وصفنا بروتوكولا لاستخراج نوى عالية الجودة من أنواع الخلايا الجذعية اللحمية / البطانية وخلايا الدم المشتقة من الخلايا الجذعية المحفوظة بالتبريد لدعم تحليلات تسلسل الجيل التالي من النواة الواحدة. يعد إنتاج نوى سليمة عالية الجودة أمرا ضروريا لتجارب multiomics ولكن يمكن أن يكون عائقا أمام الدخول إلى الميدان لبعض المختبرات.
مقالة منهجية
العزلة النووية من خلايا الدم المشتقة من المختبر المحفوظة بالتبريد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد النماذج القائمة على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) منصات ممتازة لفهم نمو الدم ، وخلايا الدم المشتقة من iPSC لها فائدة متعدية ككواشف اختبار سريرية وعلاجات خلوية قابلة للنقل. إن ظهور وتوسيع تحليل multiomics ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNAseq) ومقايسة تسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة Transposase (snATACseq) ، يوفر إمكانية إحداث ثورة في فهمنا لتطور الخلايا. وهذا يشمل علم الأحياء التنموي باستخدام نماذج المكونة للدم في المختبر . ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تقنيا عزل النوى السليمة عن الخلايا المزروعة أو الأولية. غالبا ما تتطلب أنواع الخلايا المختلفة استعدادات نووية مخصصة اعتمادا على صلابة الخلايا ومحتواها. يمكن أن تحد هذه الصعوبات الفنية من جودة البيانات وتعمل كحاجز أمام الباحثين المهتمين بمتابعة دراسات multiomics. غالبا ما يكون حفظ العينات بالتبريد ضروريا بسبب القيود المفروضة على جمع الخلايا و / أو معالجتها ، ويمكن أن تشكل العينات المجمدة تحديات تقنية إضافية للعزل النووي السليم. في هذه المخطوطة ، نقدم طريقة مفصلة لعزل النوى عالية الجودة من الخلايا المشتقة من iPSC في مراحل مختلفة من تطور المكونة للدم في المختبر لاستخدامها في سير عمل multiomics أحادي النواة. لقد ركزنا تطوير الطريقة على عزل النوى من الخلايا اللحمية / البطانية الملتصقة المشتقة من iPSC والخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة ، حيث تمثل هذه أنواعا مختلفة جدا من الخلايا فيما يتعلق بالهوية الهيكلية والخلوية. وقد حدت خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الموصوفة من التكتل النووي والحطام، مما سمح باستعادة النوى بكميات ونوعية كافيتين للتحليلات النهائية. يمكن تكييف طرق مماثلة لعزل النوى عن أنواع الخلايا الأخرى المحفوظة بالتبريد.
المقدمة
تكون الدم هو نظام تنموي جيد التوصيف نسبيا ، لكن عدم القدرة على تلخيص تكوين خلايا الدم في المختبر يدل على فهم غير مكتمل للعوامل ذات الصلة. يمكن أن تساعد نماذج تكون الدم القائمة على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) في توضيح العوامل التنموية الرئيسية والبيولوجيا ذات الصلة. يقدم نظام iPSC أيضا نموذجا ممتازا لدراسة اضطرابات الدم ، وقد تم تطوير خلايا الدم القائمة على iPSC لإنتاج الكواشف ذات الصلة متعدية وعلاجية1،2،3،4. تم استخدام دراسات الخلية الواحدة على نطاق واسع للتحقيق في علم الأحياء التنموي القائم على iPSC ، بما في ذلك أنواع الخلايا التي يتم إنتاجها أثناء تكون الدم5. بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، والذي لا يمكنه استنتاج العلاقات بين المجموعات السكانية الفرعيةللخلايا 6 ، تسمح طرائق الخلية الواحدة بتقييم عدم تجانس الخلية ويمكن أن تسهل تحديد وتوصيف تطور الخلية 6,7.
يتطلب تكوين الخلايا المكونة للدم من iPSCs تمايزا متسلسلا من خلال الخط البدائي والأدوم المتوسط والحالات البطانية لتشكيل خلايا بطانية دموية. الخلايا البطانية الدموية هي سلائف مباشرة للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم8. هذه الأنواع من الخلايا لها خصائص مورفولوجية وخلوية مختلفة بشكل ملحوظ. هناك فهم محدود للمشهد اللاجيني والديناميكيات التنموية لنماذج الخلايا المكونة للدم المشتقة من المختبر ، على الرغم من أن هذه معرفة أساسية لإطلاق العنان للإمكانات العلاجية الكاملة لنظام iPSC. في كثير من الحالات ، تسمح طرق تحليل الخلية المفردة فقط بتحديد مجموعات الخلايا ، وأنشطة النسخ ، والمناظر الطبيعية للكروماتين ، والآليات التنظيمية التي تحكم التطور بين مستحضرات الخلايا غير المتجانسة.
يمكن أن تكشف منهجيتان ، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (snRNAseq) ، عن رؤى نسخية على مستوى الخليةالفردية 9. أحد العوامل الرئيسية التي تملي صحة البيانات وموثوقيتها هو الحاجة التي لا هوادة فيها للعينات التي تلبي معايير الجودة الصارمة. وتشمل هذه المتطلبات الدقيقة للخلية / الكثافة النووية ، والجدوى المثلى ، والحد الأدنى من التكتل. يمكن أن يكون تحضير النوى المفردة أمرا صعبا من الناحية الفنية. يمكن أن تكون هناك تحديات إضافية مرتبطة باستخدام الخلايا المحفوظة مسبقا بالتبريد.
نلاحظ أربعة قيود محتملة مهمة على نهج scRNAseq القياسية. أولا ، غالبا ما تشير البروتوكولات القياسية لتوليد معلقات الخلايا إلى المستحضرات من الخلايا أو الأنسجة الطازجة ، بدلا من تلك التي يتم استردادها بعد الحفظ بالتبريد10. هذا يمكن أن يحد من فائدة الموارد التي يحتمل أن تكون قيمة. ثانيا ، كفاءة التفكك لأنواع الخلايا المختلفة متغيرة. على سبيل المثال ، تخضع العديد من أنواع الخلايا المناعية للتفكك بسهولة نسبية. في المقابل ، فإن الخلايا اللحمية والخلايا الليفية والخلايا البطانية ، والتي عادة ما تكون مضمنة في المصفوفة خارج الخلية والغشاء القاعدي ، لها خصائص خلوية فريدة يمكن أن تعقد عزل النوى11,12. يمكن أن تتطلب هذه الخصائص بروتوكولات تفكك عدوانية ، والتي قد تعرض للخطر السلامة الهيكلية لمجموعات الخلايا الأكثر حساسية. ثالثا ، يمكن لبعض الخلايا (على سبيل المثال ، خلايا النواة) أن يتجاوز قطرها 100 ميكرومتر وتشكل صعوبات للعديد من المنصات التجارية أحادية الخليةالقائمة 13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التعامل غير السليم إلى تلف الخلايا واستجابات الإجهاد أثناء الخطوات الأولية لعزل الخلايا ، بما في ذلك التحلل المائي الأنزيمي والتفكك الميكانيكي ، مما قد يؤثر على ملفات تعريف التعبير الجيني11,14.
لهذه الأسباب وغيرها ، قد يكون نهج النواة الواحدة بديلا مفضلا لطرق الخليةالمفردة 15. نظرا للاستقرار الفائق للغشاء النووي مقارنة بغشاء الخلية ، قد يظل الغلاف النووي سليما حتى بعد حفظ الأنسجةبالتبريد 16. ومن شأن ذلك أن ييسر الاستخراج النووي ويعزز تنوع أنواع العينات المناسبة لطرائق تسلسل الجيل التالي. ثانيا ، تظهر النوى مقاومة عالية للاضطرابات الميكانيكية وتميل إلى إظهار تحولات نسخ أقل أثناء التفكك14. لذلك ، يمكن أن توفر النوى استقرارا أكبر للحمض النووي الريبي (RNA) وملفات تعريف نسخ أكثر قابلية للتكرار. الميزة الثالثة الجديرة بالملاحظة لطرق النوى المفردة هي عدم وجود قيود على حجم الخلية وإمكانية التطبيق على الخلايا الأكبر ، مثل خلايا عضلة القلب أو خلايا النواة12. رابعا ، تعمل النوى كركائز مناسبة لتحليلات multiomics ، والتي تقدم رؤى موسعة من التحليل المتكامل للتعبير الجيني ، ومناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها ، وغيرها من المعلمات17 ، مما يتيح فهما أعمق لعدم تجانس الخلايا وتطورها وحالاتها الوظيفية18.
من خلال التنميط iPSCs أثناء تطور المكونة للدم ، يمكن أن تساعد مناهج multiomics في تحديد العمليات التنموية في نماذج الأمراض العادية أو المرضية. يمكن أن توفر مقارنات الخلايا المشتقة من iPSC بالخلايا أو الأنسجة الأولية أيضا تقييما لإخلاص نموذج iPSC لبيولوجيا الجسم الحي ، مما يسهل تحسين نموذج iPSC واكتشاف مجموعات الخلايا الجديدة والعوامل التي تدفع تكوين الدم.
على الرغم من أن العديد من المجموعات قد نجحت في اجتياز العزل النووي وما نتج عنه من تحليل تسلسل الجيل التالي ، إلا أن عزل النوى عالية الجودة لا يزال يشكل عائقا أمام بعض المختبرات المهتمة بإجراء التحليلات القائمة على النواة المفردة. تفصل هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل النوى عالية الجودة من الخلايا المشتقة من iPSC المحفوظة مسبقا بالتبريد. لقد ركزنا على الخلايا اللحمية / البطانية الملتصقة والخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة ، حيث تمثل هذه أنواعا مختلفة جدا من الخلايا فيما يتعلق بالبنية والمحتوى التي تتطلب تعديلات مخصصة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لزيادة استعادة النوى عالية الجودة القابلة للتسلسل من الجيل التالي أو تجارب أخرى.
البروتوكول
1. الحفظ بالتبريد للخلايا
- قم بتجميد >1 × 106 خلايا معزولة مشتقة من iPSC لكل مل في 1 مل من 90٪ FBS و 10٪ DMSO. ضع المبردات في وعاء تجميد عند -80 درجة مئوية لتقليل سرعة التجميد وتحسين استعادة الخلايا القابلة للحياة (جدول المواد). توقع فقدان كبير للخلايا ، والذي يمكن أن يختلف بناء على ظروف الثقافة وهوية الخلية.
- الانتقال من -80 درجة مئوية إلى تخزين النيتروجين السائل في غضون 24 ساعة.
2. ذوبان الخلايا
- استرجع التبريد من تخزين النيتروجين السائل وقم بإذابة الجليد في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. أخرجه من الحمام المائي بينما لا تزال بلورات الثلج الصغيرة مرئية.
- انقل الخلايا من cryovial إلى أنبوب فارغ سعة 15 مل وأضف ببطء 10 مل من الوسط المسخن مسبقا (RPMI 1640 + 10٪ FBS) أثناء الخلط بعناية. أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية.
- نضح المادة الطافية وإعادة تكوينها في 1 مل من DPBS المكمل ب 2٪ FBS و 1 mM CaCl2 (جدول المواد). امزج بعناية عن طريق سحب 3x باستخدام ماصة صغيرة سعة 1000 ميكرولتر. نقل إلى أنبوب البوليسترين القاع المستدير 5 مل.
3. إزالة الخلايا الميتة
- أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل إزالة الخلايا الميتة (جدول المواد) إلى 1 مل من تعليق الخلية. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل اختيار البيوتين إلى خليط الخلية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. تقوم هذه الخطوات بتسمية الخلايا الميتة Annexin V + الموجودة داخل تعليق الخلية بالبيوتين.
- دوامة قوية لمدة 30 ثانية ، حبات ديكستران مصممة لاستنفاد أنواع الخلايا غير المرغوب فيها المسمى بالبيوتين (جدول المواد). أضف 100 ميكرولتر من حبات ديكستران إلى تعليق الخلية واخلطها عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل 2x باستخدام ماصة ميكرو 1000 ميكرولتر (جدول المواد).
- أضف 1.3 مل من DPBS تحتوي على 2٪ FBS و 1 mM CaCl2 إلى تعليق الخلية واخلطها عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل 2x باستخدام ماصة دقيقة 1000 ميكرولتر. ضع الأنبوب في المغناطيس (جدول المواد) واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- اقلب المغناطيس والأنبوب لصب معلق الخلية الحية المخصب في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة معظم المادة الطافية وأعد تعليقها في 1 مل من DPBS + 0.04٪ BSA. امزجه برفق عن طريق سحب 3 مرات باستخدام ماصة صغيرة سعة 1000 ميكرولتر.
4. عزل النوى
- تعليق الخلية الحية للطرد المركزي عند 460 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ثم نضح المادة الطافية ، مما يضمن عدم تعطيل حبيبات الخلية.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل الطازج 0.5x المبرد على الثلج (الجدول 1) واخلطه برفق عن طريق سحب 10x باستخدام ماصة صغيرة 100 ميكرو. احتضان 3 دقائق على الجليد.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل المبرد (الجدول 2) إلى الأنبوب دون خلط. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. غسل وتقييم النوى
- نضح طاف وإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المبرد لإذابة الحبيبات السليمة المتبقية دون خلط. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة جميع المواد الطافية دون تعطيل حبيبات النوى.
- أعد التعليق في 120 ميكرولتر من المحلول المؤقت للنوى المخففة المبردة (الجدول 3). قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر (جدول المواد).
- صبغ مع 0.4 ٪ تريبان الأزرق وتقييم بصريا نوعية النوى المعزولة تحت المجهر 10x (جدول المواد).
6. معالجة النوى المعزولة
- الحفاظ على النوى على الجليد. انتقل إلى مزيد من المعالجة على الفور ، حيث يمكن أن يحدث التكتل النووي بمرور الوقت ويستلزم خطوات ترشيح إضافية.
النتائج
لقد استخدمنا البروتوكول المذكور أعلاه لاستخراج النوى من الخلايا اللحمية / البطانية المشتقة من iPSC المحفوظة بالتبريد والخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة (العائمة). يمكن العثور على تمثيل تخطيطي مفصل لإجراء العزل النووي في الشكل 1.
للفحص المورفولوجي ، تم تلطيخ النوى المعزولة باللون الأزرق المثقب وتصورها تحت المجهر. يعد الفحص المورفولوجي النووي أمرا بالغ الأهمية قبل المعالجة مباشرة ، حيث يمكن للحطام أو النوى المتكتلة أن تقلل أو تمنع توليد بيانات عالية الجودة بسبب الانسدادات في أدوات الموائع الدقيقة الدقيقة. أظهر الفحص المجهري للنوى المعزولة من عينة تم تحضيرها باستخدام بروتوكول مجموعة تقليدي وجود حطام ومجموع نووي ≥1 لكل مجال مرئي (الشكل 2A-B). تم التخلص من هذه العينات بسبب الجودة الرديئة.
النوى عالية الجودة مستديرة وسليمة ، مع الحد الأدنى من الكتل أو عدم وجودها ، مثل تلك التي لاحظناها بعد تحسين الطريقة (الشكل 2C-D). لم نلاحظ أي تجمعات أو تكتل في هذه العينات. كانت هذه النوى ذات نوعية وكمية كافية لدعم المعالجة والتحليل النهائيين. يمكن أن يمتد استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحسين البروتوكول إلى أنواع الخلايا الأخرى المحفوظة بالتبريد.
الشكل 1: شكل يوضح استخلاص النوى من الخلايا المحفوظة بالتبريد. تصوير مرئي يوضح بالتفصيل الخطوات التي ينطوي عليها العزل النووي من الخلايا المحفوظة بالتبريد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النوى المعزولة من الخلايا البشرية المشتقة من iPSC المحفوظة بالتبريد. تظهر النوى المعزولة من الخلايا اللحمية / البطانية الملتصقة الملطخة باللون الأزرق التريبان حطاما كبيرا (أ) جسيمات صغيرة و (ب) مجاميع نووية (جسيمات كبيرة) حالت دون إجراء تحليلات في اتجاه مجرى النهر. بعد إجراء التعديلات التقنية المعروضة هنا ، تم عزل النوى عالية الجودة من (C) الخلايا السلفية البشرية المشتقة من iPSC المحفوظة بالتبريد أو (D) مجموعات الخلايا اللحمية / البطانية بكميات كافية لدعم التحليلات النهائية. كمرجع ، تم جمع هذه الخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة في اليوم 9 + 8 والخلايا اللحمية / البطانية الملتصقة في اليوم 9 + 7 من تمايز المكونة للدم كما هو موضح في4. لاحظ أن التشكل النووي يمكن أن يختلف عبر أنواع الخلايا. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| إعداد المخزن المؤقت | |||
| 0.5X المخزن المؤقت للتحلل | رصيد | نهائي | 2 مل |
| 1X تحلل العازلة | 1X | 0.5 مرة | 1 مل |
| تحلل التخفيف العازلة | 1 مل | ||
| تحلل العازلة | رصيد | نهائي | 2 مل |
| جيش صرب البوسنه | 10% | 1% | 200 ميكرولتر |
| ديجيتونين | 5% | 0.01% | 4 ميكرولتر |
| دي تي تي | 1000 مللي متر | 1 مللي متر | 2 ميكرولتر |
| إم جي سي إل2 | 1 م | 3 مللي متر | 6 ميكرولتر |
| كلوريد الصوديوم | 5 م | 10 مللي متر | 4 ميكرولتر |
| نونيديت P40 بديل | 10% | 0.10% | 20 ميكرولتر |
| ماء خال من النيوكلياز | 1.67 مل | ||
| مثبطات RNase | 40 وحدة / ميكرولتر | 1 وحدة / ميكرولتر | 50 ميكرولتر |
| تريس حمض الهيدروكلوريك (pH7.4) | 1 م | 10 مللي متر | 20 ميكرولتر |
| توين -20 | 10% | 0.10% | 20 ميكرولتر |
| تحلل التخفيف العازلة | رصيد | نهائي | 2 مل |
| جيش صرب البوسنه | 10% | 1% | 200 ميكرولتر |
| دي تي تي | 1000 مللي متر | 1 مللي متر | 2 ميكرولتر |
| إم جي سي إل2 | 1 م | 3 مللي متر | 6 ميكرولتر |
| كلوريد الصوديوم | 5 م | 10 مللي متر | 4 ميكرولتر |
| ماء خال من النيوكلياز | 1.72 مل | ||
| مثبطات RNase | 40 وحدة / ميكرولتر | 1 وحدة / ميكرولتر | 50 ميكرولتر |
| تريس حمض الهيدروكلوريك (pH7.4) | 1 م | 10 مللي متر | 20 ميكرولتر |
الجدول 1: تحضير محلول تحلل 0.5x. تم تعيين هذا الحل لإجراء عزل النوى في الخطوة 4.2. يتم خلط المخزن المؤقت للتحلل والمخزن المؤقت لتخفيف التحلل لتحضير محلول 0.5x محلول تحلل. من الضروري تحضير مخزن مؤقت جديد مباشرة قبل كل تجربة والحفاظ على الجليد. لاحظ أن استكشاف الأخطاء وإصلاحها لبعض أنواع الخلايا قد يتضمن 1x أو 0.5x أو تخفيفات أقل من محلول التحلل لتسهيل عزل النواة السليمة.
| إعداد المخزن المؤقت | |||
| غسل العازلة | رصيد | نهائي | 4 مل |
| جيش صرب البوسنه | 10% | 1% | 400 ميكرولتر |
| دي تي تي | 1000 مللي متر | 1 مللي متر | 4 ميكرولتر |
| إم جي سي إل2 | 1 م | 3 مللي متر | 12 ميكرولتر |
| كلوريد الصوديوم | 5 م | 10 مللي متر | 8 ميكرولتر |
| ماء خال من النيوكلياز | 3.40 مل | ||
| مثبطات RNase | 40 وحدة / ميكرولتر | 1 وحدة / ميكرولتر | 100 ميكرولتر |
| تريس حمض الهيدروكلوريك (pH7.4) | 1 م | 10 مللي متر | 40 ميكرولتر |
| توين -20 | 10% | 0.10% | 40 ميكرولتر |
الجدول 2: إعداد عازلة الغسيل. يستخدم هذا المحلول أثناء عزل النوى. يجب تحضير هذا طازجا قبل كل تجربة والاحتفاظ به على الجليد.
| إعداد المخزن المؤقت | |||
| العازلة النوى المخففة | رصيد | نهائي | 1 مل |
| دي تي تي | 1000 مللي متر | 1 مللي متر | 1 ميكرولتر |
| ماء خال من النيوكلياز | 924 ميكرولتر | ||
| العازلة النوى | 20 ضعفا | 1X | 50 ميكرولتر |
| مثبطات RNase | 40 وحدة / ميكرولتر | 1 وحدة / ميكرولتر | 25 ميكرولتر |
الجدول 3: تحضير المحلول النووي المخفف. يستخدم هذا الحل في الخطوة 5.2. يجب تحضيره طازجا قبل كل تجربة وحفظه على الجليد.
المناقشة
الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول
يعد عزل النوى عالية الجودة أمرا ضروريا للتنفيذ الناجح لطرائق تسلسل الجيل التالي الحالية القائمة على النواة المفردة ، والتي تتطور بسرعة. واعترافا بالحواجز القائمة أمام المختبرات المهتمة بهذه الأساليب، وخاصة بالنسبة للعينات المحفوظة بالتبريد، كان هدفنا هو صياغة تقنية عزل نووي مصممة خصيصا للخلايا المجمدة سابقا. غالبا ما يكون عزل النوى من العينات المحفوظة بالتبريد ضروريا للعينات السريرية ولمجموعات الخلايا النادرة المشتقة من iPSC.
من المهم تخصيص تخفيف المخزن المؤقت للتحلل ، ووقت التحلل ، وتكرار الترشيح لمجموعات خلايا معينة. لقد لاحظنا أن أنواع الخلايا الحساسة بشكل خاص ، مثل الخلايا السلفية المكونة للدم المشتقة من iPSC البشرية المحفوظة بالتبريد ، تصبح مفرطة في التحلل في أقل من دقيقة مع 1x محلول تحلل. هذا الإفراط في التحلل ليس مجرد عطل تقني أو تشغيلي. بدلا من ذلك ، يمكن أن يشير الإفراط في التحلل والتكتل إلى تسرب المواد النووية اللاصقة. بالنسبة للخلايا اللحمية والبطانية الملتصقة ذات البنية الهيكلية الخلوية القوية والأغشية ذات الميل لتشكيل التصاقات قوية للخلايا الخلوية ، كان الترشيح المزدوج ضروريا لإزالة النوى المتكتلة. يمكن للمجاميع النووية أن تعرقل قنوات الموائع الدقيقة ، مما يمثل مخاطر ملموسة على السلامة التجريبية ويحتمل أن يحول دون أي إخراج للبيانات.
وجدنا أيضا أن دمج خطوة إزالة الخلايا الميتة زاد بشكل كبير من استعادة النوى السليمة مع الحد من التكتل والحطام. كان من الضروري معالجة العينات التي تحتوي على خلايا قابلة للحياة بنسبة >70٪ بناء على تلطيخ التريبان الأزرق في بداية التجربة. يمكن أن يساعد الاحتفاظ بجميع المخازن المؤقتة على الجليد أيضا في الحفاظ على الجدوى.
حدود التقنية
تم تصميم الطريقة الموصوفة لتحسين الاسترداد النووي من أنواع الخلايا المستزرعة المشتقة من iPSC4. من الممكن أن تمتد إجراءات استكشاف الأخطاء وإصلاحها المماثلة إلى ما هو أبعد من الخلايا التي يسببها iPSC لتشمل أنواع الخلايا الأخرى المحفوظة بالتبريد ، ولكن من الصعب إلى حد ما التنبؤ بالاحتياجات المحددة للعينات الفردية أو أنواع الخلايا دون اختبار. بغض النظر عن العينة أو نوع الخلية ، فإن استهداف الاستعدادات النووية مع بقاء <5٪ خلايا كاملة قابلة للحياة ، وتقليل التجميع ، وتقليل النوى المتحللة بشكل مفرط يجب أن يرتبط ارتباطا مباشرا بالنجاح التجريبي.
الأهمية فيما يتعلق بالأساليب الحالية
يمكن لأنظمة التمايز القائمة على iPSC ذات الصلة بالترجمة أن تنتج العديد من أنواع الخلايا والأسلاف. يركز هذا البروتوكول على الخلايا اللحمية / البطانية الملتصقة المشتقة من iPSC والخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة كأنواع خلايا مثالية لها متطلبات منهجية مختلفة لتحسين العزل النووي. نتوقع أن يتم تكييف هذا البروتوكول وتطبيقه على أنواع الخلايا الأخرى المشتقة من iPSC لاستجواب مراحل النمو المحورية ، مع إدراك أنه من الضروري ضبط طرق العزل اعتمادا على محتوى البروتين وبنية الغشاء وصلابة الخلية. ومع ذلك ، فإن المنهجية الموصوفة هنا قد تسمح باستعادة النوى عالية الجودة من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا المحفوظة بالتبريد.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون جيسون هاتاكياما (10x Genomics) وديانا سلاتر (مركز مستشفى فيلادلفيا للأطفال لعلم الجينوم التطبيقي) على التوجيه والاقتراحات. تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (HL156052 إلى CST).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <كواشف زراعة الخلايا القوية> < / قوي > | |||
| محلول ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما | 673439 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو (DPBS) | كورنينج | 21031CV | |
| مصل بقري الجنين (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| <قوية>الخلايا | |||
| المستحثة الخلايا الجذعية متعددة | N/A | N/ | A تم الحصول على iPSCs المستخدمة في هذه الدراسة من خلال مرفق الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات التابع لمستشفى فيلادلفيا |
| للأطفال<قوية> كواشف تلطيخ الخلايا < / قوي > | |||
| محلول تريبان الأزرق | كورنينج | 25900CI | |
| قوي > كواشف إزالة الخلايا الميتة < / قوي > | |||
| كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>) | Sigma | C4901 | |
| EasySep إزالة الخلايا الميتة (Annexin V) مجموعة | تقنيات الخلايا الجذعية | 17899 | تم تصميم هذه المجموعة لاستنفاد أنواع الخلايا غير المرغوب فيها المسمى بالبيوتين. تتضمن المجموعة كوكتيل إزالة الخلايا الميتة (Annexin V) ، وكوكتيل اختيار البيوتين ، وخرز ديكستران. تستهدف هذه المجموعة الفوسفاتيديل سيرين على النشرة الخارجية لغشاء الخلية للخلايا المتأتة باستخدام Annexin V. يتم تصنيف الخلايا غير المرغوب فيها ب Annexin V ، والأجسام المضادة الحيوية ، والجزيئات المغناطيسية ، ويتم فصلها بدون أعمدة باستخدام مغناطيس EasySep. يتم سكب الخلايا المرغوبة ببساطة في أنبوب جديد. |
| < قوي > المواد < / قوي > | |||
| 10 & مايكرو ؛ ل Micropipette | Wards science | 470231606 | |
| 100 & micro ؛ ل Micropipette | Wards science | 470231598 | |
| 1000 & micro ؛ ل تلميح عالمي ممتد | منتجات مختبر أكسفورد | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 & micro ؛ ل Micropipette | Wards science | 470231602 | |
| 2.0 مل قوارير مبردة | Corning | 431386 | |
| 20 & micro ؛ ل Micropipette | Wards science | 470231608 | |
| 200 & micro ؛ ل Micropipette | Wards science | 470231600 | |
| 5 مل من البوليسترين أنبوب دائري القاع | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 & micro ؛ ل محطة Pipet Tip | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 & micro ؛ ل محطة Pipet Tip | Corning | 4144 | |
| العد | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer ، 40 & micro ؛ m | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1 & deg ؛ C حاوية التجميد | Nalgene | 51000001 | |
| Nuclei Isolation Recodes< / strong> | Nuclei Rule Buffer ، ؛ عازلة الغسيل ، وعازلة النوى المخففة ، ومحلول تخفيف التحلل. يوجد تكوين هذه المخازن المؤقتة في الجدول 1 و 2 و 3. أدت طريقة عزل النوى الخاصة بنا إلى تحسين العزل عن بروتوكولات المجموعة القياسية (على سبيل المثال ، دليل مستخدم 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression [CG000338]). يمكن استخدام هذا البروتوكول مع العديد من المجموعات التجارية ، بما في ذلك حزمة كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية Chromium Next GEM Multiome ATAC + ، 16 rxns (PN-1000283). | ||
| طقم إزالة الخلايا الميتة | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer ، 40 & micro ؛ m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS محلول مخزون ألبومين مصل الأبقار (BSA) | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>) | Sigma | 7786303 | |
| محلول كلوريد المغنيسيوم ، 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 بديل | Sigma | 74385 | |
| خالي من Nuclease Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Nuclei Buffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector RNase مثبط | Sigma | 3335399001 | |
| كلوريد الصوديوم (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| محلول كلوريد الصوديوم ، 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochloride Soultion ، درجة الحموضة 7.4 | سيجما | T2194 | |
| Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| معدات أخرى< / قوي> | |||
| عداد الخلايا الآلي | CytoSMART | مجهر 699910591 | |
| Zeiss | Primostar 3 |
المراجع
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648(2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
