غالبا ما كافحت فحوصات انحلال الخثرة في المختبر لتكرار الظروف داخل الجسم الحي سواء في نموذج الجلطة الذي يتم هضمه أو في البيئة التي يحدث فيها انحلال الخثرة. هنا ، نستكشف كيفية استخدام اقتران حلقة تشاندلر ومقايسة انحلال الفيبرين المتدفق الفلورومتري في الوقت الفعلي (RT-FluFF) لمراقبة تحلل الجلطة عالية الدقة ، خارج الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تتبع انحلال الفيبرين لجلطات الدم الكاملة المكونة من حلقة تشاندلر تحت تدفق القص في نموذج انحلال الخثرة في المختبر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الجلطات الدموية والمضاعفات ذات الصلة هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم ، وقد تم تطوير فحوصات مختلفة لاختبار كفاءة الأدوية الانحلالية للتخثر في كل من المختبر والجسم الحي. هناك طلب متزايد على نماذج الجلطات في المختبر ذات الصلة الفسيولوجية لتطوير الأدوية بسبب التعقيد والتكلفة المرتبطة بالنماذج الحيوانية بالإضافة إلى افتقارها في كثير من الأحيان إلى قابلية الترجمة إلى فسيولوجيا الإنسان. يعد التدفق والضغط ومعدل القص من الخصائص المهمة للجهاز الدوري ، حيث تظهر الجلطات التي تتشكل تحت التدفق خصائص مورفولوجية وهضمية مختلفة عن الجلطات المتكونة بشكل ثابت. غالبا ما تكون هذه العوامل غير ممثلة في فحوصات هضم الجلطات التقليدية في المختبر ، والتي يمكن أن يكون لها آثار دوائية تؤثر على معدلات نجاح ترجمة الأدوية.
تم تطوير اختبار انحلالالخثرة Real-T ime Flu Flumetric Flowing F(RT-FluFF) كمنصة اختبار انحلال الخثرة عالية الدقة تستخدم جلطات موسومة بالفلورسنت تتشكل تحت تدفق القص ، والتي يتم هضمها بعد ذلك باستخدام البلازما المنتشرة في وجود أو عدم وجود عوامل صيدلانية محللة للفبرين. يسمح تعديل معدلات التدفق لكل من خطوات تكوين الجلطة وهضم الجلطة للنظام بتقليد الحالات الشريانية والرئوية والوريدية عبر إعدادات تجريبية متنوعة للغاية. يمكن إجراء القياسات بشكل مستمر باستخدام مقياس الفلور المضمن أو عن طريق أخذ نقاط زمنية منفصلة ، بالإضافة إلى قياس كتلة جلطة نقطة النهاية التقليدية. اختبار RT-FluFF هو نظام مرن يسمح بالتتبع في الوقت الفعلي لهضم الجلطة في ظل ظروف التدفق التي تمثل بدقة أكبر الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي مع الاحتفاظ بالتحكم في نظام الاختبار في المختبر وإمكانية استنساخه.
المقدمة
تمثل الأمراض الناجمة أساسا عن مسببات الانصمام الخثاري مصدرا رئيسيا للمراضة والوفيات في المجتمع الحالي. تشمل مظاهر التسبب في الانسداد الخثاري ، على سبيل المثال لا الحصر ، احتشاء عضلة القلب والسكتات الدماغية الإقفارية والجلطات الوريدية العميقة والصمات الرئوية1. يدور قدر هائل من الأبحاث الجارية ، التي تغطي تخصصات متعددة ، حول تطوير طرق آمنة وفعالة للتعامل مع تجلط الدم الممرض. أدت الاختلافات في المظاهر الشريانية والوريدية للتخثر والمواقع التشريحية المختلفة إلى تطوير مناهج علاجية مختلفة. ومع ذلك ، يعتمد العلاج الحاد عموما على استخدام انحلال الخثرة الدوائي عبر منشطات البلازمينوجين مع إمكانية استئصال الخثرة الميكانيكية في ظل ظروف سريرية معينة2.
يعتمد تطوير استراتيجيات العلاج الدوائي الجديدة بشكل أساسي على كل من النماذج الحيوانية في الجسم الحي ونماذج الهضم في المختبر للاختبارات قبل السريرية 3,4. تستفيد النماذج في الجسم الحي بشكل طبيعي من قدرتها على التقاط التفاعل المعقد لمختلف المعلمات الفسيولوجية على فعالية العلاج التي تشمل إزالة العوامل الصيدلانية وكذلك التفاعلات الخلوية مع الأدوية. ومع ذلك ، فإن هذا التعقيد نفسه غالبا ما يجعل مثل هذه النماذج مكلفة للغاية ويقدم مشكلات إضافية عند محاولة عزل الديناميات الدوائية / الحركية الأساسية في التي تختلف اختلافا كبيرا عن علم وظائف الأعضاء البشرية. ساعد تطوير النماذج في المختبر من خلال تسهيل إعداد الاختبار المقطر الذي يمكن فيه إجراء تطوير الأدوية وفحصها ولكنه غالبا ما يفتقر إلى الدقة اللازمة لتلخيص حالة المرض قيد الدراسة.
تعتمد البروتوكولات المختبرية الشائعة لاختبار التخثر الجديد على استخدام الجلطات التي تشكلت وتحلل في ظل ظروف ثابتة حيث تعمل كتلة الجلطة المتبقية كنقطة نهاية أولية 5,6. لسوء الحظ ، تفشل هذه التقنيات في حساب الجوانب الميكانيكية لتحلل الجلطة مثل التدفق المضطرب وانخفاض ضغط الخثرة التي يمكن أن تغير بشكل كبير الديناميكا الدوائية لأدوية الاختبار. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي الجلطات المتكونة في ظل ظروف ثابتة على بنية دقيقة تختلف عن الجلطات الفسيولوجية. وقد تبين أن وجود القص أثناء تكوين الجلطة يؤثر بشكل متكرر على خصائص الجلطة الناتجة مثل تنشيط الصفائح الدموية وتشابك الفيبرين. تظهر الجلطات التي يتم إنتاجها تحت تدفق القص عدم تجانس معقد من الطرف إلى الذيل الغائب في الجلطات المكونةبشكل ثابت 7,8. قد تؤثر مثل هذه الانحرافات عن بنية الجلطة الفسيولوجية على توصيف تطوير الدواء المهم الذي يتضمن تغلغل الدواء داخل الجلطة وكفاءة التحلل اللاحقة9.
لمعالجة بعض هذه القيود المرتبطة باستخدام نماذج التخثر / تحلل الجلطة الثابتة ، شهد اعتماد حلقة تشاندلر لكل من تكوين الجلطة وتحلل الجلطة في وجود القص عودة10. على الرغم من أن هذه الأنظمة تسمح بتمثيل أفضل لديناميكيات التدفق وتوليد جلطات ذات بنية أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية مقارنة بالمقايسات الثابتة نسبيا ، إلا أن ظروف التدفق المبسطة لا تزال تمثل انحرافا عن الظروف الفسيولوجية. وأخيرا، اتخذت أيضا نهج الموائع الدقيقة نظرا لسهولة تصويرها وأنماط تدفقها الموحدة؛ ومع ذلك ، فإنها تظل إزالة كبيرة من الظروف الفسيولوجية المتوقعة داخل الأوعية الكبيرة المتأثرة بشكل أساسي في معظم اضطرابات الانسداد الخثاري ذات الصلةسريريا 11,12.
مع وضع المناقشة أعلاه في الاعتبار ، قمنا بتطوير نموذج انحلال الخثرة عالي الدقة في المختبر لفحص الأدوية قبل السريرية. يهدف النموذج إلى معالجة بعض المزالق الحالية المفصلة أعلاه في مجال فحص العلاج بالتخثر الجديد وتم التحقق من صحته من أجل التكاثر والحساسية بتركيزات متفاوتة من منشط البلازمينوجين النسيجي (tPA). يوفر النظام الموصوف هنا تدفقات قص فسيولوجية باستخدام مضخة تمعجية ، ومثبط ضغط ، وخزان ساخن ، ومستشعرين للضغط ، ومقياس فلوري في الخط ، وتناظرية جلطة على شكل قص حلقة تشاندلر تسمى الفلورسنت لتسهيل التتبع في الوقت الفعلي لانحلال الفيبرين13. مجتمعة ، يطلق على النظام العام اسم مقايسة انحلال الفيبرين المتدفق الفلورومتري في الوقت الفعلي (RT-FluFF Assay)14 وستناقش هذه المخطوطة تعقيدات إعداد وتشغيل المقايسات بنجاح في نموذج انحلال الخثرة في المختبر عالي الدقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع الطرق المذكورة أدناه تتوافق مع بروتوكولات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) ولجنة أخلاقيات البحوث البشرية المؤسسية. قدم جميع المتطوعين الأصحاء موافقة خطية ومستنيرة قبل التبرع بالدم. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن العثور على جميع المواد المشار إليها في البروتوكول في جدول المواد. بينما تتم مناقشة WB البشري والبلازما في جميع أنحاء هذا البروتوكول ، يمكن شراء واستبدال استخدام دم البحث ومنتجات الدم المستنفدة للعوامل.
1. جمع الدم الكامل
- جمع الدم الكامل الوريدي (WB) من المتطوعين الأصحاء الموافقين باستخدام تقنيات الفصد القياسية.
تنبيه: تأكد من اتباع الاحتياطات العالمية لتقليل مخاطر ملامسة الدم أو المواد الأخرى التي يحتمل أن تكون معدية في جميع أنحاء هذا البروتوكول. من الضروري استخدام القفازات ومعطف المختبر ودرع الوجه. - جمع ~ 50 مل من البنك الدولي مباشرة في أنابيب سترات الصوديوم 3.2 ٪ وتجمع على الفور في أنابيب 50 مل للاستخدام اللاحق.
ملاحظة: من الضروري التخلص من الأنبوب قبل جمع الدم في أنبوب السيترات بالإضافة إلى ضمان ملء الأنابيب بالحجم الموصى به من قبل الشركة المصنعة. سوف يلخص البنك الدولي الذي تم جمعه حديثا ديناميكيات التخثر للمضيف بشكل أفضل. يسمح بتخزين WB على المدى القصير في درجة حرارة الغرفة (≤4 ساعات قبل الاستخدام). لا يتم تخزين WB بين عشية وضحاها حيث ثبت أن هذا يؤثر على ديناميكيات التخثر عند فحصه عن طريق التصوير الإلستوجرافيالخثاري 15.
2. تشكيل الجلطة
- في 3 مل من الدم الكامل المقترن ، أضف الفلورسنت (فلوريسئين إيزوثيوسيانات [FITC]) الموسوم بالفيبرينوجين (FITC-Fg) إلى تركيز نهائي يبلغ 60 ميكروغرام / مل (نسبة 1:50 من الفيبرينوجين الموسوم بالفلورسنت إلى الفيبرينوجين غير المعدل بافتراض تركيز الفيبرينوجين داخل البلازما 3 مجم / مل).
ملاحظة: يمكن زيادة هذه النسبة إلى 1:10 مع الحد الأدنى من التأثير على مورفولوجيا الجلطة. 13,14 يمكن شراء أو توليد الفيبرينوجين الموسوم بالفلورسنت عن طريق تفاعل الفيبرينوجين مع أيزوسيانات الفلوريسئين (FITC). يجب أن يتم خلط الفيبرينوجين قبل ≤5 دقيقة من بدء التشغيل.- إذا كان الفيبرينوجين قد تم تسعيره وتجميده مسبقا ، فافحص FITC-Fg المذاب للتأكد من أن البلمرة لم تبدأ قبل الأوان مما يجعلها غير صالحة للاستعمال (تأكد من عدم وجود جسيمات أو ألياف في المحلول).
- قم بإعداد حلقة تشاندلر بأسطوانة قطرها 120 مم في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية (الشكل 1). تأكد من أن جهاز حلقة تشاندلر قادر على الدوران بمعدل دوران ثابت من 0-90 دورة في الدقيقة أثناء عملية تكوين الجلطة بأكملها.
ملاحظة: يمكن العثور على إعداد وتعديلات إضافية لحلقة تشاندلر في Zeng et al.16. - قطع الأنابيب (القطر الداخلي 5/32 "، القطر الخارجي 7/32") وتشكيل حلقات تتناسب بإحكام ولكن ليس بإحكام حول الأسطوانة. بالنسبة لحجم الأنبوب الموصى به الذي تمت مناقشته هنا ، قم بقطع أنبوب PCR قياسي سعة 200 ميكرولتر لاستخدامه كتركيب لتوصيل نهايات الأنبوب لتشكيل الحلقة المغلقة.
ملاحظة: يمكن استخدام أحجام أنابيب مختلفة لإنتاج جلطات مختلفة الحجم16. - بدء تخثر الدم عن طريق إضافة 200 مللي مول محلول كلوريد الكالسيوم بنسبة 1:17 محلول الكالسيوم إلى الدم الكامل. قم بتحميل الدم في الأنبوب (املأ ~ 50٪ من حجم الأنبوب) باستخدام حقنة سعة 3 مل. ضع الحلقة على الفور على أسطوانة حلقة تشاندلر التي تربط الأطراف وابدأ الدوران.
- تأكد من الخلط المناسب مع الانعكاس اللطيف قبل التحميل لتجنب أي مشاكل ناجمة عن ترسب مكونات WB.
- تأكد من إضافة كمية متساوية من الدم إلى كل أنبوب في كل جولة لأن هذا يمكن أن يؤثر على حجم الجلطة إذا لم يتم الاحتفاظ بها بشكل ثابت.
- نظرا لأن الفقاعات الموجودة داخل عمود الدم يمكن أن تؤثر أيضا على تخثر الدم ، فقم بإزالتها عن طريق تحريك الأنبوب برفق بطريقة تشبه "المنشار" لتسهيل هروب الفقاعات قبل تحميلها على الأسطوانة.
- قم بتدوير الأسطوانة المغمورة جزئيا في حمام مائي بمعدل دوران 40 دورة في الدقيقة لتحقيق معدل قص محسوب ~ 450 ثانية -1.
ملاحظة: راجع Zeng et al. للحصول على معلومات حول المقصات المحسوبة بناء على حجم الأنبوب وسرعة الدوران (20 إلى 60 دورة في الدقيقة)16. معدلات القص الوريدي والشرياني النموذجية هي 20-200 s-1 و 300-1000 s-1 ، على التوالي ، مع ~ 400-500 s-1 كونها ممثلة للشريان الرئوي. - اترك الجلطات تتشكل لمدة 40-60 دقيقة في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة لتقليل التبييض الضوئي للفيبرينوجين الموسوم بالفلورسنت.
- بعد الوصول إلى وقت التخثر المطلوب ، قم بإزالة الجلطات من الأنبوب واستخدمها على الفور. لضمان إزالة الجلطات برفق دون المساس بالهيكل ، اقلب الأنبوب برفق للسماح للجلطة بالانزلاق ببطء من الأنبوب إلى وعاء صغير.
ملاحظة: قد يؤثر تخزين الجلطات المتكونة في البلازما الحمضية أو PBS طوال الليل عند 4 درجات مئوية على التحليل اللاحق لهضم الجلطة في حلقة التدفق.
3. إعداد أداة RT-FluFF
- تأكد من توصيل جهاز حلقة التدفق كما هو موضح في الشكل 2 وأن جميع التوصيلات آمنة. باختصار ، يشتمل جهاز حلقة التدفق ، بترتيب اتجاه التدفق: مضخة > المثبط > مستشعر ضغط المدخل > الجلطة > مستشعر ضغط المخرج > مقياس الفلور > مضخة > الخزان الساخنة. ضبط اختيار سعة المضخة ومعدل التدفق التجريبي وقطر الأنبوب وطوله ودرجة الحرارة وحجم الخزان وحجم الجلطة / الهندسة لتناسب الاحتياجات التجريبية الفريدة لكل دراسة.
ملاحظة: في هذا المثال، تم استخدام نفس أنبوب القطر المستخدم في حلقة تشاندلر ل RT-FluFF. يمكن استخدام الأنبوب لعدة أشواط في نفس اليوم ولكن يجب مراقبته بحثا عن التدهور أو التسرب وتغييره / شطفه حسب الحاجة. يوصى بالشطف بالماء المقطر الدافئ بين الأشواط. اعتمادا على التصميم التجريبي ، قد يكون من الضروري استبدال الأنبوب بعد كل تشغيل. - بمجرد تأمين جميع الأنابيب ، قم بتشغيل جهاز مراقبة الضغط. تأكد من أن جهاز مراقبة الضغط يقرأ 0 مم زئبق لكل من مستشعرات المدخل والمخرج. إذا لم يحدث ذلك ، فافتح الصمامات للتأكد من أن مستشعرات الضغط مفتوحة للضغط الجوي وتصفير المستشعرات.
- قم بتشغيل كتلة التدفئة أو الحمام المائي المستخدم ومراقبة درجة الحرارة على مدار التجربة. حافظ على درجة الحرارة قريبة من 37 درجة مئوية لتقليد درجة حرارة جسم الإنسان الفسيولوجية.
- قم بتشغيل المضخة إلى معدل التدفق المطلوب للتحقق من وجود تسربات والتحقق من عمل مستشعرات الضغط.
ملاحظة: سيمثل معدل التدفق ~ 160 مل / دقيقة في حجم الأنبوب هذا معدل قص ~ 500 s-1. - قم بإيقاف تشغيل المضخة لتسهيل تحميل الجلطة.
4. تحميل الجلطة في حلقة التدفق
- إذا تم استخدام جلطة مصنوعة مسبقا تم تخزينها ، فتأكد من إحضار الجلطة إلى درجة حرارة الغرفة قبل تحميلها في نظام حلقة التدفق.
- يعد فقدان كتلة الجلطة مقياسا مهما لنقطة النهاية لمقايسات انحلال الخثرة. من أفضل الممارسات قياس كتلة الجلطة قبل تحميلها مباشرة في حلقة التدفق بدلا من الاعتماد على القياسات السابقة.
- يجب دائما إجراء قياسات كتلة الجلطة بنفس الطريقة في كل مرة لضمان الاتساق عبر العينات وعبر أيام الفحص حيث يمكن أن يؤثر المحتوى السائل داخل الجلطات وعليها بشكل كبير على كتلتها. أفضل ممارسة هي مسح الجلطات برفق على مناديل المختبر حتى تتوقف عن إطلاق كمية كبيرة من السائل على المنديل مع الحرص على عدم ضغط الجلطة طوال عملية القياس.
- اغمر الجلطة في البلازما (ذاتية المنشأ أو متطابقة النوع) ، أو أي حل طور متحرك آخر يستخدم في حلقة التدفق (مثل PBS أو الوسائط المحددة) في حاوية ضحلة مثل طبق الوزن. يجب أخذ حل الطور المتنقل مباشرة من خزان النظام سعة 50 مل للتحكم في الحجم الكلي للنظام. يجب ألا يكون هناك عامل اختبار للتخثر أو الأدوية أثناء مرحلة تحميل الجلطة. يوصى بأن يكون الحجم الإجمالي للمرحلة المتنقلة لتشغيل حلقة التدفق ≥50 مل ويجب أن يكون متسقا عبر جميع العينات.
- قم بإزالة القسم المركزي من أنبوب حلقة التدفق (بين مستشعرات المدخل والمخرج) وقم بتوصيل حقنة سعة 10 مل بأحد طرفي الأنبوب.
- باستخدام الطرف الحر للأنبوب ، ضعه في البلازما (أو الطور المتحرك) وتناول حجما صغيرا من المحلول لتجهيز الأنبوب. ثم ضع مدخل الأنبوب بالقرب من الجلطة وافحص الجلطة بعناية لتحديد الرأس (عادة ما يكون الطرف السميك قليلا من الجلطة) والذيل (الطرف المقابل للرأس). يجب وضع رأس الجلطة باتجاه مستشعر ضغط المدخل وبعيدا عن المخرج. ضع الأنبوب في نهاية "الذيل" للجلطة واستنشقه في الأنبوب باستخدام المحقنة.
ملاحظة: في الحالات التي لا يمكن فيها تحديد اتجاه رأس الجلطة / الذيل بصريا ، يمكن تعيين الاتجاه بشكل أفضل بناء على معرفة اتجاه الدوران من حلقة تشاندلر - يواجه رأس الجلطة في الاتجاه المعاكس لدوران الأسطوانة. - قم بتوصيل الأنبوب مرة أخرى بالجهاز الرئيسي بحيث تكون الجلطة أقرب إلى مستشعر ضغط المخرج (يجب أن يكون رأس الجلطة مواجها بعيدا عن مستشعر المخرج). قم بتأمين الجلطة في موضعها عن طريق ثقب الأنبوب ورأس الجلطة بإبرتين 30 جم في نمط "X". اترك هذه الإبر طوال مدة الجري.
ملاحظة: اعتمادا على إعدادات المخمد والمضخة ، قد تكون الإبر الإضافية ضرورية لضمان عدم تفتت الجلطة قبل الأوان. إذا لزم الأمر ، يمكن إضافة شاشة إلى الأنبوب في اتجاه مجرى الجلطة لمنع شظايا الجلطة من الدوران في النظام. بمجرد إنشاء عدد محدد من الإبر لتثبيت الجلطة ، حافظ على هذا متسقا عبر الظروف. - خذ ما تبقى من محلول الطور المتحرك وضعه في أنبوب سعة 50 مل كخزان.
- ضع الخزان في حمام مائي وضعه في أنبوب المدخل والمخرج (المخرج من مقياس الفلور ويدخل المدخل إلى رأس المضخة).
- تأكد من توصيل مقياس الفلور المستخدم ومراقبته. تحقق من أن القيمة الأولية مناسبة مقارنة بخط أساس نظام المرحلة المتنقلة فقط في بداية التجربة.
ملاحظة: في حالة عدم توفر مقياس فلوري مدمج ، يمكن إجراء أخذ عينات دورية تسلسلية للخزان على فترات زمنية محددة طوال فترة تحليل حلقة التدفق. يمكن قراءة الكسور المجمعة باستخدام صفيحة 96 بئرا فور الانتهاء من التجربة على أي مقياس طيف ضوئي متاح تجاريا. - أضف 500 ميكرولتر من 100000 نانوغرام / مل tPA مباشرة إلى حجم الخزان لتحقيق تركيز نهائي قدره 1000 نانوغرام / مل tPA في 50 مل. يعتمد الحجم والتركيز والدواء المحدد المضاف على التركيز المستهدف المطلوب المتداول وحجم خزان النظام.
- تحقق مما يلي قبل بدء تشغيل المضخة:
- جميع التقاطعات آمنة.
- الصمامان فوق مستشعرات الضغط في الوضع المغلق المناسب.
- تم استبدال أي بلازما متبقية (أو سائل) في الخزان.
- تمت إضافة التخثر إلى الخزان وخلطه بشكل صحيح.
- يقع أنبوب المدخل بالقرب من قاع الخزان (وهذا يضمن الحد الأدنى من الفقاعات).
- أنبوب المخرج آمن وعلى الارتفاع المناسب للضغط المطلوب (يعتمد على موقع الوعاء الذي يتم تصميمه).
- اتجاه دوران المضخة صحيح (ترتيب التدفق: مضخة > مثبط الجلطة > > مقياس الفلور > مضخة > الخزان).
- إذا تم ضبط عدد دورات المضخة في الدقيقة على مستوى عال جدا (>150 دورة في الدقيقة) ، فابدأ بسرعة أبطأ وقم بتكثيف لضمان أن التغير السريع في الضغط لا يؤدي إلى تفتيت الجلطة أو التسبب في تسرب الأنابيب.
- تأكد من أن النظام يسجل البيانات بشكل مناسب من مقياس الفلور و / أو يتم إعداد الإمدادات لأخذ عينات دورية من المرحلة المتنقلة لقراءة النقطة الزمنية بعد التجربة.
- قم بتشغيل المضخة واضبطها لتحقيق معدل التدفق الحجمي المطلوب البالغ 160 مل / دقيقة أو قم بزيادة معدل التدفق حتى يتم تحقيق الضغط المطلوب. سوف يملأ النظام بالسوائل والفقاعات. سترفع الفقاعات القراءات الفلورومترية بشكل مصطنع ، لذا راقب إزالة الفقاعات. بمجرد القيام بذلك ، أطفئ الأنوار وابدأ في الحصول على البيانات.
- اترك المضخة تعمل حتى تتحلل الجلطة بشكل كبير أو ينقضي الوقت التجريبي المطلوب (≥60 دقيقة). أضف الكواشف ، حسب الحاجة ، إلى النظام طوال التجربة عبر الخزان لإنشاء ظروف تجريبية فريدة لاختبار مجموعة متنوعة من الاختلافات التخثرية.
ملاحظة: يعتمد الوقت التجريبي على معدل تدفق المضخة (مستوى القص) وتركيز التخثر. - بمجرد اكتمال الفحص ، قلل من معدل التدفق الحجمي ، وقم بإزالة أنبوب المدخل بينما لا تزال المضخة تعمل لدفع معظم السائل في النظام إلى الخزان (ستبقى بعض المرحلة المتحركة في الأنبوب). افصل قسم الأنابيب المحتوية على جلطة في جانب مستشعر ضغط المخرج للأنبوب وقم بخفضه في قارب وزن.
- قم بإزالة الإبر التي تثبت الجلطة في مكانها لجمع السائل المتبقي من داخل النظام وشظايا الجلطة / الجلطة. استخدم حقنة للمساعدة في تنظيف النظام حسب الحاجة.
- وزن ومعالجة الجلطة المتبقية لتحليل إضافي مثل حساب النسبة المئوية للكتلة المفقودة أو للأنسجة.
5. تنظيف النظام
- بين العينات ، اشطف النظام بأكمله بالماء الدافئ عند دورة عالية في الدقيقة (>150 دورة في الدقيقة). قم بتحميل الماء في الخزان وقم بتشغيله عبر النظام لمدة 2 دقيقة على الأقل ، فارغا ، وقم بتشغيله مرة أخرى لشطف نظامين كاملين. بعد هذه الشطف ، إذا لم تعد قراءة مقياس الفلور إلى خط الأساس ، كرر عملية الشطف لدورة إضافية. إذا لم يعد بعد إلى خط الأساس ، فقم بتغيير الأنبوب تماما قبل فحص العينة التالية.
ملاحظة: أثناء التجارب ، يمكن إعادة استخدام الأنابيب بين العينات ؛ ومع ذلك ، نظرا للثقب بالإبر المستخدمة لتثبيت الجلطة في مكانها ، يجب استبدال قسم الأنبوب بين مستشعرات ضغط المدخل والمخرج بعد كل تشغيل. في ظل بعض الظروف التجريبية ، قد يكون من الضروري استبدال مجموعة الأنابيب بأكملها بعد كل اختبار تشغيل أو تجميع للقضاء على أي تلوث متبادل للعينة. - بعد تشغيل جميع العينات لتجربة ذلك اليوم ، قم بإزالة جميع الأنابيب وتجاهلها. افركي الوصلات على شكل حرف T بالماء الساخن وفرشاة ذات شعيرات حتى تنظف واتركيها حتى تجف واشطفي مخمدات المحاقن بالماء الساخن. استخدم 70٪ EtOH للمساعدة في العقم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تشكيل جلطة حلقة تشاندلر
عند تكوين الجلطات ، كنا نهدف بشكل عام إلى التكرار الرباعي لضمان وجود أي قيم متطرفة للجلطة (بناء على التشكل الإجمالي والكتلة) ، فلا يزال لدينا القدرة على تشغيل مقايسات انحلال الخثرة الثلاثي. بافتراض ظروف التحميل المثلى ، يجب أن تكون الجلطات موحدة تماما في الطول (~ 3.3 سم) والوزن (~ 100 مجم) والمظهر كما هو موضح في الشكل 3. عند استخدام FITC-Fg ، كنا نهدف أيضا إلى فحص الجلطات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لضمان تشتت موحد نسبيا للتألق بدلا من المناطق غير...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تشكيل الجلطة ووضع العلامات
لقد ثبت أن حلقة تشاندلر توفر وسيلة سهلة وفعالة لتوليد جلطات تحاكي الجلطات الدموية16 في الجسم الحي. تسمح معلمات الضبط الدقيق مثل حجم الأنبوب وسرعات الدوران وقطر الأسطوانة ووقت التخثر بالتوليد السريع للجلطات في ظل ظروف قص مختلفة يمكنها التقاط السمات المعمارية التي تم تقديرها في مجموعة من الجلطات الدموية التي تحاكي المصادر الشريانية والوريدية. المرونة الإضافية المتمثلة في القدرة على إدخال علامات مثل FITC-Fg توسع الاستخدامات المحتملة لهذه الجلطات...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01HL167877. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 30 G الإبر تحت الجلد التي يمكن التخلص منها | Exel International | 26439 | مستهلكات أخرى |
| 6 مم HSS مخرطة بار أداة مخزون 150 مم طويل | uxcell | B07SXGSQ82 | حلقة تشاندلر ، ؛ |
| 96-Well Clear مسطحة القاع UV-شفافة صفيحة ميكروبليت | Corning | 3635 | مستهلكات أخرى ، بوليمر أكريليك غير معالج ، غير معقم |
| Air-Tite Luer-lock غير معقم 60 مل محاقن | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF جهاز ، مخمدات |
| Arium Mini Plus نظام المياه عالي النقاء | Sartorius | NA | DI مصدر المياه |
| كلوريد الكالسيوم | Millipore Sigma | C5670 | مستهلكات أخرى |
| محولات ضغط الدم التي يمكن التخلص منها | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF |
| Devices Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | RT-FluFF Device |
| Drager Siemans Patient | Monitor Drager | SC 7000 | RT-FluFF |
| Device Drum (اسطوانة ، قطرها 120 مم ، عرض 85 مم) | حلقة تشاندلر ، | ||
| درع الوجه | Moxe | SHIELDS10 | حلقة تشاندلر ، ؛ |
| الفيبرينوجين من البلازما البشرية ، Alexa Fluor 488 Consurgate | Thermo Scientific | F13191 | المواد الاستهلاكية الأخرى |
| ، البولي كربونات ، محبس رباعي الاتجاهات ، قفل لور ذكر ، | جهاز Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF |
| Fluorescein (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | المواد الاستهلاكية الأخرى |
| للأغراض العامة حمام | مائي Thermo Scientific | 2839 | حلقة تشاندلر ، ؛ |
| Hotplate 4 & مرات 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF جهاز |
| مصدر بشري البلازما الطازجة المجمدة | Zen-Bio | SER-SPL | مستهلكات أخرى ، CPDA-1 مضاد للتخثر |
| الدم البشري الكامل ؛ | Zen-Bio | SER-WB-SDS | مستهلكات أخرى ، مضاد للتخثر CPDA-1 |
| رأس مضخة L / S Easy-Load II لأنابيب عالية الدقة ، مبيت PPS ، جهاز SS Rotor | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF ، رأس مضخة |
| رقمي متغير السرعة L / S مع إدخال / إخراج عن بعد ، من 6 إلى 600 دورة في الدقيقة ؛ 90 إلى 260 فولت تيار متردد | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF الجهاز ، |
| وحدة التحكم في سرعة محرك | المضخة CoCocina | ZK-MG | Chandler loop ، ؛ |
| Nalgene أنابيب T-نوع موصلات | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF جهاز |
| أنابيب المضخة التمعجية | ماسترفلكس | 06424-15 | مستهلكات أخرى |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات | Millipore Sigma | P3813 | مستهلكات أخرى ، مسحوق ، درجة الحموضة 7.4 ، لإعداد حلول 1 لتر |
| تبديل امدادات الطاقة | SoulBay | UC03U | Chandler loop ، ؛ |
| Thermo Scientific National Target جميع المحاقن البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة 10 مل | الحرارة العلمية | S751010 | الاستهلاكية الأخرى |
| منشط البلازمينوجين للأنسجة ، | Millipore Sigma | T0831 | الاستهلاكية الأخرى |
| معرف الأنابيب 1/4 '' ، OD 3/8 '' | فيشر Scientific | AGL00017 | مستهلكات أخرى ، مقطعة إلى أقسام 1.5 سم تستخدم لتوصيل الأنابيب بموصلات |
| من النوع Tمعرف الأنابيب 5/32", OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | مستهلكات أخرى |
| V3 365 نانومتر مصغرة - مصباح يدوي للأشعة فوق البنفسجية | بالضوء الأسود uvBeast | uvB-V3-365-MINI | حلقة تشاندلر ، تستخدم للتحقق من الجلطات المكتملة |
| ZGA37RG ZYTD520 محرك التيار المستمر ، 12 فولت ، 100 دورة في الدقيقة | Pangyoo | ZGA37RG | حلقة تشاندلر ، ؛ |
المراجع
- Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).
- Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke. Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Kaiser, E. E., West, F. D. Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology. Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).
- Elnager, A., et al. In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy. Adv Hematol. 2014, 814684(2014).
- Prasad, S., et al. Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs. Thromb J. 4, 14(2006).
- Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution. Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).
- Mutch, N. J., et al. Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis. J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).
- Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis. Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).
- Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows. Biomicrofluidics. 12 (4), 042201(2018).
- Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. Microfluidics in haemostasis: A review. Molecules. 25 (4), 833(2020).
- Zeng, Z., et al. Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis. J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).
- Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511(2023).
- Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets. Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).
- Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture. J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24(2023).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. J Biomech Eng. 136 (7), (2014).
- Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps. J Biomed Opt. 17 (9), (2012).
- Wu, J. H., Diamond, S. L. A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis. Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
