تم وصف طريقة حقن جديدة داخل الصفاق (IP) في الزرد البالغ. عند التعامل مع المركبات السامة مثل دوكسوروبيسين ، يكون هذا الإجراء أكثر فعالية من طريقتي IP المبلغ عنهما سابقا. تم تصميم هذه التقنية ليتم اعتمادها بسهولة من قبل الباحثين ذوي الخبرة المحدودة في نموذج الزرد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقنية الحقن داخل الصفاق في أسماك الزرد البالغة التي تقلل من تلف الجسم والوفيات المرتبطة به
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم استخدام سمك الزرد البالغ (Danio rerio) ، والذي يمكن الوصول إليه وراثيا ، كنموذج فقاري قيم لدراسة الاضطرابات البشرية مثل اعتلال عضلة القلب. يعد الحقن داخل الصفاق (IP) طريقة مهمة توصل المركبات إلى الجسم إما لاختبار التأثيرات العلاجية أو توليد نماذج مرضية مثل اعتلال عضلة القلب الناجم عن دوكسوروبيسين (DIC). حاليا ، هناك طريقتان لحقن IP. كلتا الطريقتين لهما قيود عند التعامل مع المركبات السامة مثل دوكسوروبيسين ، مما يؤدي إلى آثار جانبية تظهر كأضرار جسيمة لشكل الجسم وموت الأسماك. في حين أنه يمكن التغلب على أوجه القصور هذه من خلال تدريب المحقق المكثف ، فإن طريقة حقن IP الجديدة التي لها الحد الأدنى من الآثار الجانبية أمر مرغوب فيه. هنا ، تم الإبلاغ عن طريقة حقن IP فريدة قادرة على التعامل مع المركبات السامة. يمكن أن يؤدي انخفاض وظائف القلب باستمرار دون تكبد نفوق كبير للأسماك. يمكن إتقان هذه التقنية بسهولة من قبل الباحثين الذين لديهم خبرة قليلة مع الزرد البالغ.
المقدمة
اكتسب الزرد (Danio rerio) الاهتمام كنموذج تجريبي لدراسة الأمراض البشرية لأن هذا يشمل تماثل الجينات والأعضاء العالي للبشر ، والتخصيب الخارجي ، وسهولة التلاعب الجيني ، وشفافية الجسم حتى النضج المبكر ، مما يسهل عددا لا يحصى من تطبيقات التصوير1. على عكس العملية المباشرة لتوصيل الأدوية مباشرة إلى الماء لأجنة الزرد واليرقات ، فإن إعطاء الأدوية لأسماك الزرد البالغة يمثل مسعى أكثر تعقيدا وتحديا2.
في الأسماك البالغة ، يمكن توصيل المركبات من خلال تقنيات توصيل الدواء السلبية ، مثل الإعطاء المباشر في الماء ، أو من خلال طرق توصيل الدواء عن طريق الفم مثل gavaging2. تشمل الأساليب الأخرى طلاء أغذية الأسماك بالمركبات ثم تغذية الأسماكلاحقا 3 ، والإدارة المباشرة للأدوية غير القابلة للذوبان في الماء بتركيز محدد مسبقا ، بما في ذلك الحقن خلف الحجاج أو داخل الصفاق 4,5. يفضل الإعطاء داخل الصفاق للدراسات في الجسم الحي لنماذج المرض بسبب مزاياه الدوائية المميزة6. توفر هذه الطريقة تركيزا عاليا للدواء ونصف عمر ممتد داخل التجويف البريتوني ، مما يوفر طريقا فعالا لتوصيل الدواء 7,8. يشيع استخدام هذا النهج في إعدادات البحث لضمان امتصاص الدواء وتوزيعه على النحو الأمثل 9. في حين أن الطرق القائمة على الحقن تثبت فعاليتها في الولادة الفردية ، فإن الحقن المطول والمتكرر غالبا ما يؤدي إلى تلف الجسم والعدوى المزمنة2.
حاليا ، هناك طريقتان لحقن IP في زربافيش البالغين4،10. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين لهما قيود عند توصيل المركبات السامة مثل دوكسوروبيسين ، مما يؤدي إلى أضرار جسيمة لشكل الجسم ونفوق الأسماك. الآثار الجانبية يمكن أن تعقد بشكل كبير تفسير البيانات. على الرغم من أنه يمكن معالجة هذه التحديات من خلال التدريب المكثف10 ، إلا أن هناك حاجة واضحة لطريقة حقن IP جديدة تقلل من الآثار الجانبية.
هنا ، هدفنا هو تطوير طريقة جديدة لحقن IP محسنة للتوصيل الفعال للدوكسوروبيسين إلى الزرد البالغ ، مما يسهل توليد نماذج موثوقة لاعتلال عضلة القلب الناجم عن دوكسوروبيسين (DIC) مع تقليل تلف الجسم والوفيات المرتبطة به.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تم إجراؤها من قبل لجنة Mayo Clinic المؤسسية لرعاية واستخدامها، مع الالتزام بالمعايير الموضحة في "دليل رعاية واستخدام المختبر" (مطبعة الأكاديميات الوطنية، 2011). تنتمي جميع أسماك الزرد في الدراسة إلى سلالة النمط النووي الهندي البري (WIK). يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.
1. إعداد وتخزين محلول مخزون دوكسوروبيسين
- الحصول على مخزون دوكسوروبيسين من مصدر تجاري.
ملاحظة: دوكسوروبيسين حساس للضوء ، لذا احصل عليه في شكل مسحوق وقم بتخزينه في حاويات غير شفافة لحمايته من التعرض للضوء. نفذ جميع خطوات تحضير مسحوق Dox داخل غطاء كيميائي. - قم بإذابة مسحوق Dox تماما في الماء المقطر وقم بإعداد محلول مرق بتركيز نهائي قدره 5 مجم / مل.
- قسمة المخزون بتقسيمه إلى أنابيب سعة 1.5 مل.
- لف الأنابيب بورق الألمنيوم لحمايتها من التعرض للضوء.
- قم بتخزين محلول القسمة Dox عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل (<1 شهر) ، أو -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل10.
2. تجميع الأسماك حسب وزن الجسم
- قم بتجميع الأسماك بفارق وزن بني أقل من 10٪ معا للحقن اللاحق.
ملاحظة: لتوفير الجهد في هذه المرحلة، يتم تصنيف الأسماك ذات التباين الأقل من 10٪ من وزن الجسم على أنها بنفس الحجم. - اترك السمك يصوم لمدة 24 ساعة قبل الحقن.
- تخدير الأسماك باستخدام ماء الجنين الذي يحتوي على 0.16 ملغم / مل تريكايين لمدة 1 دقيقة.
- أخرج السمك من الماء باستخدام التريكايين وربت على جانبي جسم السمكة بورق ترشيح نظيف لإزالة الماء الزائد.
- قم بقياس وتسجيل وزن الجسم لكل سمكة ، ثم أعد الأسماك على الفور إلى خزان استرداد مملوء بمياه النظام العذبة.
ملاحظة: تم إجراء حقن Dox على الأسماك بعد بلوغ 3 أشهر من العمر. في هذه الدراسة ، استخدم الباحثون أسماكا عمرها من 3 أشهر إلى 10 أشهر. قد تختلف BWs من سلالة الزرد WIK الناضجة من 0.2 جم إلى 0.5 جم. أدى التخدير المطول لأكثر من 5 دقائق ، يليه حقن Dox ، إلى ارتفاع معدل نفوق الأسماك.
3. إعداد الإبرة والمحطة للحقن
- حدد حجم حقن محلول مخزون Dox (على سبيل المثال ، 5 مجم / مل) اللازم لكل سمكة بناء على متوسط وزن الجسم لتحقيق الجرعة المستهدفة البالغة 20 ميكروغرام / جم.
- استخدم الصيغة التالية لحساب حجم الحقن:
- أضف 1x محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) لتخفيف محلول Dox المحسوب في الخطوة 1 للحقن ، ليصل حجمه الإجمالي إلى 5 ميكرولتر.
ملاحظة: استخدم محلول السائبة لكل مجموعة من الأسماك بناء على الأسلحة البيولوجية الخاصة بها وقم بتضمين 3 أسماك إضافية في كل مجموعة لضمان عدم وجود نقص في محلول الحقن أثناء التجربة. - اضغط برفق على الأنبوب ثم استخدم جهاز الطرد المركزي الدقيق لفترة وجيزة بأقصى سرعة لجمع المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثوان.
- ضع المحلول المحضر على الجليد واحميه من التعرض للضوء.
- ضع طبق بتري نظيفا مقاس 100 مم باستخدام إسفنجة أسفل مجهر تشريح ، ثم اضبط التركيز.
ملاحظة: تحتوي الإسفنجة على أخدود بطول 4 سم. سيوفر التراجع المرن للإسفنجة الدعم للأسماك ويحافظ على جسم السمكة في موضعه. يمكن إعادة استخدام الإسفنجة. - جهز حقنة صغيرة سعة 10 ميكرولتر بإبرة مشطوفة 34 جرام.
- اغسل الإبرة بمحلول 1x HBSS للتخلص من أي فقاعات وإزالة الانسدادات المحتملة من المحقنة.
- قياس 5 ميكرولتر من الحل أعدت في الخطوة 4 للحقن.
4. إجراء حقن IP Dox
- ضع الأسماك البالغة في الماء مع 0.16 ملغ / مل تريكايين لمدة 1 دقيقة للحث على حالة من فقدان الوعي.
- ضع السمكة في أخدود الإسفنجة المدمجة بحيث يكون البطن متجها لأعلى (الشكل 1 أ).
- أدخل الإبرة بزاوية قريبة من 0 درجة ، بدءا من نقطة منتصف الزعنفة الصدرية باتجاه الجانب الخلفي من تجويف القلب (الشكل 1 ب).
ملاحظة: تجنب أي اتصال مع القلب أثناء العملية. - وجه الإبرة نحو الذيل واذهب تحت الجلد الفضي.
ملاحظة: ضع الإبرة على مقربة من الجلد الفضي ، مع الحرص على تجنب أي خدش أو ثقب. - راقب طرف الإبرة داخل تجويف البطن طوال العملية بأكملها (الشكل 1C).
ملاحظة: تجنب إتلاف الكبد والأمعاء والمثانة والأعضاء الأخرى. تأكد من أن الإبرة تصل إلى نهاية الأمعاء ، بالقرب من الثقبة المشقوقة. - قم بتوزيع محلول Dox سعة 5 ميكرولتر تدريجيا وبشكل متساو ، ثم اسحب الإبرة ببطء على طول المسار الأصلي لمنع أي تسرب (الشكل 1 د).
- راقب تجويف البطن بحثا عن وجود Dox من خلال ملاحظة اللون الأحمر لمحلول Dox (الشكل 1E).
- انقل الأسماك المحقونة بسرعة إلى حوض عبور نظيف مملوء بمياه النظام العذبة لمساعدة الأسماك على التعافي.
ملاحظة: بين الحقن ، اغسل الإبرة مرة واحدة باستخدام 1x HBSS buffer.
5. إدارة الأسماك بعد الحقن
- أعد السمكة إلى النظام مع الدوران بعد الحقن.
- قم بصيام جميع الأسماك المحقونة لمدة 24 ساعة إضافية لتسهيل شفائها.
- خلال الأسبوع الأول ، راقب الأسماك عن كثب. قم بإزالة الأسماك الميتة في أسرع وقت ممكن لتجنب إصابة الأسماك الأخرى.
ملاحظة: من المحتمل أن تكون وفيات الأسماك خلال ال 24 ساعة الأولى ناتجة عن إصابات جسدية من الحقن أو التخدير المطول. سجل أعداد الأسماك لتوليد منحنى البقاء على قيد الحياة. - إجراء تخطيط صدى القلب للنمط الظاهري للأسماك المحقونة بالدوكس في 56 يوما بعد الحقن11.
ملاحظة: ضمان التوحيد في الظروف والإجراءات لمجموعة التحكم المقابلة المحقونة بمحلول HBSS.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في السابق ، تم استخدام طريقتين داخل الصفاق (IP) لإدارة دوكسوروبيسين في الزرد البالغ4،10. في الطريقة الأولى ، والمعروفة أيضا باسم طريقة حقن IP الكلاسيكية كما وصفها Kinkel et al.4 ، تم إدخال الإبرة بزاوية 45 درجة إلى خط الوسط بين زعانف الحوض مع توجيه البطن لأعلى. في الطريقة الثانية ، أو طريقة حقن IP البديلة كما وصفها Ma et al.10 ، تم إدخال الإبرة من خلال الجانب الظهري للأسماك (الشكل 2A
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تختلف طريقة حقن IP الجديدة عن طريقتي حقن IP الحاليتين 4,10 ، وتتميز بالميزات المميزة التالية. أولا ، يتم استخدام زاوية اختراق إبرة فريدة (قريبة من الصفر) ؛ ثانيا ، تخترق الإبرة الأسماك عبر موقع فريد ، أي ثقب طبيعي على السطح البطني للسمكة ، مما يسهل الحقن ؛ وأخيرا، تكون حركة الإبرة من الأمام إلى الخلف. تقلل هذه التعديلات بشكل فعال من إصابة الأعضاء ، والتي تنتج عن تقليل تسرب Dox أثناء عملية الاختراق. يقع مسار الإبرة تحت الجلد الفضي مباشرة ، والذي يمكن مراق...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (HL107304 و HL081753) ومؤسسة مايو (مركز الاكتشافات الطبية الحيوية ومركز أبحاث القلب والأوعية الدموية) إلى X.X. J.L. بتمويل من صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية بجامعة سنترال ساوث ، رقم 56021702. شكر خاص لبينيو جور وكوينتين ستيفنز لإدارة منشأة الزرد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 و مو ؛ ل NanoFil-حقنة | العالم الدقة الصكوك, المؤتمر الشامل | NANOFIL | أداة حقن |
| 34 غرام إبرة | العالم أدوات الدقة ، المؤتمر الوطني | للشركات NI34BV-2 | أداة injcetion |
| 60 مم طبق بتري | صياد علمي / FB0875713A فيشمارك | وضع الإسفنج | |
| تشريح المجهر | نيكون | SMZ800 | Injceting دوكس |
| دوكسوروبيكسين هيدروكلوريد | سيجما | D1515-10MG | المخدرات لإنشاء نموذج DIC |
| تخطيط صدى القلب | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | قياس وظيفة القلب |
| رغوة الإسفنج | Jaece Industries | L800-D | وضع السمك |
| محلول الملح المتوازن هانك (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | Vehicle for Dox |
| Microcentrifuge | Southernlabware | MyFuge / C1012 | جمع حل Dox ; |
| مقياس التوازن الدقيق | Torbal | AD60 | موازين رقمية |
| Tricaine | Argent | MS-222 | التخدير للأسماك |
| Eppendorf | 1.5 مل | تخزين ؛ | |
| برنامج VEVO LAB&NBSP; | فوجي فيلم بصري سونيكس | 5.6.0 | القياس الكمي للقلب |
المراجع
- Tavares, B., Lopes, S. S. The importance of Zebrafish in biomedical research. Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).
- Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies. Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).
- Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio). Lab Animal Sci Prof. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:85611302 32-35 (2014).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126(2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
- Liu, J., et al. Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells. Front Immunol. 13, 853894(2022).
- De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent. The Scientific World Journal. 2013, 720858(2013).
- Dakwar, G. R., et al. Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible. Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).
- Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish. J Vis Exp. (136), e57567(2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Christidi, E., Brunham, L. R. Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Cell Death Dis. 12 (4), 339(2021).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician. Frontiers Pharmacol. 12, 670479(2021).
- Chaoul, V., et al. Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease. Int J Mol Sci. 24 (19), 14898(2023).
- Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models. Biomed Pharmacother. 137, 111375(2021).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
