أثناء تقييم العمل المكاني. تفضل القوارض عادة استكشاف ذراع جديد من المتاهة بدلا من إعادة النظر في ذراع استكشفته بالفعل. يتم حساب مؤشر التفضيل بناء على الوقت الذي تقضيه القوارض في الذراع الجديدة مقارنة بالوقت الذي يقضيه في جميع الأذرع الثلاثة ، ثم يتم تحليل هذا المؤشر. (د) ملخص مؤشر التفضيل لفئران التحكم و rmTBI أثناء تقييم العمل المكاني. التحكم ، ن = 13 ؛ rmTBI ، ن = 12. ص<. 01 مقابل التحكم عن طريق اختبار t غير المقترن. تم تعديل هذا الرقم من15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: مقارنة تلطيخ اعتلال الدماغ الكبدي للقشرة الحركية المصابة المماثلة والمنطقة الفرعية للتلفيف المسنن الحصين بين السيطرة و rmTBI في الفئران C57BL / 6J. (أ، ب) القشرة الحركية الطبيعية. و (C، D) منطقة الحصين من الفئران الضابطة في تكبيرات مختلفة. (ه، واو) القشرة الحركية المصابة ومناطق الحصين (G ، H) للفئران rmTBI. قد تتأثر الخلايا العصبية المفرطة اللون في القشرة و CA1 بشكل طفيف إما بالتحضير للجراحة أو rmTBI المستمر. ومع ذلك ، لوحظت الخلايا العصبية hypochromic (ربما إصابة متوسطة) و pyknotic (الخلايا العصبية موت الخلايا المبرمج) في القشرة الحركية للفئران RMTBI بالمقارنة مع الخلايا العصبية الطبيعية في الفئران السيطرة. تضمنت ميزات موت الخلايا المبرمج العصبية هذه انكماش السيتوبلازم العصبي والنواة ، مصحوبا بفراغ واضح. والجدير بالذكر أن الخط الأبيض الفاصل في (E) يمثل الحد الفاصل بين الآفة والأنسجة المحيطة. بالإضافة إلى ذلك ، ربما تشير الخلايا العصبية شديدة اللون في المنطقة الفرعية DG (H) إلى الخلايا العصبية الحبيبية غير الناضجة والناضجة التي تم إنشاؤها حديثا. توضح الرسوم البيانية الشريطية أدناه توزيع الخلايا العصبية الطبيعية والمتأثرة ب rmTBI في القشرة الحركية (I) والحصين (J) CA1 و (K) DG المناطق. التحكم ، ن = 13 ؛ rmTBI ، ن = 12 ، ***p <. 001 مقابل التحكم عن طريق اختبار t غير المقترن. تم تعديل هذا الرقم من15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشير TBI إلى نوعين أساسيين ، مغلق ومخترق ، حيث يتميز الأخير باضطراب في الجمجمة والأم الجافية. تشير البيانات السريرية إلى أن CHIs أكثر انتشارا من الإصابات المخترقة 1,2. بعد إصابات الدماغ الرضية الخفيفة ، يعاني معظم المرضى من أعراض متلازمة ما بعد الارتجاج التي عادة ما يتم حلها في فترة زمنية قصيرة ، وهناك جدل حول نسبة المرضى الذين تتطور متلازمة ما بعد الارتجاج إلى عقابيل طويلة الأجل23,24. ونتيجة لذلك ، حول الباحثون تركيزهم إلى نماذج CHI المتكررة لفهم الآثار التراكمية للارتجاجات المتعددة25 بشكل أفضل ، والتي تحدث عادة في حالات السقوط وحوادث المرور والرياضات التي تتطلب الاحتكاك الجسدي. قد تؤدي هذه التأثيرات المتكررة إلى آثار أكثر حدة وطويلة الأجل26,27. باستخدام نماذج CHI المتكررة ، يمكن للباحثين استكشاف الآثار المضافة أو التآزرية المحتملة للارتجاجات المتعددة واكتساب فهم أفضل للآليات الأساسية التي تساهم في PCS. قد تسهل هذه النماذج تطوير التدخلات العلاجية المستهدفة للتخفيف من العواقب طويلة الأجل لتأثيرات الرأس المتكررة.

على الرغم من أن بعض نماذج CHI تحاول محاكاة كل من المفردة البؤرية و rmTBI من خلال دمج كل من القوى الخطية والدورانية ، إلا أن هذه النماذج يمكن أن تؤدي إلى إصابة ارتدادية وعدم دقة في شدة الإصابة بسبب عوامل مثل كسر الجمجمة ، ومورفولوجيا الجمجمة وسمكها ، وانقطاع النفس الحيواني الممتد10 ، والتباين في معلمات الإدخال الميكانيكية ، خاصة عند دمج حركة الرأس الدورانية9. تستخدم طرق التأثير وإنقاص الوزن التي يتم التحكم فيها بواسطة المكبس بشكل شائع للحث على rmTBI في النماذج الحيوانية ل CHI25. يسمح التأثير الذي يتم التحكم فيه بواسطة المكبس بالإعداد الدقيق والقابل للتعديل لمعلمات التأثير من خلال استخدام أجهزة التصادم الكهرومغناطيسية أو الهوائية ، مما يتيح إمكانية التكرار عالية التأثير. ومع ذلك ، فإن استخدام التأثير الذي يتم التحكم فيه بواسطة المكبس ، سواء على القشرة المكشوفة كما هو الحال في CCI أو على الجمجمة المغلقة ، لا يزال يتطلب تجميدا صارما لرأس في إطار مجسم أثناء الاصطدام. على العكس من ذلك ، تتطلب طرق إنقاص الوزن مواد بسيطة وفعالة من حيث التكلفة يسهل إعدادها ، ولكن المفاضلة هي تباين كبير إلى حد ما في شدة الإصابة25.

عادة ما يؤدي نموذج FPI إلى إصابات بؤرية ومنتشرة مختلطة ، مما يسمح بتصنيع إصابات الدماغ الرضية بدرجات متفاوتة من الشدة. على الرغم من مزاياه ، فإن نموذج FPI له أيضا قيود محتملة. مثل نموذج CCI ، لا يزال FPI يتطلب حج القحف ، وهو إجراء جراحي قد يؤدي إلى التهاب في أنسجة المخ17. وعلاوة على ذلك، فإنه حتى مؤشر FPI المعتدل كثيرا ما يخترق الجافية على أعماق متفاوتة، مما قد يؤدي إلى حدوث ارتباك في تفسير البيانات. وبالتالي ، فإن نماذج CCI و FPI لها قيود في تكرار السمات السريرية التي لوحظت في مرضى إصابات الدماغ الرضيةالخفيفة 9. ومن ثم ، نقدم بروتوكولا يجمع بين نافذة الجمجمة الرقيقة وطرق FPI ، والتي يمكن استخدامها لإنتاج نموذج ماوس أكثر دقة ل rmTBI المرتبط ب CHI. الهدف من هذا البروتوكول هو أن يعكس عن كثب السمات السريرية لمرضى إصابات الدماغ الرضية الخفيفة. سيكون النموذج القابل للتكرار بدرجة كبيرة أداة لا تقدر بثمن للتحقيق في الآليات الكامنة وراء الفيزيولوجيا المرضية لإصابات الدماغ الرضية الخفيفة وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة.

تتوافق نتائج بحثنا حول rmTBI مع المنشورات السابقة التي استخدمت نوافذ الجمجمة الرقيقة لتحقيقات إصابات الدماغ الرضيةالخفيفة 28,29. على سبيل المثال ، أنشأ Ren et al. نافذة جمجمة رقيقة بسمك حوالي 30 ميكرومتر في قشرة الارتباط الجداري الأيسر ، مما يؤدي إلى إصابات الدماغ الرضية الخفيفة عن طريق الضغط برفق على النافذة باستخدام نهاية حادة بقطر 1 مم من أداة تجسيمية جراحية29. أظهرت دراستهم توسعا ملحوظا في موت الخلايا وتعبير الأنواع المؤكسدة التفاعلية (ROS) في القشرةالمصابة 29. للتحقيق في rmTBI ، قام Nguyen et al. بتطبيق ثلاثة CCIs مع طرف تصادم معدل (طرف سيليكون دائري قطره 3 مم بسمك 1.5 مم) على نافذة جمجمة رقيقة للفأر (سمك 20-40 ميكرومتر) في قشرة الارتباط الجداري28. لحماية والحفاظ على شفافية منطقة الجمجمة الرقيقة للتصوير على المدى الطويل ، قاموا بتغطية نافذة الجمجمة الرقيقة بطبقة رقيقة من غراء cyanoacrylate. تم إجراء CCIs الثلاثة مرة واحدة في الأسبوع لمدة 3 أسابيع ، مع معلمات تأثير تبلغ 4 م / ث في السرعة و 2 مم في العمق. نتيجة ل CCIs الثلاثة ، أظهرت الفئران داء نجمي واضح وتنشيط الخلايا الدبقيةالصغيرة 28. بالنظر إلى أن استخدام نافذة الجمجمة الرقيقة كنموذج لإصابات الدماغ الرضية الخفيفة / rmTBI حديث نسبيا ، يلزم إجراء مزيد من البحث لفحص العلاقة بين شدة / تطور الإصابة وتقنيات التأثير المختلفة. على سبيل المثال ، في دراسة سابقة ، تمكنا من ملاحظة تغييرات واضحة في مورفولوجيا الخلية بعد اثنين من FPIs التي تم إعطاؤها بفاصل يومي15. وفي الوقت نفسه ، في دراسات أخرى ، أدى ضغط لطيف واحد على نافذة الجمجمة الرقيقة إلى إصابات الدماغ الرضية الخفيفة مع موت الخلايا الواضح وتعبير الأنواع المؤكسدة التفاعلية29 ، وثلاثة أسابيع CCIs أدت إلى داء نجمي قوي وتنشيط الخلايا الدبقيةالصغيرة 28.

يجب المضي قدما بحذر في عدة خطوات لتلفيق نموذج إصابة متسق باستخدام الطريقة الموصوفة. أثناء عملية نافذة الجمجمة الرقيقة ، بناء على منطقة مستهدفة مختلفة (على سبيل المثال ، ركزنا على القشرة الحركية) ، يجب تثبيت رأس الماوس في إطار تجسيمي على المستوى الأفقي أو بزاوية جانبية طفيفة باتجاه الجانب الآخر من نافذة الجمجمة الرقيقة في هذا البروتوكول. يمكن أن يسهل هذا الوضع المحدد إنشاء نافذة الجمجمة الرقيقة في المنطقة المقابلة للقشرة الحركية. يعد وضع قضبان الأذن بدقة أحد أكثر الجوانب تحديا في هذا الإجراء ، وقد يستغرق الأمر وقتا وممارسة لإتقانها. قبل محاولة عملية نافذة الجمجمة الرقيقة أو إحداث تشي ، من الضروري التأكد من أن الجمجمة مستوية. إذا لم يتم وضع الجمجمة بشكل صحيح ، فيجب تعديل الرأس وفقا لذلك. نظرا للشكل غير المتكافئ وسمك عظم الجمجمة ، فإن نمو الجمجمة متغير حتى داخل عظم معين30 ، من الأهمية بمكان ضبط موضع الرأس قبل إجراء عملية نافذة الجمجمة الرقيقة أو CHI. يؤدي عدم القيام بذلك إلى زيادة خطر الإصابة بكسور الجمجمة ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على دقة وموثوقية CHI. للحصول على إرشادات أكثر شمولا حول إجراء نافذة الجمجمة الرقيقة ، راجع البروتوكول الذي حدده Guang et al.14.

يختلف اختيار منطقة نمذجة TBI بين الباحثين بناء على تركيزهم البحثي. نظرا للتباين الكبير في الموقع الفعلي للإصابة في CHI ، على الرغم من أن معظم الدراسات تشير إلى أن موقع الارتطام يقع مركزيا بين bregma و lambda ، يوصى بتغيير موقع التأثير في الدراسات التجريبية المستقبلية ، كما لوحظ في مراجعة نماذج CHI25. للتحقق من صحة نموذج إصابة الجمجمة الرقيقة CHI المعدل ، نوصي بالبدء بالقشرة الحركية ، كما هو موضح في هذا البروتوكول. يمكن أن يسبب rmTBI إصابات القشرة الحركية البؤرية ، والتي يمكن تقييمها بسهولة باستخدام مناهج التقييم الحركي مثل OFT في هذا البروتوكول. يتطلب الشق الذي يتم إجراؤه أثناء هذا الإجراء وقتا للشفاء ، ويمكن أن يؤدي ذلك إلى استجابة مناعية محيطية ، مما يؤدي في النهاية إلى حدوث تباين في التجربة. لتقليل خطر الالتهاب والعدوى والألم وعدم الراحة بعد الجراحة ، نوصي بتطبيق مرهم موضعي يحتوي على مزيج من الإريثروميسين وديكلوفيناك الصوديوم على الجرح. وقد ثبت أن هذا النهج فعال في الحد من الالتهاب والألم المرتبط بالعمليات الجراحية في.

يعد بروتوكول قرع السوائل القائم على الجمجمة الرقيقة طريقة واعدة لنمذجة rmTBI في القوارض لأنه يقلل من الالتهاب الذي يسببه عادة تعريض السحايا ل FPI. يمكن لهذه التقنية ، التي تظهر في نافذة الجمجمة الرقيقة ، أن تولد بشكل فعال PCS ذات الصلة سريريا بدرجات متفاوتة ، مما يوفر بديلا محتملا للباحثين الذين يدرسون rmTBI. علاوة على ذلك ، تسهل نافذة الجمجمة الرقيقة مراقبة توازن الكالسيوم2+ وفرط استثارة الخلايا العصبية في القشرة في الجسم الحي15. يمكن أن يؤدي استخدام هذه التقنية إلى تحسين فهمنا للآليات الأساسية لتطور متلازمة ما بعد الارتجاج على المدى القصير / المتوسط / الطويل ، وبالتالي تعزيز القدرة على التنبؤ بتطورها وتطوير علاجات علاجية أكثر فعالية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة التنمية الاجتماعية الرئيسية لبلدية جينهوا (رقم 2020-3-071) ، وبرنامج التدريب على الابتكار وريادة الأعمال لطلاب كلية تشجيانغ (رقم: S202310345087 ، S202310345088) ومشروع خطة نشاط الابتكار العلمي والتكنولوجي لطلاب كلية مقاطعة تشجيانغ (2023R404044). يشكر المؤلفون الآنسة إيما أويانغ (طالبة في السنة الأولى بجامعة جونز هوبكنز ، بكالوريوس العلوم ، بالتيمور ، الولايات المتحدة الأمريكية) على تحرير المقالة لغوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
75٪ إيثانول  شاندونغ XieKang التكنولوجيا الطبية المحدودة  220502
بوبرينورفين هيدروكلوريدتيانجين معهد البحوث الصيدلانية الصيدلانية المحدودةH12020272، مسكن
كاربروفينشنغهاي Guchen التكنولوجيا الحيوية المحدودة53716-49-7مسحوق ، مسكن
الكلورهيكسيدين ثنائي جلوكوناتشنغهاي ماكلين الكيمياء الحيوية المحدودة18472-51-0محلول مائي 19٪ -21٪ ،
مجموعة أسمنت ومذيبات الأسنانNew Century Dental Materials Co.، Ltd.20220405 ، 3 #مسحوق أعيد توصيله في مطابقة
مجهر تشريحالمذيبات Shenzhen RWD Life Science Inc.77019
مرهم الإريثرومايسين ووهان Mayinglong مجموعة الأدوية المحدودة220412المضادات الحيوية
الألياف البصرية مصدر الضوء الباردShenzhen RWD Life Science Inc.F-150C
مثقاب صغير ذو رؤوس مسطحة  شركة Shenzhen RWD Life Science Inc.HM310082 مم ،
برنامج جهاز FPIJiaxing Bocom Biotech Inc.Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR الفئرانمختبر جينهوا    مخزون # 202309125 فئران ذكور ، 25-30 جم ، 8 أسابيع
من العمر IsofluraneShandong Ante Animal Farming Technology Co.، Ltd.  . ؛2023090501
وسادة تسخين متساوية الحرارة ونتشو ريبشۆب منتجات الأليفة المحدودة   ؛
Luer Loc hupمخصص باستخدام محور إبرة 19G
مثقاب جمجمة صغير محمول باليدShenzhen RWD Life Science Inc.78001كحد أقصى: 38,000 دورة في الدقيقة
جهاز FPI المعدلJiaxing Bocom Biotech Inc.
موريس متاهة المياهشنتشن RWD علوم الحياة شركة63031تقييم قدرات التعلم والذاكرة المكانية للفأر
المفتوحShenzhen RWD Life Science Inc.63008تقييم تحديد موقع الفأر والقلق
زيوت تشحيم العيون سوتشو تيانلونغ الصيدلانية المحدودة   ؛SC230724B
مرهم ديكلوفيناك الصوديوم  ووهان Mayinglong مجموعة الأدوية المحدودة221207دواء مضاد للالتهابات غير الستيرويدي
تخدير الصغيرة - Enhanced & nbsp ؛شركة Shenzhen RWD Life Science Inc.R530IP
نظام تتبع الفيديو الذكيPanlab Harvard Apparatus Inc., MA, USAV3.0تتبع وتحليلها
الإطار التجسيمي شركة Shenzhen RWD Life Science Inc.68043
لاصق الأنسجة Vetbond3M ، سانت بول ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية202402AXخياطة الجرح الحيواني
Y متاهةShenzhen RWD Life Science Inc.63005تقييم ذاكرة العمل المكانية للماوس
الحل المضادة للميكروبات Shanghai الصلب مركز المجال نظام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, J. Y., et al. Traumatic brain injury in china. Lancet Neurol. 18 (3), 286-295 (2019).
  2. Naumenko, Y., Yuryshinetz, I., Zabenko, Y., Pivneva, T. Mild traumatic brain injury as a pathological process. Heliyon. 9 (7), e18342(2023).
  3. Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660(2023).
  4. Grant, D. A., et al. Repeat mild traumatic brain injury in adolescent rats increases subsequent β-amyloid pathogenesis. J Neurotrauma. 35 (1), 94-104 (2018).
  5. Clark, A. L., et al. Repetitive mtbi is associated with age-related reductions in cerebral blood flow but not cortical thickness. J Cereb Blood Flow Metab. 41 (2), 431-444 (2021).
  6. Mcallister, T., Mccrea, M. Long-term cognitive and neuropsychiatric consequences of repetitive concussion and head-impact exposure. J Athl Train. 52 (3), 309-317 (2017).
  7. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  8. Pham, L., et al. proteomic alterations following repeated mild traumatic brain injury: Novel insights using a clinically relevant rat model. Neurobiol Dis. 148, 105151(2021).
  9. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated mild traumatic brain injury: Potential mechanisms of damage. Cell Transplant. 26 (7), 1131-1155 (2017).
  10. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  11. Freeman-Jones, E., Miller, W. H., Work, L. M., Fullerton, J. L. Polypathologies and animal models of traumatic brain injury. Brain Sci. 13 (12), 1709(2023).
  12. Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: A review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Exp Brain Res. 239 (10), 2939-2950 (2021).
  13. Ouyang, W., et al. Modified device for fluid percussion injury in rodents. J Neurosci Res. 96 (8), 1412-1429 (2018).
  14. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
  15. Liu, Y., Fan, Z., Wang, J., Dong, X., Ouyang, W. Modified mouse model of repeated mild traumatic brain injury through a thinned-skull window and fluid percussion. J Neurosci Res. 101 (10), 1633-1650 (2023).
  16. Bolton-Hall, A. N., Hubbard, W. B., Saatman, K. E. Experimental designs for repeated mild traumatic brain injury: Challenges and considerations. J Neurotrauma. 36 (8), 1203-1221 (2019).
  17. Aleem, M., Goswami, N., Kumar, M., Manda, K. Low-pressure fluid percussion minimally adds to the sham craniectomy-induced neurobehavioral changes: Implication for experimental traumatic brain injury model. Exp Neurol. 329, 113290(2020).
  18. Katz, P. S., Molina, P. E. A lateral fluid percussion injury model for studying traumatic brain injury in rats. Methods Mol Biol. 1717, 27-36 (2018).
  19. Xiong, B., et al. Precise cerebral vascular atlas in stereotaxic coordinates of whole mouse brain. Front Neuroanat. 11, 128(2017).
  20. Hoogenboom, W. S., et al. Evolving brain and behaviour changes in rats following repetitive subconcussive head impacts. Brain Commun. 5 (6), 316(2023).
  21. Lipton, M. L., et al. Soccer heading is associated with white matter microstructural and cognitive abnormalities. Radiology. 268 (3), 850-857 (2013).
  22. Rubin, T. G., et al. Mri-defined white matter microstructural alteration associated with soccer heading is more extensive in women than men. Radiology. 289 (2), 478-486 (2018).
  23. Mcinnes, K., Friesen, C. L., Mackenzie, D. E., Westwood, D. A., Boe, S. G. Mild traumatic brain injury (mtbi) and chronic cognitive impairment: A scoping review. PLoS One. 12 (4), e0174847(2017).
  24. Marschner, L., et al. Single mild traumatic brain injury results in transiently impaired spatial long-term memory and altered search strategies. Behav Brain Res. 365, 222-230 (2019).
  25. Hoogenboom, W. S., Branch, C. A., Lipton, M. L. Animal models of closed-skull, repetitive mild traumatic brain injury. Pharmacol Ther. 198, 109-122 (2019).
  26. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: A systematic review. J Athl Train. 55 (2), 132-158 (2020).
  27. Fidan, E., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in the developing brain: Effects on long-term functional outcome and neuropathology. J Neurotrauma. 33 (7), 641-651 (2016).
  28. Nguyen, T., et al. Repeated closed-head mild traumatic brain injury-induced inflammation is associated with nociceptive sensitization. J Neuroinflammation. 20 (1), 196(2023).
  29. Ren, H., et al. Enriched endogenous omega-3 fatty acids in mice ameliorate parenchymal cell death after traumatic brain injury. Mol Neurobiol. 54 (5), 3317-3326 (2017).
  30. Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. J Bone Miner Res. 31 (2), 299-307 (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Modified Mouse Model of Repetitive Mild Traumatic Brain Injury Incorporating Thinned-Skull Window and Fluid Percussion
Posted by JoVE Editors on 6/04/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66440

الوسوم

مقالات ذات صلة