تقنية الحقن داخل الصفاق في أسماك الزرد البالغة التي تقلل من تلف الجسم والوفيات المرتبطة به

اكتسب الزرد (Danio rerio) الاهتمام كنموذج تجريبي لدراسة الأمراض البشرية لأن هذا يشمل تماثل الجينات والأعضاء العالي للبشر ، والتخصيب الخارجي ، وسهولة التلاعب الجيني ، وشفافية الجسم حتى النضج المبكر ، مما يسهل عددا لا يحصى من تطبيقات التصوير¹. على عكس العملية المباشرة لتوصيل الأدوية مباشرة إلى الماء لأجنة الزرد واليرقات ، فإن إعطاء الأدوية لأسماك الزرد البالغة يمثل مسعى أكثر تعقيدا وتحديا².

في الأسماك البالغة ، يمكن توصيل المركبات من خلال تقنيات توصيل الدواء السلبية ، مثل الإعطاء المباشر في الماء ، أو من خلال طرق توصيل الدواء عن طريق الفم مثل gavaging². تشمل الأساليب الأخرى طلاء أغذية الأسماك بالمركبات ثم تغذية الأسماك^{لاحقا 3} ، والإدارة المباشرة للأدوية غير القابلة للذوبان في الماء بتركيز محدد مسبقا ، بما في ذلك الحقن خلف الحجاج أو داخل الصفاق ^4,5. يفضل الإعطاء داخل الصفاق للدراسات في الجسم الحي لنماذج المرض بسبب مزاياه الدوائية المميزة⁶. توفر هذه الطريقة تركيزا عاليا للدواء ونصف عمر ممتد داخل التجويف البريتوني ، مما يوفر طريقا فعالا لتوصيل الدواء ^7,8. يشيع استخدام هذا النهج في إعدادات البحث لضمان امتصاص الدواء وتوزيعه على النحو الأمثل ⁹. في حين أن الطرق القائمة على الحقن تثبت فعاليتها في الولادة الفردية ، فإن الحقن المطول والمتكرر غالبا ما يؤدي إلى تلف الجسم والعدوى المزمنة².

حاليا ، هناك طريقتان لحقن IP في زربافيش البالغين^4،10. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين لهما قيود عند توصيل المركبات السامة مثل دوكسوروبيسين ، مما يؤدي إلى أضرار جسيمة لشكل الجسم ونفوق الأسماك. الآثار الجانبية يمكن أن تعقد بشكل كبير تفسير البيانات. على الرغم من أنه يمكن معالجة هذه التحديات من خلال التدريب المكثف¹⁰ ، إلا أن هناك حاجة واضحة لطريقة حقن IP جديدة تقلل من الآثار الجانبية.

هنا ، هدفنا هو تطوير طريقة جديدة لحقن IP محسنة للتوصيل الفعال للدوكسوروبيسين إلى الزرد البالغ ، مما يسهل توليد نماذج موثوقة لاعتلال عضلة القلب الناجم عن دوكسوروبيسين (DIC) مع تقليل تلف الجسم والوفيات المرتبطة به.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تم إجراؤها من قبل لجنة Mayo Clinic المؤسسية لرعاية واستخدامها، مع الالتزام بالمعايير الموضحة في "دليل رعاية واستخدام المختبر" (مطبعة الأكاديميات الوطنية، 2011). تنتمي جميع أسماك الزرد في الدراسة إلى سلالة النمط النووي الهندي البري (WIK). يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. إعداد وتخزين محلول مخزون دوكسوروبيسين

1. الحصول على مخزون دوكسوروبيسين من مصدر تجاري.
   ملاحظة: دوكسوروبيسين حساس للضوء ، لذا احصل عليه في شكل مسحوق وقم بتخزينه في حاويات غير شفافة لحمايته من التعرض للضوء. نفذ جميع خطوات تحضير مسحوق Dox داخل غطاء كيميائي.
2. قم بإذابة مسحوق Dox تماما في الماء المقطر وقم بإعداد محلول مرق بتركيز نهائي قدره 5 مجم / مل.
3. قسمة المخزون بتقسيمه إلى أنابيب سعة 1.5 مل.
4. لف الأنابيب بورق الألمنيوم لحمايتها من التعرض للضوء.
5. قم بتخزين محلول القسمة Dox عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل (<1 شهر) ، أو -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل¹⁰.

2. تجميع الأسماك حسب وزن الجسم

1. قم بتجميع الأسماك بفارق وزن بني أقل من 10٪ معا للحقن اللاحق.
   ملاحظة: لتوفير الجهد في هذه المرحلة، يتم تصنيف الأسماك ذات التباين الأقل من 10٪ من وزن الجسم على أنها بنفس الحجم.
2. اترك السمك يصوم لمدة 24 ساعة قبل الحقن.
3. تخدير الأسماك باستخدام ماء الجنين الذي يحتوي على 0.16 ملغم / مل تريكايين لمدة 1 دقيقة.
4. أخرج السمك من الماء باستخدام التريكايين وربت على جانبي جسم السمكة بورق ترشيح نظيف لإزالة الماء الزائد.
5. قم بقياس وتسجيل وزن الجسم لكل سمكة ، ثم أعد الأسماك على الفور إلى خزان استرداد مملوء بمياه النظام العذبة.
   ملاحظة: تم إجراء حقن Dox على الأسماك بعد بلوغ 3 أشهر من العمر. في هذه الدراسة ، استخدم الباحثون أسماكا عمرها من 3 أشهر إلى 10 أشهر. قد تختلف BWs من سلالة الزرد WIK الناضجة من 0.2 جم إلى 0.5 جم. أدى التخدير المطول لأكثر من 5 دقائق ، يليه حقن Dox ، إلى ارتفاع معدل نفوق الأسماك.

3. إعداد الإبرة والمحطة للحقن

1. حدد حجم حقن محلول مخزون Dox (على سبيل المثال ، 5 مجم / مل) اللازم لكل سمكة بناء على متوسط وزن الجسم لتحقيق الجرعة المستهدفة البالغة 20 ميكروغرام / جم.
2. استخدم الصيغة التالية لحساب حجم الحقن:
   
3. أضف 1x محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) لتخفيف محلول Dox المحسوب في الخطوة 1 للحقن ، ليصل حجمه الإجمالي إلى 5 ميكرولتر.
   ملاحظة: استخدم محلول السائبة لكل مجموعة من الأسماك بناء على الأسلحة البيولوجية الخاصة بها وقم بتضمين 3 أسماك إضافية في كل مجموعة لضمان عدم وجود نقص في محلول الحقن أثناء التجربة.
4. اضغط برفق على الأنبوب ثم استخدم جهاز الطرد المركزي الدقيق لفترة وجيزة بأقصى سرعة لجمع المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثوان.
5. ضع المحلول المحضر على الجليد واحميه من التعرض للضوء.
6. ضع طبق بتري نظيفا مقاس 100 مم باستخدام إسفنجة أسفل مجهر تشريح ، ثم اضبط التركيز.
   ملاحظة: تحتوي الإسفنجة على أخدود بطول 4 سم. سيوفر التراجع المرن للإسفنجة الدعم للأسماك ويحافظ على جسم السمكة في موضعه. يمكن إعادة استخدام الإسفنجة.
7. جهز حقنة صغيرة سعة 10 ميكرولتر بإبرة مشطوفة 34 جرام.
8. اغسل الإبرة بمحلول 1x HBSS للتخلص من أي فقاعات وإزالة الانسدادات المحتملة من المحقنة.
9. قياس 5 ميكرولتر من الحل أعدت في الخطوة 4 للحقن.

4. إجراء حقن IP Dox

1. ضع الأسماك البالغة في الماء مع 0.16 ملغ / مل تريكايين لمدة 1 دقيقة للحث على حالة من فقدان الوعي.
2. ضع السمكة في أخدود الإسفنجة المدمجة بحيث يكون البطن متجها لأعلى (الشكل 1 أ).
3. أدخل الإبرة بزاوية قريبة من 0 درجة ، بدءا من نقطة منتصف الزعنفة الصدرية باتجاه الجانب الخلفي من تجويف القلب (الشكل 1 ب).
   ملاحظة: تجنب أي اتصال مع القلب أثناء العملية.
4. وجه الإبرة نحو الذيل واذهب تحت الجلد الفضي.
   ملاحظة: ضع الإبرة على مقربة من الجلد الفضي ، مع الحرص على تجنب أي خدش أو ثقب.
5. راقب طرف الإبرة داخل تجويف البطن طوال العملية بأكملها (الشكل 1C).
   ملاحظة: تجنب إتلاف الكبد والأمعاء والمثانة والأعضاء الأخرى. تأكد من أن الإبرة تصل إلى نهاية الأمعاء ، بالقرب من الثقبة المشقوقة.
6. قم بتوزيع محلول Dox سعة 5 ميكرولتر تدريجيا وبشكل متساو ، ثم اسحب الإبرة ببطء على طول المسار الأصلي لمنع أي تسرب (الشكل 1 د).
7. راقب تجويف البطن بحثا عن وجود Dox من خلال ملاحظة اللون الأحمر لمحلول Dox (الشكل 1E).
8. انقل الأسماك المحقونة بسرعة إلى حوض عبور نظيف مملوء بمياه النظام العذبة لمساعدة الأسماك على التعافي.
   ملاحظة: بين الحقن ، اغسل الإبرة مرة واحدة باستخدام 1x HBSS buffer.

5. إدارة الأسماك بعد الحقن

1. أعد السمكة إلى النظام مع الدوران بعد الحقن.
2. قم بصيام جميع الأسماك المحقونة لمدة 24 ساعة إضافية لتسهيل شفائها.
3. خلال الأسبوع الأول ، راقب الأسماك عن كثب. قم بإزالة الأسماك الميتة في أسرع وقت ممكن لتجنب إصابة الأسماك الأخرى.
   ملاحظة: من المحتمل أن تكون وفيات الأسماك خلال ال 24 ساعة الأولى ناتجة عن إصابات جسدية من الحقن أو التخدير المطول. سجل أعداد الأسماك لتوليد منحنى البقاء على قيد الحياة.
4. إجراء تخطيط صدى القلب للنمط الظاهري للأسماك المحقونة بالدوكس في 56 يوما بعد الحقن¹¹.
   ملاحظة: ضمان التوحيد في الظروف والإجراءات لمجموعة التحكم المقابلة المحقونة بمحلول HBSS.

في السابق ، تم استخدام طريقتين داخل الصفاق (IP) لإدارة دوكسوروبيسين في الزرد البالغ4،10. في الطريقة الأولى ، والمعروفة أيضا باسم طريقة حقن IP الكلاسيكية كما وصفها Kinkel et al.4 ، تم إدخال الإبرة بزاوية 45 درجة إلى خط الوسط بين زعانف الحوض مع توجيه البطن لأعلى. في الطريقة الثانية ، أو طريقة حقن IP البديلة كما وصفها Ma et al.10 ، تم إدخال الإبرة من خلال الجانب الظهري للأسماك (الشكل 2A (i ، ii)). على النقيض من ذلك، تحتوي الطريقة الثالثة على تغييرين رئيسيين. أولا ، يتم تغيير موضع الحقن ، مع توجيه البطن لأعلى وتوجيه الإبرة من نقطة منتصف الزعنفة الصدرية نحو البطن. يسترشد موقع الاختراق بثقب طبيعي في هذه المنطقة. ثانيا ، يتم تقليل زاوية الإبرة ، والتي يجب أن تكون قريبة من 0 درجة (الشكل 2A (iii) ، الشكل 1).

مقارنة بين ثلاث طرق حقن داخل الصفاق
لمقارنة طرق حقن IP الثلاثة ، يتم تقديم البيانات التي تم الحصول عليها من الباحث الأول ، الذي لم يكن لديه خبرة سابقة مع الزرد. وعندما استخدمت الطريقتان الأولى والثانية لحقن الملكية الفكرية، لوحظ نفوق كبير للأسماك في الأسبوعين الأولين التاليين لحقن الملكية الفكرية. في الطريقة الأولى ، لوحظت الوفاة بعد ثلاثة أيام من الحقن ، بينما في الطريقة الثانية ، حدثت بعد يومين من الحقن. أظهر 70٪ من الأسماك المحقونة تلفا مرئيا في الجسم ، خاصة حول موقع الحقن ، مما يظهر في انخفاض حجم الجسم بشكل كبير وشكل الجسم المنحني بعد شهر إلى شهرين من حقن IP (الشكل 2A (iv ، v)). تم التفكير في أن الوفيات والأضرار الملحوظة يمكن أن تعزى إلى سمية دوكسوروبيسين12 ، والتي قد تتسرب من الطرف المفتوح لإبرة الحقن أثناء عملية الحقن ، مما يؤدي إلى إتلاف العضو الداخلي على طول مسار الحقن. في الطريقة الأولى ، يمكن أن يلمس طرف إبرة الحقن القناة الهضمية (الشكل 2A (i)) ، بينما في الطريقة الثانية ، يمكن أن يلمس مثانة السباحة (الشكل 2A (ii)). تم افتراض أنه يمكن للمرء منع طرف الإبرة من لمس أي عضو داخلي باستخدام الطريقة الثالثة (الشكل 2A (iii)). في الواقع ، لوحظ تحسن كبير في معدل البقاء على قيد الحياة ، حيث بقيت 80٪ من الأسماك على قيد الحياة في شهر واحد بعد الحقن (الشكل 2 ب). وهذا يدل على تحسن ملحوظ مقارنة بمعدلات البقاء على قيد الحياة للطريقتين الأولى والثانية ، والتي كانت 53.33 ٪ و 33.33 ٪ ، على التوالي. الأهم من ذلك ، أن 80٪ من الأسماك الناجية أظهرت شكل جسم طبيعي ، على عكس تلك الناتجة عن الطريقتين الأولى والثانية (الشكل 2A (vi)). للتحقق من صحة التوليد الناجح لنموذج مدينة دبي للإنترنت ، تم تقييم وظيفة القلب عن طريق قياس نسبة الكسر القذفي (EF٪). في الواقع ، لوحظ انخفاض كبير في EF٪ في 56 يوما بعد الحقن في المجموعة باستخدام الطريقة الثالثة (الشكل 2C).

استنساخ الطريقة الثالثة من قبل باحثين مختلفين
لإثبات أن الطريقة الثالثة يمكن إتقانها بسهولة من قبل باحثين مختلفين ، تم تجنيد 3 باحثين للدراسة لم يعملوا مع الزرد من قبل. عند محاولاتهم العديدة الأولى مع الطريقة الثالثة ، تمكن جميع الباحثين من تحقيق معدلات بقاء 85.71٪ و 95٪ و 83.33٪ بعد 56 يوما من الحقن وانخفاض ملحوظ في EF (الشكل 3A ، B). من الجدير بالذكر أن ثلاثة باحثين كرروا تجربتهم 3 مرات و 3 مرات و 2 مرات على التوالي ، وحصلوا باستمرار على نتائج ناجحة. أكدت هذه البيانات قابلية تكرار الطريقة الثالثة ، مما سمح للباحثين الذين ليس لديهم خبرة سابقة في العمل مع الأسماك بتوليد نماذج موثوقة للإنترنت DIC.

في إحدى المحاولات الأولية باستخدام الطريقة الثالثة ، اختبر الباحث الثاني انحراف الطريقة الثالثة: بدلا من 0 درجة ، تم استخدام زاوية 45 درجة أثناء اختراق الإبرة عبر الجلد (الشكل 2A (iii) ، سهم متقطع). نجا 15٪ فقط من الأسماك بعد شهرين من الحقن (الشكل 3 أ) ، مع ظهور 80٪ من الأسماك الناجية أضرارا كبيرة في الجسم. أشارت البيانات إلى أن زاوية الاختراق هي خطوة حاسمة لنجاح الطريقة الثالثة.

الطريقة الثالثة تمكن من إنشاء نموذج DIC المزمن
تم افتراض أن انخفاض تلف الجسم بشكل كبير قد يمكن من حقن IP متعددة في نفس الأسماك ، مما يحاكي نموذج DIC المزمن في الفئران13،14. ومن ثم ، تم استخدام الطريقة الثالثة للقيام بسلسلة من الحقن لمدة 4 أسابيع متتالية ، مع 5 ميكروغرام / غرام دوكس في الأسبوع (الشكل 4 أ). في هذه التجربة ، نجا 100٪ من الأسماك المحقونة ، ولم يظهر 80٪ منها أي علامات على تلف الجسم. الأهم من ذلك ، لوحظ انخفاض كبير في جزء القذف عند 56 نقطة في البوصة ، مما يشير إلى التوليد الناجح لنموذج DIC المزمن في أسماك الزرد البالغة (الشكل 4B).

الشكل 1: موقع وزاوية إدخال الإبرة لطريقة حقن IP الجديدة. أ: موقع إدخال الإبرة. السمكة مقلوبة رأسا على عقب ، وفضح الجانب البطني. الرأس إلى اليمين. يوجد ثقب طبيعي بين الزعانف الصدرية يجعل اختراق الجلد أبسط. ب: زاوية إدخال العبرة. يقترب من الصفر درجة على سطح السمكة. ج: مسار الإبرة تحت الجلد. تتم مراقبة طرف الإبرة باستمرار مرة واحدة داخل تجويف البطن. تبدو نقطة الدخول مختلفة عن الشكل 1 أ بسبب تشوه الجلد أثناء عملية الاختراق. د: سمكة بعد إطلاق دوكس. يصبح تجويف البطن أحمر بعد إطلاق Dox. (ه) سمكة بعد حقن IP. لا توجد علامة على تسرب بعد سحب الإبرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مقارنة بين ثلاث طرق لحقن IP في أسماك الزرد البالغة. (أ) مخططات لثلاث طرق لحقن الملكية الفكرية. (الأول إلى الثالث) تظهر مخططات لحقن IP الكلاسيكي (الطريقة الأولى) ، وحقن IP البديل (الطريقة الثانية) ، والطريقة الجديدة (الطريقة الثالثة). تشير الأسهم إلى مواقع الاختراق وزاوية الإبرة لثلاث طرق للحقن. سهم متقطع ، زاوية غير ناجحة لاختراق الإبرة. شريط المقياس: 5 مم (iv-vi) انخفاض حجم الجسم وشكل الجسم المنحني في طرازات مدينة دبي للإنترنت. تظهر الأسماك التمثيلية من أسماك مدينة دبي للإنترنت عند 56 نقطة في البوصة. (ب) مقارنة منحنيات البقاء على قيد الحياة بين ثلاث طرق لحقن IP. تم تسجيل عدد الأسماك التي نجت أسبوعيا. (بدأت التجربة بإجمالي n = 15). (ج) تقييم وظائف القلب للأسماك عند 56 نقطة في البوصة بعد إجهاد دوكس. n = 6 أسماك في المجموعة الضابطة 1x HBSS ، وبدأت التجربة بإجمالي n = 15 سمكة في كل 3 دفعات تم حقنها باستخدام Dox. يتم عرض القيم كمتوسط ± الخطأ القياسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تمكن الطريقة الثالثة من إنشاء نموذج DIC لسمك الزرد باستمرار في أيدي 3 محققين مختلفين. (أ) منحنيات بقاء أسماك مدينة دبي للإنترنت باستخدام الطريقة الثالثة من قبل ثلاثة باحثين مختلفين. لوحظ ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة في جميع المحققين الثلاثة. يتم تسجيل أعداد الأسماك الحية أسبوعيا. لوحظ انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة للباحث الثاني عند استخدام طريقة غير ناجحة III (زاوية اختراق إبرة 45 درجة ، كما هو موضح بسهم متقطع في الشكل 2A). (ب) تقييم وظائف القلب لأسماك مدينة دبي للإنترنت باستخدام الطريقة الثالثة من قبل ثلاثة باحثين مختلفين. في المجموع ، استخدم الباحث الثاني ، لزاوية اختراق إبرة 45 درجة ، 3 دفعات (9 ، 12 ، 14) من الأسماك لحقن Dox. بالنسبة لزاوية اختراق الإبرة 0 درجة n = تم استخدام 6 أسماك في 1x HBSS كمجموعة تحكم مشتركة. بدأت التجربة بإجمالي n = 85 سمكة مع RII (9 ، 12 ، 14) ، RIII (8 ، 6 ، 6) ، و RIV (12 ، 18) المستخدمة في كل دفعة من الدفعات الثماني التي تم حقنها مع Dox من قبل ثلاثة باحثين (II ، III ، IV) ، على التوالي. يتم عرض القيم كمتوسط ± الخطأ القياسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الطريقة الثالثة تمكن من حقن متعددة من Dox في الزرد البالغ ، تلخص نماذج DIC المزمنة في القوارض. (أ) مخططات نموذج الحقن المتعدد. تم حقن 5 ميكروغرام / غرام دوكس (5 ميكرولتر) في أربعة أسابيع متتالية. (B) يظهر نموذج DIC المزمن انخفاض EF٪ عند 56 نقطة في البوصة. يتم عرض القيم كمتوسط ± الخطأ القياسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اي.